长牡蛎β-tubulin基因的电穿孔基因编辑方法及应用

技术特征：
1.一种长牡蛎β-tubulin基因的电穿孔基因编辑方法，其特征在于，步骤如下：筛选长牡蛎亲贝，解剖获取卵子和精子，在26℃海水中进行人工授精，精卵比例为3-5:1；授精完成后，观察第一极体出现时间，出现第一极体10min内完成电穿孔实验，对长牡蛎β-tubulin基因进行电穿孔基因编辑；电穿孔实验后的受精卵放入天然海水中，26℃恒温培养；将电穿孔基因编辑处理后的受精卵培育至8h-11h，取样进行基因型和表型突变的检测；其中，100μl电穿孔实验体系包含电转缓冲液60μl，sgrna和cas9蛋白复合物10μl，受精卵30μl；电转缓冲液为使用天然海水配制的0.77m甘露醇溶液；sgrna和cas9蛋白复合物中sgrna与cas9蛋白终浓度为15-45ng/μl；受精卵的浓度为1000个/μl；电穿孔实验参数为36-250v/0.1-50ms。2.根据权利要求1所述长牡蛎β-tubulin基因的电穿孔基因编辑方法，其特征在于，所述电穿孔实验参数优选的为40v/50ms。3.根据权利要求1所述长牡蛎β-tubulin基因的电穿孔基因编辑方法，其特征在于，所述sgrna和cas9蛋白复合物中sgrna与cas9蛋白终浓度为30ng/μl。4.根据权利要求1-3任一项所述长牡蛎β-tubulin基因的电穿孔基因编辑方法，其特征在于，所述sgrna和cas9蛋白复合物由以下方法获得：(1)根据seq id no:1所示的长牡蛎β-tubulin基因的核酸序列，设计长牡蛎β-tubulin基因的两个sgrna位点，靶位点分别如seq id no:2和seq id no:3所示；(2)针对上述两个靶位点，依据sgrna引物设计原则，设计长牡蛎β-tubulin基因sgrna引物分别如seq id no:4和seq id no:5所示；(3)使用特异性引物seq id no:4和seq id no:5与通用引物合成sgrnas的dna模板；进行体外转录获得长牡蛎β-tubulin基因的sgrna1和sgrna2；(4)将sgrna1、sgrna2和cas9蛋白按照浓度配比为1:1:1混合制得sgrna和cas9蛋白复合物。5.β-tubulin基因作为经济贝类基因编辑体系构建中的标记基因的应用。

技术总结
本发明公开了一种长牡蛎β-tubulin基因的电穿孔基因编辑方法及应用，属于基因编辑技术领域。本发明的长牡蛎β-tubulin基因的电穿孔基因编辑方法是在长牡蛎受精卵出现第一极体10min内完成电穿孔实验，对长牡蛎β-tubulin基因进行电穿孔基因编辑；其中，电穿孔实验体系中sgRNA和Cas9蛋白复合物中sgRNA与Cas9蛋白终浓度为30ng/μL；电穿孔实验参数为40V/50ms。在该条件下，能够获得长牡蛎β-tubulin基因的高编辑效率和幼虫的高存活率，并且可以降低sgRNA和Cas9蛋白使用量；降低时间成本和人力成本。间成本和人力成本。间成本和人力成本。


技术研发人员：张琳琳 张韦 许悦 产久林
受保护的技术使用者：中国科学院海洋研究所
技术研发日：2022.04.12
技术公布日：2022/7/5