一种鲜味肽及其预测与筛选方法

1.本发明涉及一种鲜味肽及其预测与筛选方法，属于生物活性肽领域。


背景技术：

2.作为五种基本口味之一的鲜味，其通常有以下来源，如游离氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)，有机酸(琥珀酸和琥珀酸盐)，核苷酸(肌苷酸和鸟嘌呤苷酸)和鲜味肽。大多数海洋食品都具有独特的鲜味，可作为提取鲜味肽的重要原料。
3.阈值又叫临界值，是指一个效应能够产生的最低值或最高值。菲律宾蛤仔(ruditapes philippinarum)中提取的鲜味肽seek、tylpvh、tgdpek、kemqkn的鲜味阈值较高，如被作为调味料，难以避免使用量高的缺点，使鲜味肽在调味料的应用上丢失广阔的前景。
4.牡蛎是世界上最大的养殖贝类，其养殖区分布在世界各地。在中国，牡蛎是四大经济贝类之一，其养殖区主要分布在北部温带、亚热带和热带水域。近十年来，中国牡蛎产量逐年增长，年产量已达400多万吨。长牡蛎具有味道鲜美，咸鲜可口的优势，是辽宁省传统的牡蛎养殖品种。但现有技术尚未披露牡蛎来源的阈值较低的鲜味肽。
5.另一方面，现有的用于制备或预测鲜味肽的方法存在操作步骤复杂，操作时间长的缺陷，难以有效筛选低阈值的鲜味肽。


技术实现要素：

6.[技术问题]
[0007]
本发明要解决的技术问题是已有的鲜味肽阈值较高，且筛选方法不便利高效。
[0008]
[技术方案]
[0009]
本发明提供一种新型鲜味肽，其氨基酸序列为phe-asn-lys-glu-glu，鲜味阈值仅有0.38mg/ml，且肽鲜味浓郁。该鲜味肽仅由5个氨基酸组成，便于通过工业合成，再进一步开发食用调味料。
[0010]
所述鲜味肽可以用于制备食品调味剂，所述调味剂，包括：酱品类，例如：沙茶酱、豉椒酱、酸梅酱、xo酱等；酱油类，例如：酱油、生抽、虾油、豉油、老抽、蚝油等；汁水类，例如：烧烤汁、卤水汁、喼汁、ok汁等；味粉类，例如：胡椒粉、沙姜粉、大蒜粉、鸡粉等；固体类，例如：鸡精、砂糖、食盐、味精、豆豉等。
[0011]
本发明提供利用牡蛎制备鲜味肽的方法，是利用牡蛎作为原料，采用常压水煮得到粗提液，利用c
18
填料吸附后，用乙醇水溶液洗脱，通过lc-ms/ms鉴定肽的氨基酸序列；利用iumami-scm和分子对接筛选与预测得到鲜味肽。
[0012]
所述方法包括以下步骤：
[0013]
步骤(1)，将牡蛎肉洗净、称重、常压水煮、过滤，将滤液离心，然后将离心所得上清液经低温喷雾干燥得到牡蛎粉，保存在干燥避光的干燥皿内，以待使用；
[0014]
步骤(2)，将牡蛎粉溶解，并加入到装载了c
18
填料的柱子中，混合吸附后，用一定比
例的乙醇水溶液洗脱，将洗脱液进行冷冻干燥；冷冻干燥物经复溶后通过lc-ms/ms分析鉴定全部肽序列；
[0015]
步骤(3)，将已鉴定的肽序列输入到iumami-scm网站中预测鲜味值，去掉具有鲜味可能性低的肽，利用分子对接筛选可以结合鲜味受体的肽，着重参考“cdocker_energy”分值，得到鲜味肽phe-asn-lys-glu-glu。
[0016]
在本发明的某些实施方式中，步骤(1)中将牡蛎肉与蒸馏水按照1:1～1:2g/ml的比例混合，于常压水煮2.5～3.0h，当通过便携式阿贝折光仪检测其固体含量为8～15％时，停止加热，以便充分提取牡蛎中水溶性物质。将水煮后的混合物过80目滤布，保留滤液。
[0017]
在本发明的某些实施方式中，步骤(1)中，所述的离心条件为，在4～10℃下，以3000～5000rpm/min离心3～10min，取上清液，以便低温喷雾干燥时，不会堵塞进样管。
[0018]
在本发明的某些实施方式中，步骤(1)中，所述的低温喷雾干燥条件为：进风口温度130～150℃，风机20～30m3/min，蠕动泵15～20rmp/min，得到的牡蛎粉储存在避光干燥的地方，以待使用。
[0019]
在本发明的某些实施方式中，步骤(2)中，所述的利用c
18
填料提取分级的步骤如下：所得到的牡蛎粉用超纯水溶解，加入活化的c
18
填料中，依次用蒸馏水、20％(v:v)乙醇溶液和乙醇洗脱，蒸馏水、20％(v:v)乙醇溶液和乙醇的用量(ml)是牡蛎粉质量(g)的2～3倍，得到3个组分依次为0％-e、20％-e和100％-e。
[0020]
优选的，所述的c
18
填料的粒径为40～60μm，其活化操作如下：将c
18
填料和乙醇按照1:3g/ml的料液比混合以充分活化填料，再用加入料液比为1:3g/ml的蒸馏水冲洗填料，即得到活化好的c
18
填料。
[0021]
在本发明的某些实施方式中，步骤(2)中，所述的lc-ms/ms的仪器参数设置如下：
[0022]
液相条件：采用分析柱子为acclaim pepmap c
18
分析柱(75μm x 25cm)；进样量3μl；流速300nl/min；a相为0.1％甲酸水溶液；b相为80％乙腈和0.1％甲酸水溶液；柱温为40℃；梯度洗脱条件为0-3min：2％的b相；3-47min：35％的b相；47-59min：100％b相。
[0023]
质谱条件：(1)ms:扫描范围(m/z)：200-1500；分辨率：70,000；agc target：3e6；最大注入时间：60ms；(2)hcd-ms/ms分辨率:17,500；agc target：5e4；最大注入时间：50ms；碰撞能量：27；动态排除时间：20s。
[0024]
步骤(3)中，所述的iumami-scm数据库的网址为http：//camt.pythonanywhere.com/iumami-scm。输入肽序列后，所给出评分≥588.00时，认为此肽具有鲜味；此方法是一种利用一级多肽的疏水性、酸性氨基酸和低分子量等理化性质预测多肽鲜味的预测器。
[0025]
在本发明的某些实施方式中，步骤(3)中，所用的鲜味受体是二聚体t1r1/t1r3，该鲜味异源二聚体t1r1/t1r3受体来源同源建模，其拉曼光谱认为有94.92％在允许区域，符合90％临界评价原则，该模型在二面体分布和空间碰撞方面是合理的。
[0026]
在本发明的某些实施方式中，步骤(3)中，所述的分子对接方式为：ds软件中的cdocker程序，可通过ds中的cdocker程序进行分子对接筛选能有效结合鲜味受体t1r1/t1r3的肽，以
“‑
cdocker_energy”为指标，筛选出此鲜味肽。
[0027]
[有益效果]
[0028]
(1)本发明提供的鲜味肽phe-asn-lys-glu-glu鲜味、甜味更加丰富，鲜味阈值低
至0.38mg/ml，可用于制备调味品或食品添加剂。
[0029]
(2)本发明提供的鲜味肽phe-asn-lys-glu-glu由5个氨基酸组成，是分子量小于800da的短肽，也可通过工业合成的方法大量获得。
[0030]
(3)本发明提供的鲜味肽预测与筛选的操作步骤简单，结合计算机模拟筛选，不依赖复杂技术，可以大量节省人力物力。
附图说明
[0031]
图1为实施例1中oy-w、0％-e、20％-e和100％-e的味道特征图。
[0032]
图2为实施例1中分离肽鉴定的质谱。其中，(a为)fnkee肽，(b)为eeflk肽，(c)为flnqdeear肽。
[0033]
图3为实施例2中合成肽的味觉特征图。其中，(a)为人工感官评定，(b)为电子舌测定。
具体实施方式
[0034]
术语
[0035]
分子对接：是两个或多个分子之间通过几何匹配和能量匹配而相互识别的过程，目的是找到配体分子和受体分子的最佳结合模式。
[0036]
discovery studio 2017r2软件：discovery studio
tm
(简称ds)是专业的生命科学分子模拟软件，ds目前的主要功能包括：蛋白质的表征(包括蛋白-蛋白相互作用)、同源建模、分子力学计算和分子动力学模拟、基于结构药物设计工具(包括配体-蛋白质相互作用、全新药物设计和分子对接)、基于小分子的药物设计工具(包括定量构效关系、药效团、数据库筛选、admet)和组合库的设计与分析等。
[0037]
鲜味的感知是鲜味物质和鲜味受体结合后相互作用，传至大脑的过程。食物的鲜味一般被认为与c类g蛋白偶联受体(gpcr)有关。在鲜味受体中，异质二聚体t1r1/t1r3是鲜味的主要受体。
[0038]
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0039]
下述实施例中的牡蛎购于大连仟和市场，品种为长牡蛎。
[0040]
实施例1鲜味肽的分离、纯化和提取
[0041]
步骤(1)
[0042]
牡蛎粉的制备：将牡蛎肉洗净，与蒸馏水以1:1g/ml的料液比在常温沸水中常压煮3h。当固体含量为10％时，停止加热，待冷却至室温，用80目的滤布过滤，将滤液以3000r/min，在4℃中离心5min。保留上清液，进行低温喷雾干燥，喷雾干燥条件为：进风口温度130℃，风机30m3/min，蠕动泵20rmp/min，即得到牡蛎粉(命名为oy-w)，将牡蛎粉储存在避光干燥的干燥皿中，以待使用。
[0043]
步骤(2)
[0044]
①c18
柱分离。
[0045]
将c
18
填料活化，其活化操作如下：将c
18
填料和乙醇按照1:3g/ml的料液比混合以活化填料，再加入料液比为1:3g/ml的蒸馏水冲洗填料，即得到活化好的c
18
填料。
[0046]
用超纯水将oy-w稀释到20mg/ml，作为样品。然后将样品加入已活化的c
18
填料中，
使样品充分混合吸附，再依次加入料液比为1:3g/ml的蒸馏水、20％(v:v)乙醇溶液和乙醇进行洗脱，得到3个组分，依次命名为0％-e、20％-e和100％-e。
[0047]
②
利用电子舌仪器分析测定牡蛎粉和醇提物的味道特征。
[0048]
电子舌仪器分析。采用超纯水将oy-w、0％-e、20％-e和100％-e样品配成0.6mg/ml的溶液，使用ts-5000z电子舌系统(insert,日本)进行分析，每个样品采集4次数据，自动删去第1次采集的数据。
[0049]
如图1所示，在电子舌的结果中，成分20％-e组分的鲜味是较高的，收集了醇提组分20％-e的组分，冷冻干燥，采用lc-ms/ms鉴定其中肽序列信息。
[0050]
③
20％-e中多肽序列的结构鉴定
[0051]
制样：将20％-e样品溶于0.1％甲酸中，充分溶解，离心，取上清液装入液相瓶中，备用。
[0052]
lc-ms/ms的仪器参数设置如下：
[0053]
液相条件：采用分析柱子为acclaim pepmap c
18
分析柱(75μm x 25cm)；进样量3μl；流速300nl/min；a相为0.1％甲酸；b相为(80％乙腈和0.1％甲酸)；柱温为40℃；梯度洗脱条件为0-3min：2％的b相；3-47min：35％的b相；47-59min：100％b相。
[0054]
质谱条件：(1)ms:扫描范围(m/z)：200-1500；分辨率：70,000；agc target：3e6；最大注入时间：60ms；(2)hcd-ms/ms分辨率:17,500；agc target：5e4；最大注入时间：50ms；碰撞能量：27；动态排除时间：20s。
[0055]
步骤(3)
[0056]
将步骤(2)质谱采集的数据经过peaks studio version 10.6分析和搜库对应物种数据库，设置none酶解。将所有得到的鲜味肽，输入iumami-scm网站预测肽是否具有鲜味。具体地，将所有已鉴定的肽全部输入iumami-scm，在得分大于588.00的鲜味肽中，3-9肽有256条，10-19肽有766条，20-29肽有213条，30-39肽有18条，40-45肽有8条，超过50个氨基酸的只有1条，为57个氨基酸组成的肽。因为，鲜味肽通常是小分子肽。选择scm评分≥696.78，氨基酸数量在4-12之间的13条肽进行分子对接，其信息如下表。
[0057]
表1.肽的分子对接能量和iumami-scm的打分值
[0058]
[0059]
将目标肽与鲜味受体t1r1/t1r3进行分子对接以筛选鲜味肽。具体地，利用同源建模获得鲜味受体t1r1/t1r3的结构，通过ds中的cdocker程序进行分子对接筛选可以有效结合鲜味受体t1r1/t1r3的肽，13条肽的对接能量如表2。
“‑
cdocker_energy”表示肽与t1r1/t1r3之间的亲和力更高。以
“‑
cdocker_energy”为指标，可发现在13个鲜味肽中，flnqdeear、fnkee、fssvtlst和eeflk能量最低，同时综合iumami-scm的打分值，合成flnqdeear、fnkee和eeflk这三条肽，进行味道轮廓的描述，验证鲜味。
[0060]
实施例2鲜味肽的合成与鲜味评价
[0061]
(1)目标肽的固相合成。通过中国肽有限公司采用固相合成法合成了flnqdeear、fnkee和eeflk这3个目标多肽，其纯度不低于95％。
[0062]
(2)利用电子舌仪器分析和人工感官评定测定合成肽的味道特征。
[0063]
采用超纯水将合成肽配制成0.6mg/ml和1mg/ml浓度的溶液，依次分别进行电子舌仪器分析和人工感官评定试验。
[0064]
电子舌分析同实施例1。
[0065]
人工感官评定。感官评定在温度为22.5
±
2.5℃、光照正常的感官分析实验室进行，样品采用10分制进行评估(0表示没有味道，10表示有味道)。鲜、甜、咸、苦、酸的标准品分别为味精溶液(0.35％，w/v)、蔗糖溶液(1.00％，w/v)、氯化钠溶液(0.35％，w/v)、l-异亮氨酸溶液(0.25％，w/v)和柠檬酸溶液(0.08％，w/v)。蒸馏水和标准品溶液的感官强度分别设为0点和5点。采用超纯水将多肽样品配成5mg/ml的溶液，依次呈送给10名感官评定小组成员(4男6女组成，年龄在25-35岁之间)进行感官评定。
[0066]
表2.鲜味肽的序列、滋味特性描述和鲜味阈值
[0067][0068]
(3)鲜味阈值的测定方法
[0069]
将合成的肽以1mg/ml的浓度溶解在蒸馏水中，对肽进行三角测试(两杯为蒸馏水，一杯为样品溶液)测定味觉阈值。将肽溶液用蒸馏水以1:1(v/v)的比例逐步稀释并标记，并按照浓度增加的顺序提交给感官评定小组成员，当小组成员能够刚好品尝到样品味道，并区分其他两杯蒸馏水时，记录此浓度。计算所有小组成员记录浓度的平均值为鲜味肽阈值。
[0070]
结合图3中电子舌和感官评定结果发现，这三条肽都有不同强度的鲜味，其中phe-asn-lys-glu-glu(fnkee，fe-5)的鲜味、甜味更加丰富，且其鲜味值大于0.2％msg溶液，而且其整体味道上更加柔和，更加复杂；并且，此肽的鲜味阈值为0.38mg/ml，远低已知菲律宾蛤仔(ruditapes philippinarum)中具有相似氨基酸长度的鲜味肽，比如：seek(1.00mg/ml)、tylpvh(2.00mg/ml)、tgdpek(2.00mg/ml)、kemqkn(0.99mg/ml)。说明此鲜味肽在调味料的应用上具有广阔的前景。说明本发明利用计算机模拟预测的方法能够有效的鉴定及预测鲜味，具有广阔的应用前景。
[0071]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。