高效吸附多种重金属重组枯草芽孢杆菌及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及重金属吸附技术领域，更具体地，涉及重金属吸附细菌技术领域，特别是指一种高效吸附多种重金属重组枯草芽孢杆菌及其制备方法和应用。


背景技术：

2.中国农田土壤重金属污染总体形势不容乐观，农田土壤重金属超标状况堪忧，粮食安全生产受到威胁。2014年发布的《全国土壤污染状况调查公报》显示，我国耕地土壤点位超标率达19.4％，主要污染物为镉(cd)、砷(as)、镍(ni)和铅(pb)等；农业部对我国140万hm2污水灌溉区域调查发现，土壤重金属超标面积占64.8％。土壤污染具有隐蔽性、累积性、滞后性和不可逆转性等特点，往往难以被人们迅速察觉，但是土壤中重金属的累积会通过作物生长借由食物链转移到人体中，从而危害人体健康。因此，对重金属污染农田土壤进行修复处理已成为亟待解决的环境问题。
3.枯草芽孢杆菌是一种好氧、形成芽孢的革兰氏阳性菌，其分泌能力强，细胞壁结构简单，不含毒素，是非致病性和非侵入性的细菌，被公认为安全的微生物。枯草芽孢杆菌的芽孢可耐受高温、干燥、裂解酶、有毒化学物质、紫外线辐射和极端ph值等，因此可利用芽孢的外壳蛋白(如cotb、cotc、cotx和cotg等)作为载体，在芽孢表面稳定展示异源蛋白或多肽，增强靶蛋白或多肽的功能与稳定性。目前，枯草芽孢杆菌的芽孢表面展示技术(bacillus subtilis spore surface display，bssd)已经被成功地用于药物或抗原的递送、生物催化、污染物的监测以及生物修复等领域。
4.在重金属吸附钝化领域，尽管微生物起到一定的作用，但效果有限，因此亟需开发新的微生物吸附重金属技术。
5.因此，希望提供一种高效吸附多种重金属重组枯草芽孢杆菌，其能够高效吸附多种重金属，从而可以应用于各种重金属污染治理领域，能够显著降低重金属对人类的危害，产生客观的经济效益和社会效益。


技术实现要素：

6.为了克服上述现有技术中的缺点，本发明的一个目的在于提供一种高效吸附多种重金属重组枯草芽孢杆菌，其能够高效吸附多种重金属，从而可以应用于各种重金属污染治理领域，能够显著降低重金属对人类的危害，产生客观的经济效益和社会效益，适于大规模推广应用。
7.本发明的另一目的在于提供一种高效吸附多种重金属重组枯草芽孢杆菌的制备方法，其制备简便快捷，可操作性强，制备的高效吸附多种重金属重组枯草芽孢杆菌能够高效吸附多种重金属，适于大规模推广应用。
8.本发明的另一目的在于提供一种高效吸附多种重金属重组枯草芽孢杆菌的应用，其可以应用于各种重金属污染治理领域，能够显著降低重金属对人类的危害，产生客观的经济效益和社会效益，适于大规模推广应用。
9.为达到以上目的，在本发明的第一方面，提供一种高效吸附多种重金属重组枯草芽孢杆菌，其特点是，所述高效吸附多种重金属重组枯草芽孢杆菌整合有编码重金属吸附融合蛋白的核苷酸序列，所述高效吸附多种重金属重组枯草芽孢杆菌通过所述的编码重金属吸附融合蛋白的核苷酸序列表达所述重金属吸附融合蛋白，所述重金属吸附融合蛋白为枯草芽孢杆菌cotx蛋白、重金属铅高效特异性结合多肽p
pb
、重金属镉高效特异性结合多肽p
cd
、重金属镍高效特异性结合多肽p
ni
和高效吸附多种重金属的组氨酸簇多肽p
his
的融合蛋白，所述枯草芽孢杆菌cotx蛋白的氨基酸序列如seq id no：2所示，所述重金属铅高效特异性结合多肽p
pb
的氨基酸序列如seq id no：4所示，所述重金属镉高效特异性结合多肽p
cd
的氨基酸序列如seq id no：6所示，所述重金属镍高效特异性结合多肽p
ni
的氨基酸序列如seq id no：8所示，所述高效吸附多种重金属的组氨酸簇多肽p
his
的氨基酸序列如seq id no：10所示。
10.较佳地，编码所述枯草芽孢杆菌cotx蛋白的核苷酸序列如seq id no：1所示，编码所述重金属铅高效特异性结合多肽p
pb
的核苷酸序列如seq id no：3所示，编码所述重金属镉高效特异性结合多肽p
cd
的核苷酸序列如seq id no：5所示，编码所述重金属镍高效特异性结合多肽p
ni
的核苷酸序列如seq id no：7所示，编码所述高效吸附多种重金属的组氨酸簇多肽p
his
的核苷酸序列如seq id no：9所示。
11.较佳地，所述重金属铅高效特异性结合多肽p
pb
的数目、所述重金属镉高效特异性结合多肽p
cd
的数目、所述重金属镍高效特异性结合多肽p
ni
的数目以及所述高效吸附多种重金属的组氨酸簇多肽p
his
的数目均为2个。
12.较佳地，所述枯草芽孢杆菌cotx蛋白和所述重金属铅高效特异性结合多肽p
pb
通过刚性连接肽连接，所述重金属镉高效特异性结合多肽p
cd
和所述重金属镍高效特异性结合多肽p
ni
通过柔性连接肽连接。
13.更佳地，所述刚性连接肽为eaaak，所述刚性连接肽的数目为3个，所述柔性连接肽为g4s，所述柔性连接肽的数目为3个。
14.较佳地，所述高效吸附多种重金属重组枯草芽孢杆菌还整合有枯草芽孢杆菌组成型强启动子p
hpaii
，所述枯草芽孢杆菌组成型强启动子p
hpaii
的核苷酸序列如seq id no：11所示，所述枯草芽孢杆菌组成型强启动子p
hpaii
位于所述的编码重金属吸附融合蛋白的核苷酸序列的上游。
15.在本发明的第一方面，提供一种上述的高效吸附多种重金属重组枯草芽孢杆菌的制备方法，其特点是，包括以下步骤：
16.(1)将所述的编码重金属吸附融合蛋白的核苷酸序列克隆于质粒载体中，构建融合表达所述重金属吸附融合蛋白的整合性质粒；
17.(2)对所述的融合表达所述重金属吸附融合蛋白的整合性质粒采用线性化酶酶切进行线性化并采用磷酸酶去掉5
′
粘性末端后转入枯草芽孢杆菌感受态细胞中进行同源重组，筛选得到的阳性克隆即为所述高效吸附多种重金属重组枯草芽孢杆菌。
18.较佳地，在所述步骤(1)中，所述质粒载体为pdl质粒。
19.较佳地，在所述步骤(2)中，所述线性化酶为pstⅰ限制性内切酶，所述磷酸酶为小牛肠碱性磷酸酶。
20.在本发明的第三方面，提供上述的高效吸附多种重金属重组枯草芽孢杆菌在重金
id no：8所示，所述高效吸附多种重金属的组氨酸簇多肽p
his
的氨基酸序列如seq id no：10所示。
29.编码所述枯草芽孢杆菌cotx蛋白的核苷酸序列、编码所述重金属铅高效特异性结合多肽p
pb
的核苷酸序列、编码所述重金属镍高效特异性结合多肽p
ni
的核苷酸序列和编码所述高效吸附多种重金属的组氨酸簇多肽p
his
的核苷酸序列，可以根据需要确定，较佳地，编码所述枯草芽孢杆菌cotx蛋白的核苷酸序列如seq id no：1所示，编码所述重金属铅高效特异性结合多肽p
pb
的核苷酸序列如seq id no：3所示，编码所述重金属镉高效特异性结合多肽p
cd
的核苷酸序列如seq id no：5所示，编码所述重金属镍高效特异性结合多肽p
ni
的核苷酸序列如seq id no：7所示，编码所述高效吸附多种重金属的组氨酸簇多肽p
his
的核苷酸序列如seq id no：9所示。
30.所述重金属铅高效特异性结合多肽p
pb
的数目、所述重金属镉高效特异性结合多肽p
cd
的数目、所述重金属镍高效特异性结合多肽p
ni
的数目以及所述高效吸附多种重金属的组氨酸簇多肽p
his
的数目可以根据需要确定，较佳地，所述重金属铅高效特异性结合多肽p
pb
的数目、所述重金属镉高效特异性结合多肽p
cd
的数目、所述重金属镍高效特异性结合多肽p
ni
的数目以及所述高效吸附多种重金属的组氨酸簇多肽p
his
的数目均为2个。
31.所述枯草芽孢杆菌cotx蛋白和所述重金属铅高效特异性结合多肽p
pb
以及所述重金属镉高效特异性结合多肽p
cd
和所述重金属镍高效特异性结合多肽p
ni
可以直接连接或者通过刚性连接肽或柔性连接肽连接，较佳地，所述枯草芽孢杆菌cotx蛋白和所述重金属铅高效特异性结合多肽p
pb
通过刚性连接肽连接，所述重金属镉高效特异性结合多肽p
cd
和所述重金属镍高效特异性结合多肽p
ni
通过柔性连接肽连接。
32.所述刚性连接肽可以是任何合适的刚性连接肽，所述柔性连接肽可以是任何合适的柔性连接肽，所述刚性连接肽的数目以及所述柔性连接肽的数目可以根据需要确定，更佳地，所述刚性连接肽为eaaak，所述刚性连接肽的数目为2个～5个，所述柔性连接肽为g4s(ggggs)，所述柔性连接肽的数目为2个～4个。优选地，所述刚性连接肽的数目和所述柔性连接肽的数目均为3个。
33.所述高效吸附多种重金属重组枯草芽孢杆菌还可以整合有其它任何合适的核苷酸序列，较佳地，所述高效吸附多种重金属重组枯草芽孢杆菌还整合有枯草芽孢杆菌组成型强启动子p
hpaii
，所述枯草芽孢杆菌组成型强启动子p
hpaii
的核苷酸序列如seq id no：11所示，所述枯草芽孢杆菌组成型强启动子p
hpaii
位于所述的编码重金属吸附融合蛋白的核苷酸序列的上游。从而通过所述枯草芽孢杆菌组成型强启动子p
hpaii
启动所述的编码重金属吸附融合蛋白的核苷酸序列的转录过程。
34.本发明还提供一种上述的高效吸附多种重金属重组枯草芽孢杆菌的制备方法，包括以下步骤：
35.(1)将所述的编码重金属吸附融合蛋白的核苷酸序列克隆于质粒载体中，构建融合表达所述重金属吸附融合蛋白的整合性质粒；
36.(2)对所述的融合表达所述重金属吸附融合蛋白的整合性质粒采用线性化酶酶切进行线性化并采用磷酸酶去掉5
′
粘性末端后转入枯草芽孢杆菌感受态细胞中进行同源重组，筛选得到的阳性克隆即为所述高效吸附多种重金属重组枯草芽孢杆菌。
37.在所述步骤(1)中，所述质粒载体可以是任何合适的质粒载体，较佳地，在所述步
骤(1)中，所述质粒载体为pdl质粒。
38.在所述步骤(2)中，所述线性化酶可以是任何合适的线性化酶，所述磷酸酶可以是任何合适的磷酸酶，较佳地，在所述步骤(2)中，所述线性化酶为pstⅰ限制性内切酶，所述磷酸酶为小牛肠碱性磷酸酶。
39.本发明还提供了上述的高效吸附多种重金属重组枯草芽孢杆菌在重金属吸附钝化处理中的应用。
40.为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
41.实施例1重组工程菌bacillus subtilis wb600/cotx-p
hm
和bacillus subtilis wb800/cotx-p
hm
制备
42.1.基因和引物准备
43.根据枯草芽孢杆菌cotx蛋白(genbank no.:np_389058.1)、重金属铅高效特异性结合多肽p
pb
(rui nian,duck sang kim,et al.2010.chromatographic biopanning for the selection of peptides with high specificity to pb
2+
from phage displayed peptide library[j],journal of chromatography a,1217(2010)5940-5949)、重金属镉高效特异性结合多肽p
cd
(mejare m,ljung s,bulow l,et al.1998.selection of cadmium specific hexapeptides and their expression as ompa fusion proteins in escherichia coli[j].protein engineering,11(6):489-494)、重金属镍高效特异性结合多肽p
ni
(li h,dong w,liu y,et al.2019.enhanced biosorption of nickel ions on immobilized surface-engineered yeast using nickel-binding peptides[j].frontiers in microbiology,10:1254)和高效吸附多种重金属的组氨酸簇多肽p
his
，核苷酸序列分别如seq id no：1、seq id no：3、seq id no：5、seq id no：7和seq id no：9所示，氨基酸序列分别如seq id no：2、seq id no：4、seq id no：6、seq id no：8和seq id no：10所示，采用全基因合成的方法分别合成p
hpaii-cotx基因和重金属结合多肽基因p
hm
基因(编码(eaaak)
3-(p
pb
)
2-(p
cd
)
2-(g4s)
3-(p
ni
)
2-(p
his
)2)(北京擎科生物科技有限公司合成)。基因融合所需的引物如表1所示。
[0044]
表1 p
hpaii-cotx与p
hm
融合引物
[0045]
名称引物序列备注fp1seq id no：12其中ggtacc为kpni酶切位点rp1seq id no：13nafp2seq id no：14narp2seq id no：15其中ggatcc为bamhi酶切位点
[0046]
2.重组工程菌构建
[0047]
整合性质粒pdl/p
hpaii-cotx-p
hm
构建策略如图1所示，具体构建步骤如下：
[0048]
(1)以p
hm
基因为模板，采用fp2和rp2进行pcr扩增，获得p
hm
基因产物(请参见图2中泳道1产物所示)，以p
hpaii-cotx基因为模板，采用fp1和rp1进行pcr扩增，获得p
hpaii-cotx基因产物(请参见图2中泳道2产物所示)。将p
hm
基因产物和p
hpaii-cotx基因产物进行基因融
合，然后以fp1和rp2进行pcr扩增，获得基因产物p
hpaii-cotx-p
hm
(请参见图2中泳道3产物所示，p
hpaii-cotx-p
hm
基因的核苷酸序列见seq id no：16所示，p
hpaii-cotx-p
hm
基因编码的cotx-p
hm
蛋白的氨基酸序列见seq id no：17所示)，即获得带枯草芽孢杆菌组成型强启动子p
hpaii
的编码重金属吸附融合蛋白的核苷酸序列。
[0049]
(2)将基因产物p
hpaii-cotx-p
hm
和pdl质粒均采用限制酶kpnⅰ和bamhi进行消化酶切，分别纯化后采用t4 dna连接酶进行连接，然后转化e.coli jm109感受态细胞，挑取在含有100μg/ml(50～150μg/ml均可)氨苄青霉素抗性的平板上长出的单菌落，提取质粒后进行双酶切验证；
[0050]
(3)将步骤(2)转化成功的e.coli jm109进行培养，采用质粒抽提法纯化带有基因产物p
hpaii-cotx-p
hm
的pdl质粒，然后采用pstⅰ限制酶进行线性化和小牛肠碱性磷酸酶(cip)去除5
′
粘性末端，纯化后转化枯草芽孢杆菌感受态细胞bacillus subtilis wb600和bacillus subtilis wb800细胞；
[0051]
(4)将转化的枯草芽孢感受态细胞接种于含有100μg
·
ml-1
(50～150μg/ml均可)氯霉素lb固体培养基中，然后挑选感受态取单菌落，接种于5ml lb液体培养基中，继续在含有1％淀粉(w/v)的固体lb平板上复筛，喷洒碘液变蓝的菌落即为成功插入枯草芽孢杆菌淀粉酶基因amye的同源重组菌bacillus subtilis wb600/cotx-p
hm
和bacillus subtilis wb800/cotx-p
hm
。
[0052]
(5)将构建的枯草芽孢杆菌重组菌株单菌落转接至种子lb培养基中，于37℃和220r/min培养条件下振荡培养12h。然后将培养得到的种子微生物以5％(v/v)的接种量转接至lb发酵培养基(ph 7.0)中，在30℃和250r/min的条件下振荡培养16h，获得发酵产物bacillus subtilis wb600/cotx-p
hm
和bacillus subtilis wb800/cotx-p
hm
。
[0053]
结果如图2所示，p
hpaii-cotx和p
hm
基因序列成功被pcr扩增，同时上述二者之间通过基因融合技术拼接形成p
hpaii-cotx-p
hm
亦被成功制备。通过第三方测序检测，融合的基因突变准确，无移码突变或定点突变错误，从而可以用于质粒的构建和重组工程菌的构建。同时，对构建成功的bacillus subtilis wb600/cotx-p
hm
和bacillus subtilis wb800/cotx-p
hm
进行基因组抽提，然后对插入基因进行pcr验证，亦证明p
hpaii-cotx-p
hm
成功插入到枯草芽孢杆菌淀粉酶基因amye基因中。
[0054]
实施例2重组工程菌吸附重金属镉试验
[0055]
采用实施例1的枯草芽孢杆菌培养方法，对细胞bacillus subtilis wb600/cotx-p
hm
、bacillus subtilis wb800/cotx-p
hm
、bacillus subtilis wb600和bacillus subtilis wb800分别进行培养，然后离心菌液，去上清液，然后用无菌水吹洗沉淀三次，获得菌体各0.3g。取1000ml摇瓶12个，里面含有200ml浓度为100mg/l的cd
2+
溶液(ph 6.0)，每个细胞3个重复，每个摇瓶放0.1g菌体。将摇瓶于30℃和200r/min的条件下吸附120min。结束后，锥形瓶溶液8000r离心10min，上清cd
2+
使用火焰原子吸收仪测量其浓度。吸附前溶液cd
2+
的浓度为c0，吸附后溶液cd
2+
浓度为c1，体积为v，用于吸附菌体量为m
菌
，则菌体对cd
2+
吸附量计算公式为：(c
0-c1)
×
v/m
菌
。
[0056]
结果表明，bacillus subtilis wb600和bacillus subtilis wb800对cd
2+
的吸附量都约为15mg/g，而bacillus subtilis wb600/cotx-p
hm
、bacillus subtilis wb800/cotx-p
hm
对cd
2+
的吸附量都约为100mg/g。因此，通过枯草芽孢杆菌外层衣壳蛋白cotx将镉
重金属结合多肽展示在细胞外表面，显著提高了枯草芽孢杆菌对重金属cd
2+
的吸附，从而本发明的枯草芽孢杆菌重组工程菌能够应用于重金属cd
2+
污染治理领域。
[0057]
实施例3重组工程菌吸附重金属铅试验
[0058]
采用实施例1的枯草芽孢杆菌培养方法，对细胞bacillus subtilis wb600/cotx-p
hm
、bacillus subtilis wb800/cotx-p
hm
、bacillus subtilis wb600和bacillus subtilis wb800分别进行培养，然后离心菌液，去上清液，然后用无菌水吹洗沉淀三次，获得菌体各0.3g。取1000ml摇瓶12个，里面含有200ml浓度为100mg/l的pb
2+
溶液(ph 5.0)，每个细胞3个重复，每个摇瓶放0.1g菌体。将摇瓶于35℃和200r/min的条件下吸附120min。结束后，锥形瓶溶液8000r离心10min，上清pb
2+
使用火焰原子吸收仪测量其浓度。吸附前溶液pb
2+
的浓度为c0，吸附后溶液pb
2+
浓度为c1，体积为v，用于吸附菌体量为m
菌
，则菌体对pb
2+
吸附量计算公式为：(c
0-c1)
×
v/m
菌
。
[0059]
结果表明，bacillus subtilis wb600和bacillus subtilis wb800对pb
2+
的吸附量都约为17.5mg/g，而bacillus subtilis wb600/cotx-p
hm
、bacillus subtilis wb800/cotx-p
hm
对pb
2+
的吸附量都约为140mg/g。因此，通过枯草芽孢杆菌外层衣壳蛋白cotx将铅重金属结合多肽展示在细胞外表面，显著提高了枯草芽孢杆菌对重金属pb
2+
的吸附，从而本发明的枯草芽孢杆菌重组工程菌能够应用于重金属pb
2+
污染治理领域。
[0060]
实施例4重组工程菌吸附重金属镍试验
[0061]
采用实施例1的枯草芽孢杆菌培养方法，对细胞bacillus subtilis wb600/cotx-p
hm
、bacillus subtilis wb800/cotx-p
hm
、bacillus subtilis wb600和bacillus subtilis wb800分别进行培养，然后离心菌液，去上清液，然后用无菌水吹洗沉淀三次，获得菌体各0.3g。取1000ml摇瓶12个，里面含有200ml浓度为100mg/l的ni
2+
溶液(ph 6.0)，每个细胞3个重复，每个摇瓶放0.1g菌体。将摇瓶于30℃和200r/min的条件下吸附120min。结束后，锥形瓶溶液8000r离心10min，上清ni
2+
使用火焰原子吸收仪测量其浓度。吸附前溶液ni
2+
的浓度为c0，吸附后溶液ni
2+
浓度为c1，体积为v，用于吸附菌体量为m
菌
，则菌体对ni
2+
吸附量计算公式为：(c
0-c1)
×
v/m
菌
。
[0062]
结果表明，bacillus subtilis wb600和bacillus subtilis wb800对ni
2+
的吸附量都约为25.0mg/g，而bacillus subtilis wb600/cotx-p
hm
、bacillus subtilis wb800/cotx-p
hm
对ni
2+
的吸附量都约为170mg/g。因此，通过枯草芽孢杆菌外层衣壳蛋白cotx将镍重金属结合多肽展示在细胞外表面，显著提高了枯草芽孢杆菌对重金属ni
2+
的吸附，从而本发明的枯草芽孢杆菌重组工程菌能够应用于重金属ni
2+
污染治理领域。
[0063]
因此，本发明通过将铅高效特异性结合多肽、镉高效特异性结合多肽、镍高效特异性结合多肽以及高效吸附多种重金属的组氨酸簇多肽与枯草芽孢杆菌crust层cotx蛋白c端融合，然后克隆于pdl质粒载体中，再采用线性化酶酶切进行线性化和磷酸酶去掉5
′
粘性末端后转入枯草芽孢杆菌感受态细胞中进行同源重组，筛选的阳性克隆即为高效吸附多种重金属枯草芽孢重组工程菌。试验证明，本发明的枯草芽孢重组工程菌能高效吸附铅、镉和镍等重金属离子，因而具有客观的经济效益，适合大规模推广。
[0064]
从而，本发明的高效吸附多种重金属重组枯草芽孢杆菌，是采用bssd技术，通过枯草芽孢杆菌外层衣壳展示蛋白cotx作为重金属吸附多肽载体，从而将重金属吸附多肽锚定在芽孢细胞外表面，与野生枯草芽孢杆菌相比，bssd技术显著提高了枯草芽孢杆菌对镉、铅
和镍等重金属的吸附效果。因此，本发明的高效吸附多种重金属重组枯草芽孢杆菌，可以应用于各种重金属污染治理领域，能够显著降低重金属对人类的危害，产生客观的经济效益和社会效益。
[0065]
综上所述，本发明的高效吸附多种重金属重组枯草芽孢杆菌能够高效吸附多种重金属，从而可以应用于各种重金属污染治理领域，能够显著降低重金属对人类的危害，产生客观的经济效益和社会效益，适于大规模推广应用。
[0066]
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。
[0067]
[0068]
[0069]
[0070]
[0071]
[0072]
[0073]
[0074]