抗人程序性死亡配体-1（PD-L1）的抗体及其应用的制作方法

1 (pd-l1)结合的解离常数(kd)不大于2.1
×
10-9
m，与食蟹猴程序性死亡配体-1(pd-l1)结合的解离常数(kd)不大于1.2
×
10-9
m。
8.在一个优选实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段是嵌合的或人源化的或全人源的。
9.在一个优选实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段，包含人或鼠抗体igg1、igg2、igg3、igg4、iga、igm、ige或igd任何其中之一恒定区的序列；优选包含人或鼠抗体igg1、 igg2、igg3或igg4的恒定区的序列；或携带突变的人或鼠抗体igg1、igg2、igg3或igg4 的恒定区的序列。
10.在一个优选实施方案中，本发明所述抗原结合片段选自f(ab)2、fab’、fab、fv、scfv、双特异抗体、纳米抗体和抗体最小识别单位中的一种或多种。
11.在一个优选实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段可与选自编号156的抗体竞争性的结合pd-l1，并且具备以下特性：
12.1)特异性结合pd-l1重组蛋白及表达pd-l1的细胞；
13.2)阻断pd-l1与pd-1蛋白的结合；
14.3)抑制pd-1与细胞表面表达的pd-l1的结合；
15.4)增强t细胞活性；或/和
16.5)抑制肿瘤生长。
17.在一个优选实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段还偶联有治疗剂或示踪剂；优选地，所述治疗剂选自放射性同位素、化疗药或免疫调节剂，所述示踪剂选自放射学造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记、化学发光标记、超声造影剂或光敏剂。
18.在一个优选实施方案中，本发明还提供一种多特异性抗原结合分子；优选地，所述多特异性抗原结合分子包含第一抗原结合模块和第二抗原结合模块，所述第一抗原结合模块包含上述任一项所述的抗体或抗原结合片段，所述第二抗原结合模块特异性结合pd-l1以外的其他抗原或结合与第一抗原结合模块不同的pd-l1抗原表位；
19.优选地，所述其他抗原选自pd-1、tnfr2、ctla-4、lag-3、cd28、cd122、4-1bb、tim3、 ox-40、ox40l、cd40、cd40l、light、icos、icosl、gitr、gitrl、tigit、cd27、vista、 b7h3、b7h4、hevm、btla、cd47或cd73；
20.优选地，所述多特异性抗体为“双特异性”、“三特异性”或“四特异性”。
21.在一个优选实施方案中，本发明提供一种嵌合抗原受体(car)；优选地，所述嵌合抗原受体至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含上述任一项所述pd-l1抗体或抗原结合片段。
22.在一个优选实施方案中，本发明提供一种免疫效应细胞；优选地，所述免疫效应细胞包含上述所述嵌合抗原受体或包含上述所述嵌合抗原受体的核酸片段；
23.优选地，所述免疫效应细胞选自t细胞、nk细胞(natural killer cell)、nkt细胞(natural killer t cell)、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或肥大细胞；所述t细胞可选自炎性t细胞、细胞毒性t细胞、调节性t细胞(treg)或辅助性t细胞；
24.优选地，所述免疫效应细胞为同种异体免疫效应细胞或自体免疫细胞。
25.在一个优选实施方案中，本发明提供一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码本发明上述任一项所述的纳米抗体、抗原结合片段、或其任意组合，上述所述的多特异性抗原
结合分子或上述所述的嵌合抗原受体。
26.在一些实施方案中，本发明提供一种表达载体，其包含本发明上述所述分离的核酸分子。
27.在一些实施方案中，本发明提供一种宿主细胞，其包含本发明上述所述分离的核酸分子或表达载体。
28.在一个优选实施方案中，所述宿主细胞是真核细胞或原核细胞；更优选，所述宿主细胞来源于哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞、大肠杆菌和/或枯草杆菌；更优选，所述宿主细胞选自中国仓鼠卵巢细胞(cho)。
29.在一些实施方案中，本发明提供一种抗体或抗原结合片段或多特异性抗原结合分子的制备方法，在适当的条件下培养本发明上述所述的宿主细胞，并分离抗体或抗原结合片段或多特异性抗原结合分子。
30.在一些实施方案中，本发明提供一种免疫效应细胞的制备方法，将上述所述car的核酸片段导入所述免疫效应细胞，优选地，所述方法还包括启动所述免疫效应细胞表达上述所述的car。
31.在一些实施方案中，本发明提供一种药物组合物，组合物包含本发明上述所述的抗体或抗原结合片段、本发明上述所述的多特异性抗原结合分子、本发明上述所述的嵌合抗原受体、本发明上述所述的免疫效应细胞、本发明上述所述分离的核酸分子、本发明上述所述的表达载体、本发明上述所述的细胞，或本发明上述所述方法制备的产品(例如抗体和抗原结合片段)，以及药学上可接受的载体。
32.在一个优选实施方案中，所述药物组合物还包含药学上可接受的运载体(carrier)、稀释剂或助剂；更优选地，所述药物组合物还包含额外的抗肿瘤剂。
33.在一些实施方案中，本发明提供一种预防和/或治疗pd-l1表达异常和/或t细胞功能异常相关的疾病的方法，包含向有此需要的患者施用本发明上述所述的抗体或抗原结合片段、本发明上述所述的多特异性抗原结合分子、本发明上述所述的嵌合抗原受体、本发明上述所述的免疫效应细胞、本发明上述所述的分离的核酸分子、本发明上述所述的表达载体、本发明上述所述的细胞、本发明上述所述的方法制备的产品、或本发明上述所述的药物组合物；所述疾病优选肿瘤；
34.优选地，所述肿瘤选自淋巴瘤、白血病、黑色素瘤、神经胶质瘤、乳腺癌、肺癌、骨癌、卵巢癌、膀胱癌、肾癌、肝癌、睾丸癌、唾液腺癌、甲状腺癌、胸腺癌、上皮癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌、恶性血液病、头颈癌、胶质瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫体癌和骨肉瘤。
35.在一些实施方案中，本发明提供上述所述的抗体或抗原结合片段、本发明上述所述的多特异性抗原结合分子、本发明上述所述的嵌合抗原受体、本发明上述所述的免疫效应细胞、本发明上述所述的分离的核酸分子、本发明上述所述的表达载体、本发明上述所述的细胞、本发明上述所述的方法制备的产品(例如抗体和抗原结合片段)、或本发明上述所述药物组合物在在制备预防和/或治疗pd-l1表达异常和/或t细胞功能异常相关的疾病的药物中的用途，所述疾病优选肿瘤；
36.优选地，所述肿瘤选自淋巴瘤、白血病、黑色素瘤、神经胶质瘤、乳腺癌、肺癌、骨癌、卵巢癌、膀胱癌、肾癌、肝癌、睾丸癌、唾液腺癌、甲状腺癌、胸腺癌、上皮癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌、恶性血液病、头颈癌、胶质瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫体癌和骨肉瘤。
vh、cl和chl结构域组成的单价片段；(ii)f(ab)2片段，一种包含由二硫键在铰链区连接的两个fab片段的双价片段；(iii)由vh和chl结构域组成的fd片段；(iv)由抗体单臂的vl和vh结构域组成的fv片段；(v)包含vh和vl结构域的dab；(vi)由vh结构域组成的dab片段(ward等人，nature 341:544-546,1989)；(vii)由vh或vl结构域组成的dab；(viii)分离的互补决定区(cdr)；以及(ix)两个或更多个分离的cdr的组合，所述cdr可以任选地由合成接头连接。此外，虽然fv片段的两个结构域vl和vh是通过独立的基因编码的，但是这两个结构域可以使用重组方法通过接头接合，该接头能够使其制成其中vl和vh区配对以形成单价分子的单蛋白质链(称为单链fv(scfv)；参见例如，bird等人，science 242:423-426,1988以及huston等人，proc.natl.acad.sci.usa 85:5879-5883,1988)。这些抗体片段可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且这些片段被筛选用于与完整抗体相同的方式使用。可以通过重组dna技术、完整免疫球蛋白的酶促或化学裂解、或在一些实施方式中通过本领域已知的化学肽合成程序来产生抗原结合片段。
47.如本文所用，术语“pd-l1”是指程序性死亡配体-1，也称为cd279(分化簇279)，是一种重要的免疫抑制分子。所述pd-l1优选地是人pd-l1。
48.如本文所用，术语“抗-程序性死亡配体-1抗体”、“程序性死亡配体-1抗体”、“抗 pd-l1抗体”、“pd-l1抗体”、“抗-pd-l1抗体部分”和/或“抗-pd-l1抗体片段”等是指任何包含能够特异性结合pd-l1的免疫球蛋白分子的至少一部分(例如但不限于重链或轻链的至少一个互补决定区(cdr)或其配体结合部分、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、框架区或其任何部分)的含蛋白质或肽的分子。pd-l1抗体还包括抗体样蛋白支架(如第十纤连蛋白iii型结构域(10fn3))，其含有与抗体cdr在结构和溶剂可及性上相似的 bc、de和fg结构环。10fn3结构域的三级结构类似于igg重链可变区的三级结构，并且通过将10fn3的bc、de和fg环的残基用来自pd-l1单克隆抗体的cdr-h1、cdr-h2或 cdr-h3区的残基替换，本领域技术人员可以将例如pd-l1单克隆抗体的cdr接枝到纤连蛋白支架上。
49.如本文所用，术语“双特异性抗体”是指对至少两种不同的抗原具有单克隆结合特异性的抗体，其通常是人或人源化的抗体。在本发明中，结合特异性之一可以针对pd-l1的抗原表位而被检测，另一个可以针对pd-l1的另一个抗原表位或除pd-l1外的任何其他抗原，例如针对细胞表面蛋白、受体、受体亚基、组织特异性抗原、病毒来源蛋白、病毒编码的包膜蛋白、细菌来源蛋白或细菌表面蛋白等而被检测。
50.如本文所用，术语“嵌合”抗体是指以下抗体，其具有源自一种来源生物(如大鼠或小鼠)的免疫球蛋白的可变序列以及源自不同生物体(例如人)的免疫球蛋白的恒定区。用于生产嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见例如，morrison,1985,science 229(4719):1202-7； oi等人，1986,bio techniques 4:214-221；gillies等人，1985j immunol methods 125:191-202；以上通过援引加入并入本文。
51.如本文所用，术语“互补决定区”(cdr)指在轻链和重链可变结构域中均发现的高变区。可变结构域中更高保守性的部分称为框架区(fr)。如本领域所理解的，表示抗体的高变区的氨基酸位置可以根据上下文和本领域已知的各种定义而变化。可变结构域内的一些位置可以被视为杂合高变位置，因为这些位置可以被认为是在一组标准(如imgt或kabat) 下的高变区之内，而被认为在不同组的标准(如kabat或imgt)下的高变区之外。这些位置中的一个或更多个也可以在延伸的高变区中找到。本发明包括在这些杂合高变的位置中包含
修饰的抗体。天然重链和轻链的可变结构域各自包含主要采用片层构型的四个框架区，其通过三个cdr(cdr1、cdr2和cdr3)连接，这三个cdr形成连接片层结构的环，并且在一些情况下形成片层结构的一部分。每条链中的cdr通过fr区按顺序 fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4紧密保持在一起，并且与来自其他抗体链的cdr促成了抗体的抗原结合位点的形成(参见kabat等人，sequences of protein sofimmunological interest, national institute of health,bethesda,md.1987；其通过援引加入并入本文)。
52.如本文所用，术语“单克隆抗体”是指来源于单个克隆(包括任何真核、原核、或噬菌体克隆)的抗体，而不限于该抗体的产生方法。
53.如本文所用，术语“vh”是指抗体的免疫球蛋白重链(包括fv、scfv或fab的重链) 的可变区。术语“vl”是指免疫球蛋白轻链(包括fv、scfv、dsfv或fab的轻链)的可变区。
54.本文术语“重链恒定区”是指抗体重链的羧基端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，但是表现出效应子功能，诸如与fc受体的相互作用，其相对于抗体的可变结构域具有更保守的氨基酸序列。“重链恒定区”至少包含以下之一：ch1结构域，铰链区，ch2结构域，ch3 结构域，或其变体或片段。“重链恒定区”包括“全长重链恒定区”和“重链恒定区片段”，前者具有基本上与天然抗体恒定区基本相似的结构，而后者仅包括“全长重链恒定区的一部分”。示例性地，典型的“全长抗体重链恒定区”由ch1结构域-铰链区-ch2结构域-ch3 结构域组成；当抗体为ige时，其还包括ch4结构域；当抗体为重链抗体时，则其不包括 ch1结构域。示例性地，典型的“重链恒定区片段”可选自ch1、fc或ch3结构域。
55.本文术语“轻链恒定区”是指抗体轻链的羧基端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，所述轻链恒定区可选自恒定κ结构域或恒定λ结构域。
56.本文术语“fc”是指完整抗体经木瓜蛋白水解而成的抗体羧基端部分，典型地，其包含抗体的ch3和ch2结构域。fc区包括例如天然序列fc区、重组fc区和变体fc区。尽管免疫球蛋白重链的fc区的边界可以略微变化，但是人igg重链的fc区通常被定义为从cys226 位置的氨基酸残基或从pro230延伸至其羧基末端。fc区的c末端赖氨酸(根据eu编号系统的残基447)可以例如在抗体的产生或纯化过程中，或通过对编码抗体重链的核酸重组工程化而除去，因此，fc区可包括或不包括lys447。
57.本文术语“人源化抗体”是指，经基因工程改造的非人源抗体，其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源性。通常而言，人源化抗体的全部或部分cdr区来自于非人源抗体(供体抗体)，全部或部分的非cdr区(例如，可变区fr和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。人源化抗体通常保留或部分保留了供体抗体的预期性质，包括但不限于，抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力、增强免疫应答的能力等。
58.如本文所用，术语“百分比(％)序列一致性”是指在为达到最大百分比序列一致性而比对序列和引入空位(如果需要)(例如，为了最佳比对，可以在候选和参比序列中的一个或两个中引入空位，并且出于比较的目的，可以忽略非同源序列)之后，候选序列的氨基酸(或核苷酸)残基与参比序列的氨基酸(或核苷酸)残基相同的百分比。出于确定百分比序列一致性的目的，可以用本领域技术人员熟知的多种方式来实现比对，例如使用公众可得的计算机软件，如blast、align或megalign(dnastaii)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括需要在被比较序列的全长范围实现最大比对的任何算法。例如，用于与候选序列进行比较而比对的参比序列可以显示候选序列在候选序列的全长或候选序
列的连续氨基酸(或核苷酸)残基的选定部分上表现出从50％至100％的序列同一性。出于比较目的而比对的候选序列的长度可以是例如参比序列的长度的至少30％(例如30％、40％、50％、 60％、70％、80％、90％或100％)。当候选序列中的位置被与在参比序列中的相应位置相同的氨基酸(或核苷酸)残基占据时，则这些分子在那个位置是相同的。
59.本文术语“kabat编号系统”通常是指由elvin a.kabat提出的免疫球蛋白比对及编号系统(参见，例如kabat et al.,sequences of proteins of immunological interest,5th ed.public healthservice,national institutes of health,bethesda,md.,1991)。
60.如本文所用，术语“特异性结合”是指一种结合反应，其决定抗原在蛋白质和其他生物分子的一个异质性群体中的存在状况，所述蛋白质和其他生物分子例如被抗体或其抗原结合片段特异性识别。与抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段将以小于100nm的kd与抗原结合。例如，与抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段将以高达100nm((例如，1pm至 100nm之间)的kd与抗原结合。不显示与特定抗原或其表位特异性结合的抗体或其抗原结合片段将显示对该特定抗原或其表位的大于100nm(例如，大于500nm、1μm、100μμ、500μμ或1mm)的kd。可以使用多种免疫测定方式来选择与特定蛋白或碳水化合物进行特异性免疫反应的抗体。例如，常规地使用固相elisa免疫测定法来选择与蛋白质或碳水化合物进行特异性免疫反应的抗体。参见，harlow&lane，antibodies,alaboratory manual,cold springharbor press,newyork(1988)以及harlow&lane,using antibodies，a laboratory manual,coldspring harbor press,newyork(1999)，其描述了可以用于确定特异免疫反应性的免疫测定方式和条件。
61.如本文所用，术语“抗体缀合物”是指抗体分子直接或者通过连接接头与另一个分子化学键合而形成的偶联体/缀合物。例如抗体-药物缀合物(adc)，其中药物分子就是所述的另一个分子。
62.本文术语“嵌合抗原受体(car)”是指这样的重组蛋白，其包含至少(1)细胞外抗原结合结构域，例如抗体的可变重链或轻链，(2)锚定car进入免疫效应细胞的跨膜结构域，和(3) 胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，car的细胞外抗原结合结构域包含scfv。scfv 可以源自融合抗体的可变区。替代地或另外，scfv可以衍生自fab’s(而不是抗体，例如获自 fab文库)。在某些实施方式中，将scfv融合至跨膜结构域，然后融合至细胞内信号传导结构域。
63.本文术语“核酸”包括包含核苷酸的聚合物的任何化合物和/或物质。每个核苷酸由碱基，特别是嘌呤或嘧啶碱基(即胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)、腺嘌呤(a)、胸腺嘧啶(t)或尿嘧啶(u))、糖(即脱氧核糖或核糖)和磷酸基团组成。通常，核酸分子由碱基的序列描述，由此所述碱基代表核酸分子的一级结构(线性结构)。碱基的序列通常表示为5
′
至3
′
。在本文中，术语核酸分子涵盖脱氧核糖核酸(dna)，包括例如互补dna(cdna)和基因组dna、核糖核酸(rna)，特别是信使rna(mrna)、dna或rna的合成形式，以及包含两种或更多种这些分子的混合的聚合物。核酸分子可以是线性的或环状的。此外，术语核酸分子包括有义链和反义链二者，以及单链和双链形式。而且，本文所述的核酸分子可含有天然存在的或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的例子包括具有衍生的糖或磷酸骨架键合或化学修饰的残基的修饰的核苷酸碱基。核酸分子还涵盖dna和rna分子，其适合作为载体用于在体外和/或体
内，例如在宿主或患者中，直接表达本发明的抗体。此类dna(例如cdna)或rna(例如mrna) 载体可以是未修饰的或修饰的。例如，可以对mrna进行化学修饰以增强rna载体的稳定性和/或被编码分子的表达，从而可以将mrna注入到受试者内以在体内产生抗体(参见例如 stadler等人，nature medicine 2017，published online 2017年6月12日，doi：10.1038/nm.4356 或ep 2 101 823 b1)。
64.本文术语“药物组合物”是指这样的制剂，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不含有对施用所述药物组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
65.如本文所用，术语“受试者”、“对象”和“患者”是指接受对如本文所述的特定疾病或病症(如癌症或传染性疾病)的治疗的生物体。对象和患者的实例包括接受疾病或病症(例如细胞增殖性病症，如癌症或传染性疾病)的治疗的哺乳动物，如人、灵长类动物、猪、山羊、兔、仓鼠、猫、狗、豚鼠、牛科家族成员(如家牛、野牛、水牛、麋鹿和牦牛等)、绵羊和马等。
66.如本文所用，术语“治疗”是指外科手术或药物处理(surgical or therapeutic treatment)，其目的是预防、减缓(减少)治疗对象中不希望的生理变化或病变，如细胞增殖性病症(如癌症或传染性疾病)的进展。有益的或所希望的临床结果包括但不限于症状的减轻、疾病程度减弱、疾病状态稳定(即，未恶化)、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和、以及缓解(无论是部分缓解或完全缓解)，无论是可检测的或不可检测的。需要治疗的对象包括已患有病症或疾病的对象以及易于患上病症或疾病的对象或打算预防病症或疾病的对象。当提到减缓、减轻、减弱、缓和、缓解等术语时，其含义也包括消除、消失、不发生等情况。
67.本文术语“有效量”指单独给予或与另一治疗剂组合给予细胞、组织或对象时能有效防止或缓解疾病病症或该疾病进展的治疗剂用量。“有效量”还指足以缓解症状，例如治疗、治愈、防止或缓解相关医学病症，或治疗、治愈、防止或缓解这些病症的速度增加的化合物用量。当将活性成分单独给予个体时，治疗有效剂量单指该成分。当应用某一组合时，治疗有效剂量指产生治疗作用的活性成分的组合用量，而无论是组合、连续或同时给予。
68.本文术语“癌症”指向或描述哺乳动物中典型地以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。此定义中包括良性和恶性癌症。
69.本文术语“肿瘤”指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖,无论是恶性的还是良性的,及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
70.有益效果
71.与现有技术相比，本发明的技术方案至少具有以下之一的有益效果：
72.1.与鼠源抗体相比，本发明所述人源化抗体不但具有结合pd-l1的能力，在保证分子稳定性和生物学功能符合要求的同时还降低了免疫原性，有助于降低人受试者使用时的免疫排斥风险。
73.2.本发明所述人源化抗体显示与人pd-l1和/或猴pd-l1的良好结合能力，有利于提高其治疗效果和/或开展临床前的动物实验。
74.3.本发明所述人源化抗体能够有效地阻断pd-1与pd-l1蛋白的结合，增强t细胞的功能，上调t细胞介导的免疫应答，有利于治疗pd-l1表达异常相关和/或t细胞功能异常的
疾病。
附图说明
75.除非本发明另外定义，与本发明相关的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员所理解的含义。
76.图1为sec-hplc检测纯化后的人源化pd-l1抗体纯度结果。
77.图2为人源化pd-l1抗体阻断pd-l1和pd-1结合结果，其中阳性对照为avelumab。
78.图3为facs测定人源化pd-l1抗体与细胞水平pd-l1结合能力，其中阳性对照为 avelumab。
79.图4为jurkat-pd-1/cho-pd-l1-nfat体系测试人源化pd-l1抗体对pd-l1/pd-1阻断能力，其中阳性对照为avelumab。
80.图5为人源化抗pd-l1抗体促进混合淋巴细胞反应中ifn-γ的分泌结果，其中阴性对照为anti-hel抗体，阳性对照为avelumab。
81.图6为人源化pd-l1抗体体内对a375人黑色素瘤生长抑制结果。
82.图7为人源化pd-l1抗体体内药效评估体重监测结果。
具体实施方式
83.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
84.本发明实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
85.实施例1.抗体人源化
86.首先采用经典“cdrs移植”方法进行抗体人源化，即通过序列挑选同源性最高的人源性抗体提供抗体骨架区(frs)，把目标抗体的基于kabat命名方法的抗原结合片段互补决定区(cdrs)，移植到前者形成人源化抗体。其次，为更好保持抗体活性和亲和力，通过moe 软件基于抗体结构建模分析：1).选择抗体骨架区位于vh-vl界面、靠近或与cdrs有直接相互作用等氨基酸残基进行回复突变，这类氨基酸残基对保持cdrs区构象多较重要；2).考虑到免疫原性，尽量选择包埋在蛋白内部的氨基酸进行回复突变；3).考虑到抗体稳定性和表达水平，优先考虑分子能量降低突变。通过测试含有不同突变的人源化抗体与人pd-l1的亲和力以及和表面表达pd-l1的细胞的结合，筛选与鼠源pd-l1抗体亲和力、抗体表征和活性功能相当或更好的人源化抗体。
87.其中，鼠源pd-l1抗体pdl1-156经过人源化后的优选候选抗体分子156-bm12的重轻链可变区的氨基酸信息如下表1所示。
88.表1.鼠源及人源化抗pd-l1抗体重链可变区和轻链可变区的具体序列信息
sec-hplc鉴定纯度大于95％可用于后续研究。
96.实施例3抗体与人以及食蟹猴pd-l1重组蛋白结合的kd测定
97.使用biacore t200(ge healthcare)测定pd-l1抗体对于人和食蟹猴pd-l1-his蛋白的结合亲和力。25℃下在cm5芯片(ge healthcare，cat.br-1005-30)上固定anti-human igg fc (genway，cat.gwb-20a705)。将anti-human fc(genway,cat.gwb-20a705)用acetate ph5.0 (ge healthcare，br-1003-51)稀释至20μg/ml。使用immobilization method中amine方法进行固定。或者使用商品化protein a(ge healthcare，cat.29127556)芯片进行检测。25℃下采用多循环动力学法测定抗体与抗原的亲和力，在每一个循环中，首先将待测抗体捕获到固定好的cm5芯片，然后注入重组人pd-l1-his(novoprotein,cat.315)和食蟹猴pd-l1-his 蛋白(sino biological，cat.90251-c08h)，最后用glycine ph1.5(沪试，cat.62011516)再生。流动相为hbs-ep+buffer(ge healthcare，cat.br-1006-69)，流速30μl/min，结合时间为 300秒。再生流速30μl/min，时间为30秒。应用biacore t200 evaluation software(version 3.0)，以1：1结合模型，分析试验数据，拟合抗体抗原的平衡解离常数kd，确定结合速率常数ka 和解离速率常数kd。
98.从结果可知所测试的pd-l1人源化抗体对人pd-l1重组蛋白与食蟹猴pd-l1重组蛋白的结合，都表现出nm或更高的亲和力，详见下表2。
99.表2.人源化pd-l1抗体biacore结合亲和力kd测定结果
100.抗体编号人pd-l1(m)食蟹猴pd-l1(m)156-bm122.04e-091.17e-09
101.实施例4抗体阻断pd-l1和pd-1相互作用的ic50测定
102.通过竞争性elisa方法确定抗pd-l1抗体阻断pd-l1蛋白与pd-1蛋白结合的ic50。使用碳酸盐缓冲液稀释人pd-l1重组蛋白(sino biological,cat.10084-h05h)，加入96孔酶标板，终浓度为1μg/ml。用含3％bsa的pbs溶液封闭，加入梯度稀释的抗pd-l1抗体(40nm～0.02nm)以及人pd-1-his重组蛋白(sino biological,cat.10377-h08h)进行共孵育后，加入hrp标记的抗his标签抗体(mbl,cat.d291-7)，tmb(thermo,cat.34029)显色，1m 硫酸终止后读取od值(双波长450nm-630nm)。将抗体浓度与od值对应即可绘制出测试抗体的竞争结合曲线，计算出ic50值。图2显示了抗pd-l1抗体与人pd-l1重组蛋白的竞争结合曲线。结果表明，被测试的156-bm12抗体可以有效的阻断人pd-l1蛋白与人pd-1蛋白的相互作用，ic50为1.489nm，阳性对照avelumab(pfizer,lot:au020322)为1.263nm。
103.实施例5facs测定pd-l1抗体对细胞表面pd-l1结合的ec50
104.将梯度浓度的待检测抗体(抗体浓度：10000ng/ml-0.1ng/ml)与细胞表面高表达pd-l1 的cho-pd-l1细胞(南京勇山生物科技有限公司，105个/孔)，4℃共同孵育30min。孵育结束后，加入1:250稀释的anti-human igg pe荧光抗体(ebioscience，cat.12-4998-8)，4℃下共同孵育30min，荧光抗体与待检测抗体的fc段产生特异性结合，通过facs检测pe荧光强度的高低而对待检测抗体的结合细胞表面高表达的pd-l1蛋白的能力进行分析。图3结果显示，156-bm12抗体ec50为104.9ng/ml，与本次实验的阳性对照avelumab(ec50为～72ng/ml)相近。该检测定量地证实了156-bm12抗体对细胞表面上pd-l1靶点剂量依赖性结合的能力。mfi fold＝实验组mfi值/未加药物的对照组mfi值。
105.实施例6pd-1/pd-l1-nfat报告基因测试抗pd-l1抗体阻抑pd-1:pd-l1结合和信号
传导
106.利用稳定转染pd-1的jurkat细胞株(genscript，cat.00612)和稳定转染pd-l1的cho 细胞株(genscript，cat.m00613)比较pd-l1抗体对pd-1/pd-l1蛋白相互作用及其信号通路的拮抗作用。当抑制信号通路阻抑，nfat控制的发光报告基因表达增强，发光信号值增加。通过发光读值的强弱(relative light units,rlu)反应抗体对pd-l1的阻断作用强弱。
107.将稳转pd-l1的cho细胞株种在96孔白底板上，每孔40000个细胞，100μl/孔，放回培养箱过夜；第二天，取出孔板，吸去培养基，加入稳转pd-1的细胞株及待测的pd-l1抗体共孵育，pd-1细胞每孔加样量为16000个/孔，抗体则做梯度稀释，每个剂量3复孔，孵育体积为100μl/孔，孵育时长为6小时，待孵育完成时，取出孔板，等体积(100μl)加入发光检测试剂，读值。根据检测值用graphpad进行4参数分析做回归曲线，得到各抗体的ec50 值。图4显示，被测的156-bm12抗体的ec50值(340.8ng/ml)与阳性对照抗体avelumab 的ec50值(291ng/ml)相近。该检测定量地证实了156-bm12抗体对细胞表面pd-1：pd-l1 相互作用导致的t细胞活性抑制呈现剂量依赖性的阻抑能力，从而剂量依赖地增强jurkat细胞内报告基因的活性。
108.实施例7elisa检测混合淋巴细胞反应中t细胞分泌的ifn-γ
109.通过混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction，mlr)来测定pd-l1单抗增强t细胞的活性。从健康人供体1的外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,pbmc)中分离cd14
+
单核细胞，应用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf，peprotech， cat.300-03)和重组人白介素4(rhil-4,peprotech，cat.200-04)进行体外诱导分化为树突状细胞(dendritic cell,dc)，于培养第6天加入lps(sigma，cat：l4516)刺激成熟dc，第7天将供体1的dc细胞与从健康供体2的pbmc富集的cd4
+
t细胞混合共培养，dc：cd4
+
t 细胞数比例为1:10，加入待测抗体、阴性对照抗体anti-hel和阳性对照抗体avelumab(抗体浓度：12.5nm-0.125nm)，共培养4天。4天后收集细胞培养上清，用elisa方法检测上清中ifn-γ的含量。如图5显示，156-bm12及阳性对照抗体avelumab相比anti-hel单抗阴性对照组，可明显增强mlr实验中cd4
+
t细胞分泌ifn-γ的能力，并且随着pd-l1抗体药物浓度降低，增加分泌ifn-γ的活性也降低。该结果表明156-bm12可增强t细胞的功能，且具有剂量依赖性。(t-test，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001.)
110.实施例8hupbmc人源化小鼠体内药效评估
111.a375细胞(北纳生物，bncc100266)以5
×
106个/0.1ml浓度接种于雌性5-6周npg小鼠(北京维通达生物技术有限公司)的右侧皮下。a375细胞接种后，hu pbmc细胞(allcells，pb005f-c)以5
×
106个/0.2ml浓度尾静脉注射于小鼠体内，待肿瘤生长到大约100mm3时按肿瘤体积挑选24只随机分组，每组8只，共3组，分别为：vehicle(pbs)、tecentriq(30mg/kg；lotno.hk65567，roche)、156-bm12(30mg/kg)。所有组给药途径均为腹腔注射，每周给药3次，连续给药5次，末次给药2天后结束实验。给药和观察期间每周测量3次小鼠体重和肿瘤体积，并记录测量值，计算肿瘤体积(长径
×
短径2/2)和生长抑制率tgi
tv
(％)＝(1-(tn/t0)/(vn/v0))
×
100％，其中tn表示治疗组实验终点肿瘤平均体积； t0表示治疗组起始点平均肿瘤体积；vn表示溶媒组终点肿瘤平均体积；v0表示溶媒组起始点肿瘤平均体积。在分组给药第11天，与对照组相比，阳性药tecentriq组和pd-l1抗体 156-bm12组在肿瘤体积上有显著且相近的抑制效果，且具有统计学差异(p《0.05)。详情见图6、表3。
112.表3.受试物对a375细胞移植hupbmc npg小鼠肿瘤体积的影响
[0113][0114]
注：a：平均数
±
标准误；
[0115]
b：给药组肿瘤体积与vehicle对照组肿瘤体积在分组给药第11天进行统计学比较，two-way anova 分析，*p《0.05,**p《0.01，***p《0.001,****p《0.0001。
[0116]
实验动物在给药期间活动和进食状态良好，体重整体呈上升趋势，说明156-bm12安全性较高，详情见图7、表4。
[0117]
表4.受试物对a375细胞移植hupbmc npg小鼠体重的影响
[0118][0119]
注：a：平均数
±
标准误；
[0120]
最终结果表明人源化的pd-l1抗体156-bm12对a375肿瘤皮下移植瘤生长有显著抑制作用且表现出较高安全性。与阳性对照抗体tecentriq相比两者tgi水平相当。