金黄色葡萄球菌的LAMP双链检测探针、试剂盒及检测方法与流程

金黄色葡萄球菌的lamp双链检测探针、试剂盒及检测方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种金黄色葡萄球菌的lamp双链检测探针、试剂盒及检测方法。


背景技术：

2.金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性，是一种无芽孢、鞭毛、乳酸发酵、兼性厌氧的球状细菌，为一种常见的食源性致病微生物，常寄生于人和动物的皮肤、鼻腔、咽喉、肠胃、疮口中，环境中也无处不在，往往对人体造成侵害。
3.目前常用的金黄色葡萄球菌检测方法包括显色培养基培养法、荧光定量pcr、lamp恒温pcr法等，均可以有效地检测。但显色培养法存在耗时长、人为因素大等缺点，检测一个样本往往需要一周，还存在结果不一致性等缺陷。荧光定量pcr通量大，检测时间短，只需要2-4小时，但需要精密昂贵的仪器及专业检测人员，成本高，不利于推广。lamp环介导恒温扩增法借助6条特异性引物和一种具有链置换特性的dna聚合酶，可在等温条件下快速，高特异性和灵敏的扩增靶序列，该方法目前因其设备简单、检测时间短已广泛应用到病原菌检测领域。
4.环介导恒温扩增法结果判读方法主要有1：浊度法，可通过反应后肉眼观察是否存在白色絮状沉淀，判定检测结果，主观因素较强，灵敏度低。2、显色法，反应结束后加入核酸染料sybr green、hnb、钙黄绿素等，在紫外灯或肉眼条件下显示不同的颜色，结果判定简单，但需要反应结束后开盖，极易造成气溶胶污染。3、荧光检测法，该方法通过向反应体系中加入荧光染料sybr green，通过荧光pcr仪可实时观察体系中荧光变化，生成荧光曲线，通过曲线观察扩增结果，该方法闭管检测，杜绝气溶胶污染，但因sybr green染料特性，能和任意的双链dna结合，并发生荧光，特异性低易出现假阳性。


技术实现要素：

5.本发明针对现有环介导恒温扩增法结果判读上的缺陷，提供一种金黄色葡萄球菌的lamp双链检测探针、试剂盒及检测方法，其针对金黄色葡萄球菌的isdd基因设计引物组和双链检测探针，能够快速、高效的检测出金黄色葡萄球菌存在与否，灵敏度高，特异性强，且不易出现假阳性。
6.本发明通过以下技术方案实现：
7.一方面，本发明提供一种金黄色葡萄球菌的lamp双链检测探针，双链检测探针包括发光探针和淬灭探针；
8.发光探针包括依次连接的保守序列和环引物lf，保守序列的5’端标记有荧光发光基团，发光探针的核苷酸序列如seq id no.1所示；
9.淬灭探针与发光探针的保守序列互补，淬灭探针的3’端标记有荧光淬灭基团，淬灭探针的核苷酸序列如seq id no.2所示。
10.进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述荧光发光基团包括fam、vic、tet；优选
为，fam。
11.荧光淬灭基团包括tamra、qsy、bhq，优选为tamra。
12.具体地：
13.发光探针：fam-acgcagaggacccgcatgccaatgcggatgcgcatgccgacaacaagacagtaataaaaag(seq id no.1)；
14.淬灭探针：tcggcatgcgcatccgcattggcatgcgggtcctctgcg t-tamra(seq id no.2)。
15.第二方面，本发明提供一种金黄色葡萄球菌的lamp检测试剂盒，其包括上述lamp双链检测探针。
16.进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述试剂盒还包括检测引物组，检测引物组针对金黄色葡萄球菌的isdd基因编码序列设计，检测引物组包括外引物f3、外引物b3、内引物fip、内引物bip；
17.外引物f3的核苷酸序列为gcctttttactgaaaaaggatt，如seq id no.3所示；
18.外引物b3的核苷酸序列为gtaacgctttttctttttcaact，如seq id no.4所示；
19.内引物fip的核苷酸序列为atgctttaggtcgctcattttcaattattcctgtacaaaaagataaagtg，如seq id no.5所示；
20.内引物bip的核苷酸序列为atagccctccaacagtaaaaaaggtgatttttcatctttatgtttcggt，如seq id no.6所示。
21.进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述双链检测探针中发光探针和淬灭探针的浓度比为1:1.2～1.8。
22.进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述外引物f3和外引物b3的浓度均为0.15～0.25μm，内引物fip和内引物bip的浓度均为1.5～1.7μm。
23.进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述试剂盒还包括以下一种或多种组分：dna聚合酶、dntps、显色剂、甜菜碱、ph调节剂、ddh2o、阳性对照品、阴性对照品。
24.进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述显色剂为酚红、甲酚或中性红。
25.第三方面，本发明还提供一种金黄色葡萄球菌的lamp检测方法，其包括：利用外引物f3、外引物b3、内引物fip、内引物bip以及发光探针和淬灭探针在lamp反应体系下，扩增目的基因；
26.发光探针的核苷酸序列如seq id no.1所示；
27.淬灭探针的核苷酸序列如seq id no.2所示；
28.外引物f3的核苷酸序列如seq id no.3所示；
29.外引物b3的核苷酸序列如seq id no.4所示；
30.内引物fip的核苷酸序列如seq id no.5所示；
31.内引物bip的核苷酸序列如seq id no.6所示。
32.进一步地，在本发明较佳的实施例中，在上述lamp反应体系配制之前，还包括将发光探针和淬灭探针混合，于92～97℃下加热4～6min后，置于冰上骤冷。
33.进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述lamp反应温度为60～65℃下，反应时间为50～70min。
34.与现有技术相比，本发明至少具有如下技术效果：
35.本发明提供一种金黄色葡萄球菌的lamp双链检测探针，相比于taqman探针及分子信标探针法，探针序列固定，无需特别设计，极大的降低了探针设计难度，降低探针合成成本，更适用于lamp探针应用；同时，在lamp检测中使用这种lamp双链检测探针，相比于sybr green染料法，特异性强，无假阳性。
36.分子生物学方面常用来检测金黄色葡萄球菌的目的基因多为nuc耐热核酸酶基因、脱氢酶基因aroe等，但现实研究过程中发现其他菌种也具有nuc等基因，存在假阳性隐患，本技术通过比对筛选出金黄色葡萄球菌特异性靶点基因isdd基因，isdd是金黄色葡萄球菌细胞膜表面的一种蛋白，是金黄色葡萄球菌isd系统中的重要成员，在转运铁离子过程中发挥着重要作用，具有高度菌种特异性，适合作为检测靶标。
37.该试剂盒及检测方法，以金黄色葡萄球菌isdd基因为检测靶标，这种isdd基因相比于nuc基因兼具特异性及保守型，所设计引物具有良好的特异性，和其它种属细菌的同源性非常低，无交叉反应。同时，采用双链探针-恒温变色体系，可兼具荧光定量pcr图谱分析及肉眼观察法来判读结果，可适用不同的仪器，检测过程中不需要开盖，避免气溶胶污染，利于在基层使用。通过采用双链探针-恒温变色双重检测体系，探针特异性强，变色颜色对比明显，不易产生误判，双重体系互相映照，检测的准确性高。
38.说明书附图
39.图1为本发明实施例1中引物及双链探针的设计原则及位置示意图；
40.图2为本发明实施例3中lamp扩增结果目视图；
41.图3为本发明实施例3中lamp扩增结果荧光检测图；
42.图4为本发明实施例4中双链探针-恒温变色扩增体系灵敏度检测图；
43.图5为本发明实施例5中双链探针-恒温变色扩增体系特异性检测。
具体实施方式
44.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围，实施例中未注明的具体条件，按照常规条件或者制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
45.以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
46.实施例1lamp双链检测探针以及引物设计
47.通过查阅文献、对比筛选出金黄色葡萄球菌特有的特异性靶点基因isdd基因，应用专门的lamp引物设计软件以isdd基因为靶标序列进行引物和探针设计，在primer-blast上对设计好的引物和探针进行分析和优化，引物及探针设计原则及位置如图1所示，最终确定的探针和引物序列如下：
48.发光探针由两部分组成，5’端为一段30-45bp的保守序列，在保守序列的5’端标记荧光发光基团，如fam、vic、tet等，3’端为环引物lf，核苷酸序列为：fam-acgcagaggacccgcatgccaatgcggatgcgc atgccga-caacaagacagtaataaaaag(seq id no.1)；其中环引物lf的序列为caacaagacagtaataaaaag(seq id no.7)。
49.淬灭探针的3’端标记有淬灭光基团如tamra、qsy、bhq等，并和发光探针的5’端的
保守序列互补：tcggcatgcgcatccgcattggcatgcgggtcctctgcg t-tamra(seq id no.2)。
50.外引物f3：gcctttttactgaaaaaggatt(seq id no.3)。
51.外引物b3：gtaacgctttttctttttcaact(seq id no.4)。
52.内引物fip：atgctttaggtcgctcattttcaattattcctgtacaaaaagataaagtg(seq id no.5)。
53.内引物bip：atagccctccaacagtaaaaaaggtgatttttcatctttatgtttcggt(seq id no.6)。
54.实施例2建立金黄色葡萄球菌的lamp检测反应体系
55.本实施例中构建的lamp检测反应体系总体积为25μl，将待测样品的模板dna加入到如表1所示的lamp反应体系中，在60-65℃下，反应50-70min。
56.表1.lamp反应体系
[0057][0058][0059]
其中，buffer为100mmkcl、100mm(nh4)2so4、100mmmgso4、1％triton-100)；ph调节剂为tris-hcl。
[0060]
结果判定：
[0061]
(1)目视法，直接观察颜色变化，从而判定lamp扩增的情况及样品中金黄色葡萄球菌的存在与否。
[0062]
(2)荧光曲线法，利用荧光定量pcr仪收集发光基团荧光，给出扩增曲线，判断lamp扩增的情况及样品中金黄色葡萄球菌的存在与否。
[0063]
实施例3样本检测
[0064]
本发明提供的试剂盒检测的真实样品，适用范围包括食品样品、粪便、呕吐物、环境拭子、水样等标本或需要对细菌存在进行检测的生物样本。
[0065]
(1)样本处理：增菌后，取1ml增菌液，低速离心收集沉淀，加入200ul chelex100裂解液，震荡混匀，100℃煮沸5min，取上清作为待测模板dna。
[0066]
(2)lamp扩增：采用如表2所示的lamp检测反应体系，反应温度为63℃，反应时间为60min。
[0067]
表2.lamp检测反应体系
[0068][0069][0070]
(3)结果判定：
[0071]
a.目视法判定：结果如图2所示，反应结束后直接观察反应体系颜色变化，当反应体系由红色变为亮黄色(如管1和管5所示)，说明成功发生了特异性扩增，待测样本中含有金黄色葡萄球菌；当反应体系保持红色(如管2～4和管6～8所示)，说明未发生扩增，待测样本中不含金黄色葡萄球菌。
[0072]
b.荧光曲线判定：结果如图3所示，检测到典型的扩增曲线，说明待测样本中含有
金黄色葡萄球菌，由此证实了双链探针检测的可行性。
[0073]
实施例3灵敏度评价
[0074]
将金黄色葡萄球菌增菌液进行十倍梯度稀释后，浓度依次为：106cfu/ml、105cfu/ml、104cfu/ml、103cfu/ml、102cfu/ml按照实施例2的样本处理和反应体系对各稀释度金黄色葡萄球菌样本进行lamp检测，以确定检测方法的灵敏度。
[0075]
结果如图4所示，由图可以看出，将金黄色葡萄球菌增菌液进行10倍梯度稀释后，建立的金黄色葡萄球菌双链探针-恒温变色检测体系灵敏度可达到102cfu/ml。
[0076]
实施例4特异性评价
[0077]
将金黄色葡萄球菌和常见的食源性微生物(大肠杆菌o157：h7、志贺氏菌、单增李斯特氏菌、副溶血弧菌、溶血链球菌、沙门氏菌、蜡样芽胞杆菌、铜绿假单胞杆菌等)的基因组dna，按照实施例2的反应体系和条件进行特异性实验。
[0078]
结果如图5所示，由图可以看出，只有金黄色葡萄球菌对应的反应体系颜色发生变化，出现典型的荧光扩增曲线，呈现阳性反应。
[0079]
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。