技术特征：
1.一种提高博落回中血根碱含量的方法，其特征在于，通过沉默博落回中的mcsmt基因表达或者敲除mcsmt基因，提高博落回中血根碱含量，所述的mcsmt基因全长序列及cds区序列如seq id no.1和2所示。2.根据权利要求1所述的提高博落回中血根碱含量的方法，其特征在于，采用crispr/cas9基因编辑体系敲除mcsmt基因。3.根据权利要求2所述的提高博落回中血根碱含量的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：1)博落回mcsmt基因靶位点引物设计与合成；2)博落回基因敲除载体构建；3)根癌农杆菌介导的博落回遗传转化。4.根据权利要求3所述的提高博落回中血根碱含量的方法，其特征在于，步骤1)博落回mcsmt基因靶位点引物设计与合成：
①
、使用植物基因组编辑靶位点设计软件，在博落回mcsmt基因的编码区避开内含子区域设计一个mcsmt基因靶位点guide1，靶位点的设计原则有：a、靶位点主要包括20个碱基，并且这20个碱基3’端是n为任意碱基的ngg的3个碱基的pam区；b、靶位点选择在基因编码区的前端；c、guide1序列的第一个碱基必须是g，当设计的guide1序列第一个碱基不是g时，将需要在前面加一个g碱基；优选：guide1序列为gccgcggatgtgtgggtact；
②
、以
①
中设计的基因靶位点guide1，结合prgeb32质粒bsa i酶切粘性末端设计靶位点引物对prgeb32-smt-guide 1-oligo 1和prgeb32-smt-guide 1-oligo 2，具体序列prgeb32-smt-guide 1-oligo 1：ggcagccgcggatgtgtgggtact；prgeb32-smt-guide 1-oligo 2：aaacagtacccacacatccgcggc。5.根据权利要求3所述的提高博落回中血根碱含量的方法，其特征在于，步骤2)博落回基因敲除载体构建：
①
、将prgeb32质粒用bsa i酶切成线性化质粒，电泳，回收纯化目标片段；
②
、将合成的靶位点oligos序列进行退火磷酸化反应，获得靶点双链；
③
、将
②
中的靶点双链序列通过连接酶与prgeb32线性化载体相连接，连接产物转染至dh5α感受态细胞细胞中，震荡培养，抗生素筛选，菌落pcr鉴定筛选阳性克隆，鉴定正确重组载体命名为：prgeb32-smt1。6.根据权利要求3所述的提高博落回中血根碱含量的方法，其特征在于，步骤3)根癌农杆菌介导的博落回遗传转化：
①
、将已构建好的重组质粒prgeb32-smt1转化根癌农杆菌，震荡培养，抗生素筛选，得到根癌农杆菌单菌落；
②
、挑选根癌农杆菌单克隆提取质粒，pcr鉴定筛选阳性克隆测序，阳性克隆进行扩大培养，菌液进行博落回外植体侵染；
③
、完成侵染的博落回外植体进行共培养，后进行筛选培养，完成整个组培过程，获得博落回转基因阳性幼苗。7.根据权利要求3所述的提高博落回中血根碱含量的方法，其特征在于，载体构建鉴定引物m13r：gagcggataacaatttcacacagg
prgeb32-r：gacccgaatttgtggacctg。8.根据权利要求3所述的提高博落回中血根碱含量的方法，其特征在于，mcsmt基因靶位点突变鉴定引物：smt-f：atggatgccaaattagaagaagcga；smt-r：tgaaactcaatgacatggagacctt。9.根据权利要求3所述的提高博落回中血根碱含量的方法，其特征在于，基因编辑结果鉴定：农杆菌介导的prgeb32-smt1质粒遗传转化获得再生植株提取总dna，使用引物对smt-f/smt-r扩增包含基因靶位点的目的片段，测序鉴定靶位点碱基突变。10.提高博落回中血根碱含量的方法的应用，其特征在于，用于培育提高血根碱含量的博落回新种质。
技术总结
本发明公开了一种提高博落回中血根碱含量的方法及应用。通过沉默博落回中的McSMT基因表达或者敲除McSMT基因，提高博落回中血根碱含量。本发明采用CRISPR/Cas9基因编辑体系敲除McSMT基因，用于培育提高血根碱含量的博落回新种质。主要针对目前博落回传统育种无法快速获得高血根碱含量种质材料的问题，首次在博落回植物应用基因编辑技术获得具有重要应用价值的高血根碱博落回种质材料。用价值的高血根碱博落回种质材料。用价值的高血根碱博落回种质材料。
技术研发人员：曾建国 孙梦姗 黄鹏 刘薇
受保护的技术使用者：湖南农业大学
技术研发日：2022.04.20
技术公布日：2022/6/24