一种无核酸扩增可视化的RNA定量检测方法

一种无核酸扩增可视化的rna定量检测方法
1.【技术领域】本发明涉及分子诊断与生化分析方法研究领域，尤其涉及一种无核酸扩增可视化的rna定量检测方法。
2.

背景技术：
rna分子作为重要的遗传信息载体，由于它们在众多生物过程中的重要作用，从基础生物化学研究到临床诊断的各个领域，rna分子的特异性和灵敏检测变得越来越重要。例如，基于新型冠状病毒（sras-cov-2）rna的核酸检测，作为新型冠状病毒病(covid-19)诊断的金标准，在covid-19大流行的预防和控制中发挥着至关重要的作用。
3.目前rna检测方法主要分为直接检测和基于核酸扩增的检测。rna直接检测的主要包括northern印迹，荧光原位杂交（fish），dna微阵列等，这些方法在具有高特异性，但这些方法通常存在繁琐且耗时的实验程序且灵敏度不高。基于核酸扩增的rna检测方法，包括逆转录聚合酶链反应（rt-pcr）以及多种等温核酸扩增技术。然而，这些方法通常需要逆转录/连接步骤以将rna转化为dna，以及随后的dna复制步骤以产生可检测的核酸水平。但扩增步骤往往会引入一些比较棘手的问题，例如由于逆转录不完全导致的目标 rna分子丢失、易错序列复制导致的扩增偏差以及污染导致的假阳性结果。此外，需要精心设计多个靶标特异性探针/引物，严格优化实验条件。
4.因此，有必要研究一种无核酸扩增可视化的rna定量检测方法来应对现有技术的不足，以解决或减轻上述一个或多个问题。
5.

技术实现要素：
鉴于此，本发明提供了一种无核酸扩增可视化的rna定量检测方法，利用溶液在毛细管中的移动距离便可以实现无需核酸扩增，可视化的rna定量检测，为rna为靶标的分子诊断、疾病检测提供新工具。
6.一方面，本发明提供一种无核酸扩增可视化的rna定量检测方法，所述rna定量检测方法包括：s1：设计制备crispr-cas13系统响应rna交联的dna水凝胶；s2：将s1制备的dna水凝胶固定在毛细管末端形成超薄dna水凝胶薄膜，由超薄dna水凝胶薄膜与毛细管共同组成自驱动dna水凝胶传感器；s3：设计合成与靶标rna分子特异性的crrna；s4：将crrna、cas13a蛋白和靶标rna在适当缓冲溶液中共同孵育后，获得含有已知浓度的靶标rna分子样品溶液；s5：将自驱动dna水凝胶传感器水平浸入含有已知浓度的靶标rna分子溶液；s6：通过s5中溶液在毛细管中的移动距离，构建靶标rna分子浓度与移动距离之间的线性对应关系；s7：将自驱动dna水凝胶传感器水平浸入含有靶标rna分子待测样品溶液，根据s6中线性对应关系对待测样品中靶标rna分子溶液进行可视化检测及定量分析。
7.如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述s1具体
包括：s11：设计合成两条acrydite修饰的dna链，a-dna-x和a-dna-y；s12：设计合成双重功能的交联单链rna，drcl-ssrna；s13：将a-dna-x和a-dna-y分别与丙烯酰胺单体共聚，分别形成直链聚丙烯酰胺-dna pa-x和pa-y；s14：drcl-ssrna包含三个序列区域，3'-和5'-末端的两个序列分别与dna-x和dna-y互补配对，在室温下形成具有三维多孔结构的dna水凝胶。
8.如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述s14中dna水凝胶的中间序列为crispr-cas13系统响应序列，即crispr-cas13系统反式切割反应的底物序列。
9.如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述s5具体为：将s4所制备的自驱动dna水凝胶传感器水平浸入含有已知浓度的靶标rna分子样品溶液，在毛细作用下，含有靶标rna分子的溶液通过dna水凝胶薄膜进入毛细管。
10.如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述s6毛细管中的移动距离具体为：靶标rna分子激活crispr/cas13系统的附属酶切活性，使毛细管末端的dna水凝胶薄膜的通透性增加，靶标rna分子的浓度越大，溶液在毛细管中移动距离越大，且靶标rna分子浓度与溶液在毛细管中移动距离成线性关系。
11.与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：1、本发明无需核酸扩增步骤和昂贵的仪器设备，只需要将末端固定水凝胶薄膜的毛细管浸入含有靶标分子的样品溶液，通过溶液在毛细管中的距离实现对rna分子定量分析，设计简单，检测方便，分析成本低；2、本发明检测方式和信号输出模式非常适用于临床快检及家庭化的诊断分析及检测；3、本发明不仅限于实施例所陈述sars-cov-2 rna的定量检测，可以推广至任何一种rna分子的定量分析。
12.当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
13.【附图说明】为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
14.图1是本发明所述crispr-cas13系统响应rna交联dna水凝胶示意图；图2是本发明所述crispr-cas13系统响应的自驱动dna水凝胶传感器制备示意图；图3是本发明无核酸扩增可视化rna定量检测原理示意图；图4是本发明不同浓度sars-cov-2 n基因rna检测结果；图5是本发明不同浓度sars-cov-2 n基因rna定量检测效果；图6是本发明具体实施方案中该方法特异性研究图；图7是本发明具体实施方式中实际样本中sras-cov-2检测结果图。
15.【具体实施方式】为了更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图对本发明实施例进行详细描
述。
16.应当明确，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
17.在本发明实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明。在本发明实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。
18.本发明提供一种无核酸扩增可视化的rna定量检测方法，所述rna定量检测方法包括：s1：设计制备crispr-cas13系统响应rna交联的dna水凝胶；s2：将s1制备的dna水凝胶固定在毛细管末端形成超薄dna水凝胶薄膜，由超薄dna水凝胶薄膜与毛细管共同组成自驱动dna水凝胶传感器；s3：设计合成与靶标rna分子特异性的crrna；s4：将crrna、cas13a蛋白和靶标rna在适当缓冲溶液中共同孵育后，获得含有已知浓度的靶标rna分子样品溶液；s5：将自驱动dna水凝胶传感器水平浸入含有已知浓度的靶标rna分子样品溶液；s6：通过s5中溶液在毛细管中的移动距离，构建靶标rna分子浓度与移动距离之间的线性对应关系；s7：将自驱动dna水凝胶传感器水平浸入含有靶标rna分子的待测样品溶液，根据s6中线性对应关系对待测样品中靶标rna分子溶液进行可视化检测及定量分析。
19.所述s1具体包括：s11：设计合成两条acrydite修饰的dna链，a-dna-x和a-dna-y；s12：设计合成双重功能的交联单链rna，drcl-ssrna；s13：将a-dna-x和a-dna-y分别与丙烯酰胺单体共聚，分别形成直链聚丙烯酰胺-dna pa-x和pa-y；s14：drcl-ssrna包含三个序列区域，3'-和5'-末端的两个序列分别与dna-x和dna-y互补配对，在室温下形成具有三维多孔结构的dna水凝胶。
20.所述s14中dna水凝胶的中间序列为crispr-cas13系统响应序列，即crispr-cas13系统反式切割反应的底物序列。
21.所述s5具体为：将s4所制备的自驱动dna水凝胶传感器水平浸入含有已知浓度的靶标rna分子样品溶液，在毛细作用下，含有靶标rna分子的溶液通过dna水凝胶薄膜进入毛细管。
22.所述s6毛细管中的移动距离具体为：靶标rna分子激活crispr/cas13系统的附属酶切活性，使毛细管末端的dna水凝胶薄膜的通透性增加，靶标rna分子的浓度越大，溶液在毛细管中移动距离越大，且靶标rna分子浓度与溶液在毛细管中移动距离成线性关系。
23.本发明提供一种高灵敏度、高特异性、无需核酸扩增步骤、无昂贵光学仪器、可视化的rna定量检测方法并将该方法成功应用于sars-cov-2 rna的可视化定量分析。
24.实现本发明技术方案由以下步骤组成：步骤1、设计制备crispr-cas13a响应rna交联的dna水凝胶；
(tm)，此时dna水凝胶变成具有低流动性的溶液状态。当毛细管垂直插入加热的凝胶溶液中时，凝胶溶液可以通过毛细作用注入毛细管中。适当时间后，取出毛细管后，在室温下在毛细管末端形成crispr-cas13a响应rna交联的dna水凝胶薄膜，薄膜厚度可以通过毛细管插入凝胶溶液的时间控制。随后，将毛细管固定在有刻度的基板上，获得cas13a-rcsas。
30.cas13a-rcsas制备具体步骤如下：s9：首先对毛细管表面进行羟基化处理，将玻璃毛细管置入食人鱼溶液（7:3 (vol/vol) 98% h2so4和30% h2o2的混溶液），在90
°
c下保持2小时；随后将毛细管在乙醇中超声处理10分钟；milli-q水冲洗3次并用氮气吹干。
31.s10：在离心管中，将s8所制备的dna水凝胶用水浴加热至58
°
c（该实施例中最优选温度），使dna水凝胶变成粘度高、流动性小的凝胶溶液；s11：将s9羟基化处理的毛细管垂直插入s10的凝胶溶液中，通过毛细作用将凝胶溶液吸入毛细管末端；三秒后（该实施例中最优选时间），取出毛细管，吸入毛细管末端的凝胶溶液在室温下在毛细管末端形成dna水凝胶膜；s12：将s11末端固定dna水凝胶薄膜的毛细管固定在带有刻度的基底上制得cas13a-rcsas。
32.步骤3：利用cas13a-rcsas检测靶标rna如图3所示，将sras-cov-2 n基因特异性的crrna、含有sras-cov-2 n基因rna的样品（阴性对照用水作为样品）和cas13a蛋白在适当缓冲溶液中共同孵育后，将cas13a-rcsas插入上述溶液中，由于毛细作用溶液会通过水凝胶薄膜缓慢进入毛细管中，被靶标分子激活的crispr-cas13a系统会剪切水凝胶薄膜中富含u的单链rna，使水凝胶结构破坏，水凝胶的通透性增加，溶液更容易进入毛细管中，不同浓度的靶标rna分子会引起不同的通透性变化，从而使溶液在毛细管中进入的距离不同，这样通过肉眼就可以对靶标rna分子进行识别和定量分析。
33.步骤4. sars-cov-2 n基因rna分析为了更好说明cas13a-rcsas可视化rna定量检测原理及论证本发明的可行性和应用价值，利用本发明所述方法对sras-cov-2 n基因rna进行定量检测。
34.实施例1：s1：通过体外转录方法制备sras-cov-2 n基因rna（sars-cov-2-n-rna），具体步骤如下；（1）通过pcr扩增从dna质粒（puc57-2019-ncov-n，金斯瑞公司）获得体外t7转录dna模板：50 μl pcr反应混合物包含 100 ng dna质粒、1
×
pcr反应缓冲液、250 μm dntps（每种250 μm）、500 nm t7启动子标记的正向引物（t7-fp-sras-cov-2，序列为5
′‑
taatacgact cactataggatgtctgataatggaccccaaaatca-3
′
，上海生工)、500 nm反向引物（rp-sras-cov-2，序列为5
′‑
ttaggcctg agttgagtcagc-3
′
，上海生工）、5 u takara taq hs dna聚合酶（sigma）进行pcr扩增。pcr循环包括热启动步骤（95
°
c 4分钟），热循环过程（40个循环：95
°
c 20秒；62
°
c 30秒；72
°
c 1 分钟），最终延伸（72
°
5 分钟）。pcr产物用4%琼脂糖凝胶电泳确认后用sanprep柱式pcr产物纯化试剂盒（上海生工）纯化获得t7转录dna模板。
35.（2）通过t7转录反应制备sars-cov-2 n基因rna：将含有2 μg t7转录dna 模板、1
np3）和阴性np拭子样本（阴性np1-np3）中的sras-cov-2。如图7所示，与阴性np样品和空白对照相比，含有10
3-105拷贝/μl的sars-cov-2-abmen假病毒颗粒阳性样本的溶液在45分钟后产生明显的移动距离。
42.根据图5中获得的相关方程和提取步骤中的稀释因子，评估了模拟阳性np拭子样本中sars-cov-2-abmen假病毒的拷贝数。结果如表1所示，这些阳性样本的所有计算副本约为加标样本的54.6%-76.9%，表明在提取过程中可能会丢失部分rna分子。为了验证这些结果，模拟的sars-cov-2阳性np样本通过cdc报道的rt-pcr方法进行检测，证实cas13a-rcsas和rt-pcr检测结果基本一致。充分证实了cas13a-rcsas在临床样本检测方面的实用性和可靠性。
43.表1 cas13a-rcsas和rt-pcr检测模拟np样本中sars-cov-2spikedinnpscas13a-rcsasrt-pcr1000copies/μl664
±
59copies/μl451
±
46copies/μl10,000copies/μl7,690
±
561copies/μl7,291
±
698copies/μl100,000copies/μl54,581
±
2,809copies/μl52,901
±
4,975copies/μl本发明首先设计crispr-cas13a响应rna交联的dna水凝胶，利用水凝胶的热可逆性和毛细作用，将超薄dna水凝胶薄膜固定在毛细管末端制备crispr-cas13a响应的自驱动dna水凝胶传感器；将传感器水平浸入含有靶标rna分子的溶液时，在毛细作用下，样品溶液通过dna水凝胶薄膜进入毛细管；靶标特异性的crrna引导cas131蛋白特异性识别靶标rna分子并激活crispr-cas13a系统的反式切割活性，激活的crispr-cas13a系统能够高效、快速的剪切毛细管中dna水凝胶薄膜的交联桥rna，使水凝胶薄膜的通透性增加，不同浓度的靶标rna分子会引起不同程度通透性的改变，进而使一定时间内溶液在毛细管中进入的距离不同，利用溶液在毛细管中的距离便可以对靶标rna分子进行定量检测。本发明可以实现无需核酸扩增、可视化的rna定量检测，本发明将为rna为靶标的分子诊断、疾病检测提供新工具。
44.以上对本技术实施例所提供的一种无核酸扩增可视化的rna定量检测方法，进行了详细介绍。以上实施例的说明只是用于帮助理解本技术的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本技术的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本技术的限制。
45.如在说明书及权利要求书当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可理解，硬件制造商可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求书并不以名称的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求书当中所提及的“包含”、“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含/包括但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续描述为实施本技术的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本技术的一般原则为目的，并非用以限定本技术的范围。本技术的保护范围当视所附权利要求书所界定者为准。
46.还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情
况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还存在另外的相同要素。
47.应当理解，本文中使用的术语“和/或”仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，a和/或b，可以表示：单独存在a，同时存在a和b，单独存在b这三种情况。另外，本文中字符“/”，一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
48.上述说明示出并描述了本技术的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本技术并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述申请构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本技术的精神和范围，则都应在本技术所附权利要求书的保护范围内。