炔基吡啶类化合物，其药物组合物、制备方法和应用与流程

1.本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一种炔基吡啶类化合物，其药物组合物、制备方法和应用。


背景技术：

2.乙型肝炎病毒(hbv)是引起乙型肝炎(简称乙肝)的病原体。hbv感染是全球性的公共卫生问题，持续性hbv感染会导致肝硬化甚至肝癌。随着基因工程疫苗的生产和投入，乙肝疫苗的普及率逐年上升，乙肝的感染率呈下降趋势。在我国，由于乙肝病毒携带者的基数较大，因此，乙肝的防治在当前甚至未来几十年仍然是我国公共卫生的重点。
3.乙型肝炎疫苗是用于预防乙型肝炎的有效手段，常规重组乙型肝炎疫苗主要用于特异性预防新生儿和易感人群的hbv感染。新生儿乙肝疫苗免疫接种有效地预防了新发hbv感染。其中以天然结构的乙肝表面抗原(hbsag)和乙肝e抗原(hbeag)为靶抗原。但是，这一手段仅能在未经感染的健康人体内诱导产生抗体，发挥预防效果，是一种预防性疫苗。
4.目前市场上主要通过使用干扰素或者核苷类似物进行抗病毒治疗。其中核苷类似物通过抑制hbv复制过程中的逆转录酶活性从而抑制hbv产生。逆转录酶抑制剂虽然可以使患者控制乙肝病毒水平，但是成本较高，且缺乏靶向性，逆转录酶抑制剂在服用后大多通过肾脏排出，只有极少部分被肝脏器官吸收，治疗效果较差。因此，寻找新的治疗病毒性肝炎的药物显得尤为重要。


技术实现要素：

5.为改善上述技术问题，本发明提供了一种式(i)所示的化合物、其消旋体、立体异构体、互变异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶型物或它们药学上可接受的盐；
[0006][0007]
其中，r1、r2相同或不同，彼此独立地选自h、卤素、c
1-12
烷基、c
1-12
烷氧基。
[0008]
根据本发明的实施方案，r1、r2相同或不同，彼此独立地选自c
1-6
烷基。
[0009]
根据本发明的实施方案，r1、r2均为甲基。
[0010]
根据本发明的实施方案，式(i)所示化合物具有式(ii)或式(iii)所示的结构：
[0011][0012]
其中，r1、r2具有上文所述的定义。
[0013]
根据本发明的实施方案，式(i)所示化合物选自以下结构：
[0014][0015]
本发明还提供式(i)所示化合物的制备方法，包括以下步骤：化合物i-1脱保护得到式i所示化合物；
[0016][0017]
其中，r1、r2具有上文所述的定义；pg为保护基团，如氨基保护基，例如为boc、cbz。
[0018]
本发明提供式(i)所示的化合物、其消旋体、立体异构体、互变异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶型物或它们药学上可接受的盐中的至少一种在制备治疗或预防病毒性肝炎药物中的应用。优选地，所述应用包括在对此有需要的个体中降低乙型肝炎病毒(hbv)载量、hbeag(乙型肝炎e抗原)和/或hbsag(乙型肝炎表面抗原)水平。
[0019]
根据本发明的实施方案，所述病毒性肝炎包括乙型肝炎或丁型肝炎。
[0020]
根据本发明，所述药物尤其能够降低乙型肝炎病毒(hbv)载量、hbeag(乙型肝炎e抗原)和/或hbsag水平。
[0021]
本发明提供式(i)所示的化合物、其消旋体、立体异构体、互变异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶型物或它们药学上可接受的盐中的至少一种在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0022]
根据本发明的实施方案，所述药物为抗肿瘤药物或抗病毒药物。
[0023]
根据本发明的实施方案，所述肿瘤可以为乳腺癌细胞；优选为mda-mb-231乳腺癌细胞。
[0024]
本发明还提供一种药物组合物，其包含治疗有效量的式(i)所示的化合物、其消旋体、立体异构体、互变异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶型物或它们药学上可接受的盐中的至少一种。
[0025]
根据本发明的实施方案，所述药物组合物经配制而通过选自以下的途径给药：口服、注射、直肠、经鼻、经肺、局部、口腔和舌下、阴道、肠胃外、皮下、肌肉内、静脉内、皮内、鞘内和硬膜外。
[0026]
根据本发明的实施方案，所述药物组合物优选以口服方式给药。
[0027]
所述口服剂型没有特别限定，可以采用本领域熟知的任意口服剂型，优选包括片剂、胶囊、混悬剂或者口服溶液等本领域已知的口服剂型。作为口服剂型时，使用的剂量标准例如为500-1500mg/天，优选用量为700-1200mg/天，优选800-1000mg/天，最优选为1000mg/天。
[0028]
根据本发明的药物组合物的用药时间可以视病情程度而定，优选至少为1个月，例如可以为1、2、3、4、5或6个月，最长可能因病情需要而终身服药。
[0029]
根据本发明的实施方案，所述药物组合物还可以包含药学上可接受的辅料，其选自包括但不限于下列辅料中的至少一种：填充剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、表面活性剂、矫味剂、湿润剂、ph调节剂、增溶剂或助溶剂、渗透压调节剂。本领域技术人员根据具体剂型的需要，可以容易地确定如何选择相应的辅料及其相应用量。
[0030]
根据本发明的实施方案，所述药物组合物还可以进一步含有一种或多种额外的治疗剂。
[0031]
本发明还提供所述式(i)所示的化合物、其消旋体、立体异构体、互变异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶型物或它们药学上可接受的盐，以及所述药物组合物在预防和/或治疗病毒性肝炎或抗肿瘤中的用途。
[0032]
本发明还提供一种预防或治疗病毒性肝炎或抗肿瘤的方法，包括给予患者预防或治疗有效量的式(i)所示的化合物、其消旋体、立体异构体、互变异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶型物或它们药学上可接受的盐中的至少一种，或者给予患者预防或治疗有效量的上述药物组合物。
[0033]
根据本发明的实施方案，所述病毒性肝炎包括乙型肝炎或丁型肝炎。
[0034]
根据本发明的实施方案，所述肿瘤可以为乳腺癌；优选为mda-mb-231肿瘤细胞。
[0035]
在一些实施方案中，所述患者哺乳动物，优选是人。
[0036]
有益效果
[0037]
式(i)所示的化合物对乙型肝炎表面抗原(hbsag)和乙肝e抗原(hbeag)具有明显的抑制作用，在细胞试验和动物试验中具备降低乙型肝炎病毒(hbv)载量、hbsag和/或hbeag水平的能力，因而有望达到清除乙肝病毒的效果，由此达到乙型肝炎的治愈。并且该化合物还能够诱导癌症细胞的凋亡，具有一定的抗肿瘤作用。
附图说明
[0038]
图1为化合物cp84诱导mda-mb-231细胞凋亡检测曲线图。
[0039]
图2为测试例2中本发明化合物的细胞毒性图。
[0040]
图3为测试例2中本发明化合物的hbeag抑制率图。
[0041]
图4为测试例2中本发明化合物的hbsag抑制率图。
[0042]
术语定义与说明
[0043]
除非另有说明，本技术说明书和权利要求书中记载的基团和术语定义，包括其作为实例的定义、示例性的定义、优选的定义、表格中记载的定义、实施例中具体化合物的定义等，可以彼此之间任意组合和结合。这样的组合和结合后的基团定义及化合物结构，应当被理解为本技术说明书和/或权利要求书记载的范围内。
[0044]
除非另有说明，本说明书和权利要求书记载的数值范围相当于至少记载了其中每一个具体的整数数值。例如，数值范围“1-12”相当于记载了数值范围“1-12”中的每一个整数数值即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12。此外，当某些数值范围被定义为“数”时，应当理解为记载了该范围的两个端点、该范围内的每一个整数以及该范围内的每一个小数。例如，“0～10的数”应当理解为不仅记载了0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的每一个整数，还至少记载了其中每一个整数分别与0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9的和。
[0045]
应当理解，本文在描述一个、两个或更多个中，“更多个”应当是指大于2，例如大于等于3的整数，例如3、4、5、6、7、8、9或10。
[0046]
术语“卤素”表示氟、氯、溴和碘。
[0047]
术语“c
1-12
烷基”应理解为表示具有1～12个碳原子的直链或支链饱和一价烃基。例如，“c
1-10
烷基”表示具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子的直链和支链烷基，“c
1-8
烷基”表示具有1、2、3、4、5、6、7、或8个碳原子的直链和支链烷基，“c
1-6
烷基”表示具有1、2、3、4、5或6个碳原子的直链和支链烷基。所述烷基是例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、1,2-二甲基丙基、新戊基、1,1-二甲基丙基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、2-乙基丁基、1-乙基丁基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基或1,2-二甲基丁基等或它们的异构体。
[0048]
术语“c
1-12
烷氧基”应理解为“c
1-12
烷基-o
‑”
基团。
[0049]
在本文中，术语“药学上可接受的盐”是指由药学上可接受的无毒的酸(包括无机或有机酸)制成的盐。本发明的化合物可以是单盐、二盐或三盐，取决于在化合物的游离碱形式中存在的酸性官能团的数目。作为实例，所述酸包括乙酸、三氟乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙烷磺酸、富马酸、葡萄糖、谷氨酸、氢溴酸、盐酸、羟乙磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、杏仁酸、甲烷磺酸、粘酸、硝酸、扑酸、泛酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、草酸、酒石酸、对甲苯磺酸等。
[0050]
病毒性肝炎
[0051]
病毒性肝炎的病原学分型，目前已被公认的有甲、乙、丙、丁、戊五种肝炎病毒，分别写作hav、hbv、hcv、hdv、hev，除乙型肝炎病毒为dna病毒外，其余均为rna病毒。
[0052]
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒引起的以肝脏病变为主的一种传染病。临床上以食欲减退、恶心、上腹部不适、肝区痛、乏力为主要表现。部分患者可有黄疸发热和肝大伴有肝功能损害。有些患者可慢性化，甚至发展成肝硬化，少数可发展为肝癌。
[0053]
乙型病毒性肝炎的病原为乙型肝炎病毒(hbv)，其为一种dna病毒，其基因组是双
链、环形、不完全闭合dna。病毒最外层是病毒的外膜或衣膜，其内层为核心部分，核蛋白即是核心抗原(hbcag)，不能在血清中检出。hbsag阳性者的血清在电子显微镜下可见3种颗粒，直径为22nm的圆形和丝状颗粒，还有较少的直径为42埃的球形颗粒，又称为dane氏颗粒，是完整的hbv颗粒。
[0054]
乙型肝炎的标志检测如下所述：
①
hbsag与抗-hbs：hbsag阳性示hbv目前处于感染阶段，抗-hbs为免疫保护性抗体阳性示已产生对hbv的免疫力。慢性hbsag携带者的诊断依据为无任何临床症状和体征、肝功能正常，hbsag持续阳性6个月以上者。
②
hbeag与抗-hbe：hbeag阳性为hbv活跃复制及传染性强的指标，被检血清从hbeag阳性转变为抗-hbe阳性表示疾病有缓解感染性减弱。
③
hbcag与抗-hbc：hbcag阳性提示存在完整的hbv颗粒直接反应，hbv活跃复制由于检测方法复杂临床少用。抗-hbc为hbv感染的标志，抗-hbc igm阳性提示处于感染早期，体内有病毒复制。在慢性轻度乙型肝炎和hbsag携带者中hbsag、hbeag和抗-hbc三项均阳性具有高度传染性指标难以阴转。
[0055]
在本文中，“对此有需要的个体”包括感染/携带乙型肝炎病毒或丁型肝炎病毒的个体，尤其是患有急性、慢性、重型肝炎或肝炎后肝硬化的患者，乙型肝炎表面抗原的携带者，和感染丁型肝炎的患者等。
[0056]
在本文中，“治疗有效量”或“有效量”是指在剂量下有效并且持续所需时间周期以实现期望的治疗结果的量。药物组合物的治疗有效量将取决于疾病或症状的特性和特定的药物，且可以通过本领域技术人员已知的标准临床技术确定。
[0057]
治疗结果可以包括减轻症状、延长存活、提高移动性等。治疗结果不必然是“(完全)治愈”。治疗结果也可以是预防性的。
[0058]
本技术的药物或药物组合物通过适合于待治疗疾病的任何途径给药。合适的途径包括口服、直肠、鼻、肺、局部(包括口腔和舌下)、阴道和肠胃外(包括皮下、肌肉内、静脉内、皮内、鞘内和硬膜外)等。将会理解，优选途径可根据例如接受者的状况而变化。根据本发明的药物或药物组合物的一个优点在于，它们是口服生物可利用的并且可以口服给药。
[0059]
在一个优选实施方式中，所述药物组合物经配制通过选自以下的途径给药：口服、直肠、经鼻、经肺、局部、口腔和舌下、阴道、肠胃外、皮下、肌肉内、静脉内、皮内、鞘内和硬膜外。
[0060]
在一个优选实施方式中，所述组合物经配制通过口服给药，优选为片剂或胶囊的形式。
[0061]
根据本发明的药物组合物可以用常规载体和赋形剂(其将根据通常的实践选择)配制。片剂将含有赋形剂、助流剂、填充剂、粘合剂等。水性制剂以无菌形式制备，并且当用于通过非口服给药递送时，通常是等渗的。所有制剂将任选地含有赋形剂，例如“handbook of pharmaceutical excipients”(1986)中所述的赋形剂。赋形剂包括抗坏血酸和其它抗氧化剂，螯合剂如edta，碳水化合物如葡聚糖，羟基烷基纤维素，羟基烷基甲基纤维素，硬脂酸等。制剂的ph范围为约3至约11，但通常为约7至10。在一些实施方式中，制剂的ph范围为约2至约5，但通常为约3至4。
[0062]
制剂包括适用于前述给药途径的制剂。制剂可以方便地以单位剂型存在，并且可以通过药学领域熟知的任何方法制备。技术和制剂通常在remington’spharmaceutical sciences(mack publishing co.，easton，pa)中找到。这样的方法包括使活性成分与由一
异喹啉(重量：4g，产率：53.32％，纯度：95.09％)。
[0071]
lcms条件：柱子型号：kinetex evo c18；长度：30mm，内径：3.0mm；流动相a：水/5mm碳酸氢铵；流动相b：乙腈；总时间：2.00min；出峰时间：1.038min.
[0072]
esi-ms m/z：270[m+h]
+
.
[0073]
2)室温下，将4,6-二溴吡啶-2-胺(10g，39.697mmol，1eq)置于250ml的单口瓶中，加入乙腈(20ml，380.484mmol，9.58eq)和四氢呋喃(10ml，123.428mmol，3.11eq)，在氮气保护下依次向瓶中加入三异丙基硅基乙炔(7.24g，39.697mmol，1eq)，碘化亚铜(0.76g，3.970mmol，0.1eq)，三乙胺(12.05g，119.091mmol，3eq)，双(三苯基膦)二氯化钯(2.79g，3.970mmol，0.1eq)。升温至50℃反应4～5小时，lcms监测显示反应结束。随后将反应体系冷却至室温，用乙酸乙酯萃取三次，把有机相合并，经无水硫酸钠干燥过滤后，将滤液减压浓缩，所得粗产品用硅胶柱层析纯化，洗脱剂石油醚与乙酸乙酯的比例为3/1，得到棕黄色油状的4-溴-6-三异丙基硅基乙炔基吡啶-2-胺(重量：9g，产率：62.18％，纯度：96.92％)。
[0074]
lcms条件：柱子型号：kinetex evo c18-100a；长度：30mm，内径：3.0mm；流动相a：水/6.5mm碳酸氢铵；流动相b：乙腈；总时间：2.00min；出峰时间:1.544min.
[0075]
esi-ms m/z：355[m+h]
+
.
[0076]
3)把boc-n-甲基-d-丙氨酸(15.36g，75.555mmol，3eq)置于250ml的三口瓶中，加入二氯甲烷(90ml，1415.754mmol，56.21eq)，将其冷却至0℃后，然后依次向瓶中缓慢加入n,n'-二环己基碳酰亚胺(15.59g，75.555mmol，3eq)，4-二甲氨基吡啶(0.09g，0.756mmol，0.03eq)，维持该温度搅拌0.5h～1h，然后缓慢注入用二氯甲烷(10ml，157.306mmol，6.25eq)溶解后的4-溴-6-三异丙基硅基乙炔基吡啶-2-胺(8.9g，25.185mmol，1eq)。过夜反应至次日，lcms监测显示反应结束。随后将反应体系进行过滤，滤饼层反复用二氯甲烷淋洗，将滤液减压浓缩，所得粗产品用硅胶柱层析纯化，洗脱剂石油醚与乙酸乙酯的比例为5/1，得到深棕黄色油状的叔丁基(r)-(1-(4-溴-6-((三异丙基甲硅烷基)乙炔基)吡啶-2-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸酯(重量：7.9g，产率：44.55％，纯度：76.49％)。
[0077]
lcms条件：柱子型号：kinetex evo c18-100a；长度：30mm，内径：3.0mm；流动相a：水/6.5mm碳酸氢铵；流动相b：乙腈；总时间：2.00min；出峰时间:1.753min.
[0078]
esi-ms m/z：538[m+h]
+
.
[0079]
4)在氮气保护下，将叔丁基(r)-(1-(4-溴-6-((三异丙基甲硅烷基)乙炔基)吡啶-2-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸酯(7.78g，14.445mmol，1eq)溶于1.4
–
二氧六环(80ml，1530.592mmol，105.96eq)中,依次向反应瓶中加入双联频哪醇硼酸酯(4.77g，18.779mmol，1.3eq)，醋酸钾(4.25g，43.335mmol，3eq)和1,1'-双(二苯基膦)二茂铁二氯化钯二氯甲烷络合物(1.18g，1.445mmol，0.1eq)。升温至40℃反应4小时。反应结束后，将反应体系降至室温，然后用水稀释后，用乙酸乙酯萃取三次，把有机相合并，用饱和食盐水将有机相洗涤两次，经无水硫酸钠干燥过滤后，将滤液减压浓缩，深棕黄色油状叔丁基(r)-甲基(1-氧代-1-((4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊烷-2-基)-6-((三异丙基甲硅烷基)乙炔基)吡啶-2-基)氨基)丙-2-基)氨基甲酸酯的粗产品(重量：7.2g，产率：61.23％，纯度：76.17％)
[0080]
lcms条件：柱子型号：kinetex evo；长度：30mm，内径：3.0mm；流动相a：水/5mm碳酸氢铵；流动相b：乙腈；总时间：2.00min；出峰时间：1.441min、1.717.
[0081]
esi-ms m/z：504、586[m+h]
+
.
[0082]
5)在氮气保护下，向叔丁基(r)-甲基(1-氧代-1-((4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊烷-2-基)-6-((三异丙基甲硅烷基)乙炔基)吡啶-2-基)氨基)丙-2-基)氨基甲酸酯(7g，11.952mmol，1eq)中加入1.4
–
二氧六环(70ml，1377.109mmol，115.22eq)和水(7ml，388.559mmol，32.51eq)，依次向反应瓶中加入3-碘-5-甲基咪唑并[1，2-a]吡啶(4.63g，17.928mmol，1.5eq)，磷酸钾(7.61g，35.856mmol，3eq)和1,1'-双(二苯基膦)二茂铁二氯化钯二氯甲烷络合物(973.64mg，1.195mmol，0.1eq)。升温至80℃过夜反应至次日，lcms监测显示反应结束。然后将反应体系缓慢加入到水中，用乙酸乙酯萃取三次，把有机相合并后，用饱和食盐水反洗有机相三次，经无水硫酸钠干燥过滤后，将滤液减压浓缩，所得粗产品用硅胶柱层析纯化，洗脱剂石油醚与乙酸乙酯的比例为2/1，得到白色固体叔丁基(r)-甲基(1-((4-(5-甲基咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)-6-((三异丙基甲硅烷基)乙炔基)吡啶-2-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基甲酸酯(重量：2.85g，产率：40.18％，纯度：99.4％)。
[0083]
lcms条件：柱子型号：kinetex evo c18；长度：30mm，内径：3.0mm；流动相a：水/5mm碳酸氢铵；流动相b：乙腈；总时间：2.00min；出峰时间：1.569min.
[0084]
esi-ms m/z：590.3[m+h]
+
.
[0085]
6)室温下，叔丁基(r)-甲基(1-((4-(5-甲基咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)-6-((三异丙基甲硅烷基)乙炔基)吡啶-2-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基甲酸酯(2.8g，4.747mmol，1eq)置于100ml的单口瓶中，加入四氢呋喃溶液(30ml，370.283mmol，78.00eq)，随后加入四丁基氟化铵(3.72g，14.241mmol，3eq)，室温反应2～3h，lcms监测显示反应结束。然后将反应体系缓慢加入到水中，用乙酸乙酯萃取三至四次，把有机相合并后，用饱和食盐水反洗有机相三次，经无水硫酸钠干燥过滤后，将滤液减压浓缩，所得粗产品用硅胶柱层析纯化，洗脱剂石油醚与乙酸乙酯的比例为2/1，得到红棕黄色固体叔丁基(r)-(1-((6-乙炔基-4-(5-甲基咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)吡啶-2-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸酯(重量：1.9g，产率：92.33％，纯度：100％)。
[0086]
lcms条件：柱子型号：shim-pack xr-ods；长度：50mm，内径：3.0mm；流动相a：水/0.05％三氟乙酸；流动相b：乙腈/0.05％三氟乙酸；总时间：2.00min；出峰时间：0.966min.
[0087]
esi-ms m/z：434.1[m+h]
+
.
[0088]
7)室温下,将叔丁基(r)-(1-((6-乙炔基-4-(5-甲基咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)吡啶-2-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸酯(1.8g，4.152mmol，1eq)置于100ml的单口瓶中，加入乙腈(20ml，380.484mmol，91.64eq)和四氢呋喃(10ml)，在氮气保护下依次向瓶中加入6-碘-1-甲基异喹啉(1.68g，6.228mmol，1.5eq)，碘化亚铜(0.08g，0.415mmol，0.1eq)，三乙胺(1.26g，12.456mmol，3eq)，双(三苯基膦)二氯化钯(0.29g，0.415mmol，0.1eq)。升温至50℃过夜反应至次日，lcms监测显示反应结束。随后将反应体系冷却至室温，用乙酸乙酯萃取三次，把有机相合并，经无水硫酸钠干燥过滤后，将滤液减压浓缩，所得粗产品用硅胶柱层析纯化，洗脱剂二氯甲烷与甲醇的比例为11/1，得到棕黄色固体叔丁基(r)-甲基(1-((4-(5-甲基咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)-6-((1-甲基异喹啉-6-基)乙炔基)吡啶-2-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基甲酸酯(重量：2.1g，产率：82.99％，纯度：94.3％)。
[0089]
lcms条件：柱子型号：kinetex evo c18-100a；长度：30mm，内径：3.0mm；流动相a：水/6.5mm碳酸氢铵；流动相b：乙腈；总时间：2.00min；出峰时间:1.224min.
[0090]
esi-ms m/z：575.15[m+h]
+
.
[0091]
8)室温下,将叔丁基(r)-甲基(1-((4-(5-甲基咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)-6-((1-甲基异喹啉-6-基)乙炔基)吡啶-2-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基甲酸酯(2g，3.480mmol，1eq)置于100ml的单口瓶中，加入二氯甲烷(20ml)，随后缓慢滴加三氟乙酸(5.00ml，67.303mmol，19.34eq)，室温反应1h，lcms监测显示反应结束。将反应体系减压浓缩，所得粗产品用反相柱层析纯化，得到淡黄色固体(r)-2-(甲氨基)-n-(4-(5-甲基咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)-6-(1-甲基异喹啉-6-基)乙炔基)吡啶-2-基)丙酰胺(化合物cp84，重量：955mg，产率：56.96％，纯度：98.5％)。
[0092]
lcms条件：柱子型号：kinetex evo c18-100a；长度：30mm，内径：3.0mm；流动相a：水/6.5mm碳酸氢铵；流动相b：乙腈；总时间：2.00min；出峰时间:1.057min.
[0093]
esi-ms m/z：475.1[m+h]
+
.
[0094]1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ8.43(d,j＝5.7hz,1h),8.33
–
8.23(m,2h),8.16(d,j＝1.4hz,1h),7.94
–
7.53(m,5h),7.40
–
7.29(m,1h),6.88(d,j＝6.9hz,1h),3.33
–
3.18(m,1h),2.91(s,3h),2.40(s,3h),2.30(s,3h),1.24(d,j＝6.9hz,3h).
[0095]
测试例1细胞凋亡实验
[0096]
实验目的
[0097]
本实验采用promega公司提供的3/7试剂盒检测细胞的凋亡。按照下面所示的实验步骤来测定中以海德人工智能药物研发股份有限公司的化合物对mda-mb-231细胞凋亡的影响。
[0098]
实验方法
[0099]
细胞培养
[0100]
a)mda-mb-231细胞培养于l-15培养基中，加10％fbs和1％双抗，置于37℃、无co2培养箱中培养。
[0101]
细胞铺板
[0102]
a)细胞常规培养至合适密度，收取细胞。
[0103]
b)用相应的培养基重悬，计数，配制成合适密度的细胞悬液。
[0104]
c)将细胞悬液加入96孔板，每孔100μl，细胞密度为20000/孔。
[0105]
d)细胞放在37℃，无co2培养箱中过夜培养。
[0106]
化合物制备
[0107]
化合物信息见表1。
[0108]
表1：化合物信息
[0109][0110]
a)待测化合物(20mm)用dmso从20mm稀释2倍到10mm，然后从10mm开始3倍稀释9个浓度。
[0111]
b)vehicle control是100％dmso，blank为纯培养基无细胞。
[0112]
c)取1μl中间稀释化合物至249μl，培养基中为工作化合物。
[0113]
化合物处理
[0114]
a)细胞铺板24小时以后，每孔补50μl的生长培养基，然后加入50μl上述准备的化合物到孔中。
[0115]
b)每个待测化合物终浓度为：10000，3333，1111，370.4，123.5，41.2，13.7，4.6，1.5，0nm。
[0116]
c)vehicle control是0.1％dmso，blank为纯培养基无细胞。
[0117]
d)细胞放在37℃，无co2培养箱中24小时。
[0118]
ctg检测
[0119]
a)每孔弃掉100μl培养基。
[0120]
b)每孔加100μl3/7试剂，放置快速振荡器振荡2分钟，室温避光放置30分钟。
[0121]
c)用envision仪器读取化学发光信号值。
[0122]
数据分析
[0123]
用graphpad prism 8software计算ec
50
(半数刺激浓度)，利用以下非线性拟合公式来得到化合物的ec
50
，见图1。
[0124]
y＝bottom+(top-bottom)/(1+10^((logec
50-x)*hillslope))
[0125]
x：化合物浓度log值，y：raw data。
[0126]
如图1所示，化合物cp84对诱导mda-mb-231细胞凋亡的ec
50
值为71.40nm，具备良好的抗肿瘤活性
[0127]
测试例2体外抗hbv活性实验
[0128]
1.实验方案
[0129]
铺细胞和化合物处理
[0130]
第0天，将hepg2.2.15铺种到96孔板中(6
×
104个细胞/孔)。
[0131]
第1天，加含化合物的培养基。受试化合物稀释3个单药浓度(表1)，测试化合物测试3个浓度，对照化合物etv共8个浓度，3倍稀释，三复孔。细胞在5％co2和37℃的条件下培养3天。
[0132]
第4天，更换一次含化合物的新鲜培养基。
[0133]
第7天，收集上清，将收集的细胞上清用elisa法检测hbeag和hbsag。同时，celltiter-glo检测细胞活力，收集细胞冷冻保存(备用)。
[0134]
表2.受试化合物测试浓度(μm)
[0135][0136]
样品检测
[0137]
elisa法检测细胞培养上清中hbeag和hbsag的含量：
[0138]
方法参照试剂盒说明书，方法简述如下：分别取50μl的标准品，样品和对照品加入到检测板中，然后每孔加入50μl酶结合物，37℃孵育60分钟，用洗液洗板后吸干，然后加入
50μl预混发光底物，室温避光孵育10分钟，最后酶标仪测定发光值。
[0139]
celltiter-glo细胞活力检测：
[0140]
参照celltiter-glo试剂盒说明书测定细胞活力，方法简述如下：收集细胞培养上清之后，每孔加入celltiter-glo(培养基1:1稀释)，室温孵育10分钟，酶标仪测定发光值。
[0141]
数据分析
[0142]
hbeag抑制率(％)＝(1-样品的hbeag值/dmso对照组hbeag值)
×
100％
[0143]
hbsag抑制率(％)＝(1-样品的hbsag值/dmso对照组hbsag值)
×
100％细胞活性(％)＝((化合物组样品的值
–
空白对照组平均值)/(dmso组平均值
–
空白对照组平均值)
×
100％
[0144]
应用graphpad prism软件(four parameter logistic equations)计算ec
50
值。
[0145]
本发明化合物(cp84)的活性见下表3：
[0146]
表3
[0147][0148]
由表3可知，本发明的化合物对hbeag、hbsag均具有较高的抑制率，在低浓度下对hbsag也有较好的抑制率同时具有较低的细胞毒性，是用于治疗病毒性肝炎的潜在药物。
[0149]
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。