长牡蛎β-tubulin基因的电穿孔基因编辑方法及应用

长牡蛎
β-tubulin基因的电穿孔基因编辑方法及应用
技术领域
1.本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及一种长牡蛎β-tubulin基因的电穿孔基因编辑方法及应用。


背景技术：

2.牡蛎隶属双壳纲，软体动物门，营固着生活，滤食，在全世界各地沿海地区都有分布。牡蛎作为全世界重要的水产养殖经济贝类，肉质鲜美，营养丰富，而且具有一定的药用价值和保健功能。长牡蛎(crassostrea gigas)目前是我国主要的经济贝类养殖种类。
3.基因编辑技术是揭示基因功能最有效的方法，目前基因编辑技术在基因功能研究中已经得到广泛应用，应用最为广泛的是crispr/cas9基因编辑技术，即规律成簇的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats,crispr)。作为一种基因编辑工具，crispr系统能够定点修饰基因组，与talens、zfns基因编辑技术相比，crispr/cas9基因编辑技术因具有操作简单、靶点选择广、成本低和效率高等优点，crispr系统已被广泛应用于药物研制、疾病治疗、动物模型和生物遗传育种等方面。
4.目前crispr/cas9基因编辑技术主要借助显微注射或者电穿孔方法等将sgrna和cas9导入受精卵。显微注射技术，通量比较小，较为费时费力。电穿孔方法有通量大、省时省力的优点。目前海洋经济贝类基因编辑技术仍然发展较为缓慢，有几例报道仅见于胚胎操作较易的腹足类，双壳类仅有两例基因编辑报道。牡蛎受精卵大小在40μm左右，相比于显微注射导入外源物质，选用电穿孔方法进行crispr/cas9基因编辑更高效。


技术实现要素：

5.针对现有技术中存在的问题，本发明要解决并优化牡蛎中电穿孔crispr/cas9基因编辑技术，找到最优参数实现高存活率，高编辑效率；调整sgrna和cas9蛋白用量，降低目前电穿孔方法的sgrna和cas9蛋白使用量；电穿孔方法的优化，降低时间成本和人力成本；提供了β-tubulin基因作为经济贝类基因编辑体系构建标记基因的先例。
6.为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.一种长牡蛎β-tubulin基因的电穿孔基因编辑方法，步骤如下：
8.筛选长牡蛎亲贝，解剖获取卵子和精子，在26℃海水中进行人工授精，精卵比例为3-5:1；授精完成后，观察第一极体出现时间，出现第一极体10min内完成电穿孔实验，对长牡蛎β-tubulin基因进行电穿孔基因编辑；电穿孔实验后的受精卵放入天然海水中，26℃恒温培养；将电穿孔基因编辑处理后的受精卵培育至8h-11h，取样进行基因型和表型突变的检测；
9.其中，100μl电穿孔实验体系包含电转缓冲液60μl，sgrna和cas9蛋白复合物10μl，受精卵30μl；电转缓冲液为使用天然海水配制的0.77m甘露醇溶液；sgrna和cas9蛋白复合物中sgrna与cas9蛋白终浓度为15-45ng/μl；受精卵的浓度为1000个/μl；
10.电穿孔实验参数为36-250v/0.1-50ms。
11.在一个具体的实施例中，所述电穿孔实验参数为36v/10ms；40v/10ms；40v/40ms；40v/50ms；60v/40ms；70v/20ms；80v/25ms；80v/30ms；90v/22ms；200v/0.3ms；250v/0.1ms；优选的为40v/50ms。
12.在一个具体的实施例中，所述sgrna和cas9蛋白复合物中sgrna与cas9蛋白终浓度为15ng/μl、30ng/μl、45ng/μl；优选的为30ng/μl。
13.在一个具体的实施例中，所述sgrna和cas9蛋白复合物由以下方法获得：
14.(1)根据seq id no:1所示的长牡蛎β-tubulin基因的核酸序列，设计长牡蛎β-tubulin基因的两个sgrna位点，靶位点分别如seq id no:2和seq id no:3所示；
15.(2)针对上述两个靶位点，依据sgrna引物设计原则，设计长牡蛎β-tubulin基因sgrna引物分别如seq id no:4和seq id no:5所示；
16.(3)使用特异性引物seq id no:4和seq id no:5与通用引物合成sgrnas的dna模板；进行体外转录获得长牡蛎β-tubulin基因的sgrna1和sgrna2；
17.(4)将sgrna1、sgrna2和cas9蛋白按照浓度配比为1:1:1混合制得sgrna和cas9蛋白复合物。
18.β-tubulin基因作为经济贝类基因编辑体系构建中的标记基因的应用。
19.本发明技术方案的优点：
20.1.通过电穿孔的crispr/cas9基因编辑技术在长牡蛎中实现了β-tubulin基因的编辑，获得了突变基因型和突变表型。
21.2.获得了高幼虫存活率和高编辑效率的电穿孔体系和电穿孔参数。
22.3.获得了高编辑效率的sgrna和cas9浓度，节约了sgrna和cas9的投入量。
23.4.提供了β-tubulin基因作为经济贝类基因编辑体系构建标记基因的先例。
附图说明
24.图1突变型基因型与野生型对照；
25.图2在sgrna1处缺失的突变型峰图；
26.图3β-tubulin基因突变体的原位杂交表型。
具体实施方式
27.在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
28.下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
29.实施例1
30.长牡蛎β-tubulin基因的电穿孔基因编辑方法，步骤如下：
31.(1)长牡蛎受精卵获得
32.挑选适量的亲贝进行人工解剖，获取卵子和精子。在光学显微镜下初步观察活力，以精子剧烈游动，卵子大部分呈现圆形为状态较好。
33.(2)人工授精
34.在26℃海水中进行人工授精，精卵比例为一个卵上结合3-5个精子适宜，观察第一
极体出现时间，大约10min左右出现第一极体，出现第一极体10min内完成电穿孔实验。
35.(3)构建长牡蛎β-tubulin基因的sgrna
36.①
设计sgrna引物
37.根据长牡蛎β-tubulin基因的核酸序列(seq id no:1)，设计长牡蛎β-tubulin基因的两个sgrna位点，靶位点分别如seq id no:2和seq id no:3所示；
38.seq id no:1：
[0039][0040][0041]
sgrna位点1：5
’‑
gggtggtaagtttgagtgta-3’(seq id no:2)；
[0042]
sgrna位点2：5
’‑
ggcatgaagaagtggagacg-3’(seq id no:3)；
[0043]
针对上述靶位点，依据sgrna引物设计原则，设计长牡蛎β-tubulin基因sgrna引物，如下：
[0044]
sgrna1引物：5
’‑
gaaattaatacgactcactatagggtggtaagtttgagtgtagttttagagctagaaatagc-3’(seq id no:4)；
[0045]
sgrna2引物：5
’‑
gaaattaatacgactcactataggcatgaagaagtggagacggttttagagctagaaatagc-3’(seq id no:5)；
[0046]
②
sgrnas dna模板扩增与纯化
[0047]
使用特异性引物sgrna1、sgrna2与通用引物合成sgrnas的dna模板，通用引物序列为：
[0048]
crispr_rev_universal：5
’‑
aaaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgat
[0049]
aacggactagccttattttaacttgctatttctagctctaaaac-3’(seq id no:6)；
[0050]
反应体系为32μl ddh2o,40μl 2
×
primestar max dna(takala),4μl 10μm f primer,4μl10μm r primer；
[0051]
pcr反应条件为：95℃30s；35个循环包含95℃15s，60℃15s，72℃15s；72℃5min。使用sanprep柱式dna胶回收试剂盒(上海上工)纯化sgrnas dna模板。
[0052]
③
sgrna体外转录
[0053]
以纯化后的pcr产物为模板，使用t7体外转录试剂盒(thermo，am1334)转录sgrna，使用rna纯化试剂盒纯化sgrna(rna clean&concentrator-5，zymo)，纯化后sgrna1浓度为2560ng/μl，sgrna2浓度为1400ng/μl。
[0054]
(4)电穿孔实验体系配置
[0055]
100μl电穿孔实验体系包含电转缓冲液60μl，sgrna和cas9蛋白复合物10μl，受精卵30μl(受精卵的浓度约为1000个/μl)。其中，电转缓冲液为使用天然海水配制的0.77m甘露醇溶液；sgrna和cas9蛋白复合物是将sgrna1、sgrna2和cas9蛋白按照浓度配比为1:1:1混合而成；sgrna与cas9蛋白终浓度为30ng/μl。
[0056]
(5)电穿孔实验
[0057]
使用多功能电穿孔系统(btx-ecm830)进行电穿孔实验，将配制好的电穿孔体系转移至1mm电转杯中，电穿孔实验参数为40v/50ms。
[0058]
将电穿孔实验后的受精卵放入天然海水中，26℃恒温培养。
[0059]
(6)突变基因型检测
[0060]
将电穿孔处理后的受精卵培育至8h-11h，取样进行基因型检测。使用化学法裂解提取样品dna，裂解液配方如下：1m kcl 10μl；10％np-40 6μl；20mg/ml proteinase k 5μl；ph 8.00.9m tris-hcl 2.2μl；tween-20 0.6μl；ph 8.0 0.5m edta 0.4μl，定容至200μl，每个反应使用20μl裂解液。收集2-3个编辑后幼虫至一个离心管中，加入20μl裂解液，55℃水浴裂解2h，每隔30min涡旋振荡一次使幼虫裂解充分，98℃水浴5min终止裂解，获得幼虫基因组dna。
[0061]
采用以下引物对扩增包含靶基因位点：
[0062]
gt_f1：5
’‑
accccgacagaatcatgaacactt-3’(seq id no:7)；
[0063]
gt_r1：5
’‑
caaatcgttcatgttggactcg-3’(seq id no:8)；
[0064]
pcr程序设置：95℃5min；95℃30s，57℃30s，72℃1min，35cycles；72℃10min。
[0065]
将pcr产物胶回收纯化，连接转化后挑取单克隆送至测序公司测序。通过f1/r1扩增测序结果检测到363bp的缺失(图1)，在sgrna1处缺失的突变型峰如图2所示。
[0066]
(7)突变体表型检测
[0067]
对上述进行基因编辑实验后的幼虫，进行原位杂交实验，检测突变体的表型，步骤如下
[0068]
依据β-tubulin基因序列设计原位杂交探针引物如下：
[0069]
β-tubulin_insitus_f1：5
’‑
ccagtgcggaaaccagattg-3’(seq id no:9)；
[0070]
β-tubulin_insitus_r1：5
’‑
aagaaagccttacgacggaaca-3’(seq id no:10)；
[0071]
合成原位杂交探针进行原位杂交实验，结果如图3所示；图3中阴影处为长牡蛎担轮幼虫纤毛轮信号，wt：野生型；t：电转处理组。由图3可以看出处理组中纤毛轮位置纤毛发生不同程度缺失。由此可见，β-tubulin基因是在幼虫发育早期就能大量表达的基因，其它常用的经济性状相关的基因，例如肌肉发育相关基因、发育速度相关基因，它们通常是在发育较后期才能大量表达，并且没有早期纤毛发育这种明显的表型体现。因而，在其他经济贝
类中，β-tubulin基因可以作为基因编辑体系构建过程中的标记基因，对该基因进行基因编辑在幼虫发育早期就能进行基因型和表型突变的筛选，对基因编辑体系和参数的筛选和检测具有重要意义。
[0072]
实施例2不同电穿孔实验体系对编辑效率的影响
[0073]
除以下步骤外，其余步骤同实施例1。
[0074]
100μl电穿孔实验体系包含电转缓冲液60μl，sgrna和cas9蛋白复合物10μl，受精卵30μl(受精卵的浓度约为1000个/μl)。其中，电转缓冲液为使用天然海水配制的0.77m甘露醇溶液；sgrna和cas9蛋白复合物是将sgrna1、sgrna2和cas9蛋白按照浓度配比为1:1:1混合而成。
[0075]
分别采用以下三种电穿孔体系对长牡蛎受精卵进行电穿孔基因编辑：
[0076]
体系1：sgrna与cas9蛋白终浓度为15ng/μl；
[0077]
体系2：sgrna与cas9蛋白终浓度为30ng/μl；
[0078]
体系3：sgrna与cas9蛋白终浓度为45ng/μl。
[0079]
采用的电穿孔实验参数为40v/50ms。
[0080]
电穿孔实验完成后，将受精卵放入天然海水中，26℃恒温培养。
[0081]
检测不同电穿孔实验体系对长牡蛎受精卵的编辑效率，结果显示，sgrna和cas9蛋白终浓度为30ng/μl(体系2)时编辑效率最高；体系2的编辑效率分别为体系1和体系3的2倍和1.5倍。
[0082]
实施例3不同电穿孔实验参数对编辑效率和存活率的影响
[0083]
除以下步骤外，其余步骤同实施例1。
[0084]
100μl电穿孔实验体系包含电转缓冲液60μl，sgrna和cas9蛋白复合物10μl，受精卵30μl(受精卵的浓度约为1000个/μl)。其中，电转缓冲液为使用天然海水配制的0.77m甘露醇溶液；sgrna和cas9蛋白复合物是将sgrna1、sgrna2和cas9蛋白按照浓度配比为1:1:1混合而成，sgrna与cas9蛋白终浓度为30ng/μl。
[0085]
使用多功能电穿孔系统(btx-ecm830)进行电穿孔实验，将配制好的电穿孔体系转移至1mm电转杯中，分别采用以下11种电穿孔实验参数对长牡蛎受精卵进行基因编辑：
[0086]
36v/10ms(参数1)；
[0087]
40v/10ms(参数2)；
[0088]
40v/40ms(参数3)；
[0089]
40v/50ms(参数4)；
[0090]
60v/40ms(参数5)；
[0091]
70v/20ms(参数6)；
[0092]
80v/25ms(参数7)；
[0093]
80v/30ms(参数8)；
[0094]
90v/22ms(参数9)；
[0095]
200v/0.3ms(参数10)；
[0096]
250v/0.1ms(参数11)。
[0097]
电穿孔实验完成后，将受精卵放入天然海水中，26℃恒温培养。
[0098]
检测不同电穿孔实验参数对长牡蛎受精卵的编辑效率和幼虫成活率，结果显示，
电转参数为40v/50ms(参数4)时幼虫成活率和编辑效率最高。
[0099]
参数4的幼虫成活率是参数1的1.4倍，是参数2的1.5倍，参数3的1.3倍，参数5的2倍，参数6的2.2倍，参数7的2.8倍，参数8的3倍，参数9的5倍，参数10的6.2倍，参数11的7倍。
[0100]
参数4的编辑效率是参数1的4倍，参数2的3.5倍，参数3的2倍，参数5的2.5倍，参数6的2.8倍，参数7的3倍，参数8的3.5倍，参数9的4倍，参数10的5倍，参数11的5倍。
[0101]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。