一种基于RAA-CRISPR系统的新型双重致病性嗜水气单胞菌检测方法及应用

一种基于raa-crispr系统的新型双重致病性嗜水气单胞菌检测方法及应用
技术领域
1.本发明涉及一种基于raa-crispr系统的新型致病性嗜水气单胞菌双重检测方法及应用。


背景技术：

2.嗜水气单胞菌是一种具有广泛致病性的人畜共患病原体，在自然界中广泛分布。对人而言，嗜水气单胞菌是一种新兴的肠道、水源性、食源性致病菌，严重危及人体健康乃至生命；对水生动物而言，它是引起鱼类运动性气单胞菌败血症的主要病原体，感染后死亡率高，对水产养殖业造成沉重经济损失。嗜水气单胞菌的致病性与毒力因子密切相关。据报道，致病性嗜水气单胞菌，如aera
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hlya-、aera-hlya
+
和aera
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hlya
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亚型，能在水、土壤和食物（包括牛奶、鱼、猪肉等）中生长繁殖，并且在冷藏过程中仍会产生主要毒力因子气溶素（aera）和/或溶血素（hlya）。人主要通过暴露的伤口和摄入了受污染的水和食物而感染嗜水气单胞菌，引起的菌血症、坏死性筋膜炎发病急、进展迅速，24小时内达到全身毒性状态，危及生命。早期检测和及时用药可大大缩短治疗周期、降低死亡率，以及降低水产养殖业的经济损失。因此，开发一种简便、快速、特异、灵敏的致病性嗜水气单胞菌检测方法具有极其重要的应用价值。
3.嗜水气单胞菌的传统检测方法有培养法、生化试验、酶联免疫吸附试验、斑点杂交法、血清学分型等。传统培养法鉴定结果准确，但是耗时长，不仅延误治疗时机，而且加大了传播疾病的可能；生化试验操作复杂且生化特征有限，仅能检测典型菌株，容易漏检；酶联免疫吸附试验、斑点杂交法、血清学分型等方法检测灵敏度低。这些方法存在耗时长、操作复杂、灵敏度低等问题，逐渐被新兴技术取代。
4.随着分子生物学的迅猛发展，基于聚合酶链式反应（pcr）技术开发了多种检测方法，可通过对毒力基因扩增来检测嗜水气单胞菌；然而，这些方法需要专门的人员和专用设备，无法实现在非实验场所的检测，限制了其在户外和资源匮乏地区的应用。
5.等温核酸扩增技术raa（recombinase-aid amplification）具有无需热循环仪、反应条件要求低甚至体热10 min即可完成等优点，大大推动了核酸检测技术的发展，已用于包括创伤弧菌和沙门氏菌在内的多种病原的检测，但是这种技术也存在一定局限性，扩增产物常需纯化、电泳分析以判定检测结果，加重了气溶胶污染问题，提高了假阳性风险。此外，当前常见的检测方法由于仅扩增单一基因，导致漏检（靶向单一毒力基因）甚至错检（靶向16s rrna）。
6.综上所述，需要一种简便、快速、准确、灵敏的致病性嗜水气单胞菌的检测方法。


技术实现要素：

7.本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种基于raa-crispr系统的新型致病性嗜水气单胞菌双重检测方法及应用。
8.本发明的第一方面，提供一种基于raa-crispr系统的新型致病性嗜水气单胞菌双重检测方法，所述方法为非疾病诊断目的的，包括以下步骤：（1）对待测标本进行基因组提取，得到待测液；（2）将cas12a和crrna混合物混合孵育形成的核糖核蛋白体；（3）在步骤（2）得到的核糖核蛋白体中避光加入探针和步骤（1）得到的待测液，进行孵育以充分切割探针；（4）用对应于探针的检测方法进行结果测定；其中，步骤（2）中，所述crrna混合物包括识别靶标核酸序列aera的crrna和识别靶标核酸序列hlya的crrna。
9.优选的，步骤（1）中，所述待测标本通过naoh裂解法或试剂盒提取法进行基因组提取。
10.优选的，步骤（2）中，所述crrna混合物包括如seq no 5所示的acr1、如seq no 6所示的acr2、如seq no 7所示的hcr1、如seq no 8所示的hcr2。
11.优选的，步骤（3）中，所述探针为5’6-fam-ttatt-3’bhq1，基于该探针，步骤（4）中的检测方法为uv手电筒或酶标仪。
12.优选的，步骤（2）中，cas12a浓度为400-1000 nm，步骤（3）中，所述探针的浓度为300-900 nm，切割探针的时间为至少20 min。
13.优选的，步骤（2）中，cas12a浓度为600 nm，步骤（3）中，所述探针的浓度为500 nm，切割探针的时间为25 min。
14.本发明的第二方面，提供如上所述的基于raa-crispr系统的新型致病性嗜水气单胞菌双重检测方法用于检测水样或食物样品中的致病性嗜水气单胞菌的应用。
15.本发明的第三方面，提供一种基于raa-crispr系统的新型致病性嗜水气单胞菌双重检测试剂盒，包括细胞裂解体系、cas12a、crrna混合物、探针，所述crrna混合物包括如seq no 5所示的acr1、如seq no 6所示的acr2、如seq no 7所示的hcr1、如seq no 8所示的hcr2。
16.优选的，所述细胞裂解体系包括氢氧化钠溶液，所述探针5’6-fam-ttatt-3’bhq1，所述试剂盒中还包括uv手电筒。
17.本发明通过对致病性嗜水气单胞菌致病基因aera和hlya进行研究分析，首次提出基于raa-crispr系统的新型致病性嗜水气单胞菌双重检测方法，设计并筛选符合检测要求的raa引物组、crrna序列，既通过双重检测手段降低了漏检几率，又实现了对致病性嗜水气单胞菌的简便、快速、准确、灵敏检测。
18.本发明可实现致病性嗜水气单胞菌的在户外或资源匮乏地区的快速检测。应用本发明可避免人们在户外通过暴露的伤口或摄入了受污染的水和食物而感染嗜水气单胞菌。当人们在户外或资源匮乏地区感染嗜水气单胞菌，应用本发明可实现早期检测和及时用药，降低因嗜水气单胞菌致病的死亡率。在水产养殖业，可无需专业人士就可以检测所养殖的水生动物是否感染嗜水气单胞菌，实现尽早干预、处理，降低经济损失以及降低水产养殖的管理成本。
附图说明
19.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。
20.图1为本发明流程示意图；图2为raa引物筛选结果，泳道1-5为aera的raa产物，泳道6-9为hlya的raa产物，泳道10为aera和hlya双重raa产物；图3为以aera-/hlya-、aera
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/hlya-、aera-/hlya
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和aera
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/hlya
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型嗜水气单胞菌基因组为模板，分别对acr1+acr2（图3a）、hcr1+hcr2（图3b）、acr1+acr2+hcr1+hcr2（图3c）同时进行两重raa-crispr/cas12a反应的结果；图4为两重raa-crispr/cas12a反应条件优化结果，a为cas12a浓度的影响，b为ssdna-fq报告子浓度的影响，c为cas12a切割时间；图5为灵敏度评价结果；图6为特异性评价结果；图7为实用性评价结果。
具体实施方式
21.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
22.本发明提供一种基于raa-crispr系统的新型致病性嗜水气单胞菌双重检测方法，如图1所示，包括以下步骤：（1）对待测标本进行基因组提取，得到待测液；（2）将cas12a和crrna混合物混合孵育形成的核糖核蛋白体；（3）在步骤（2）得到的核糖核蛋白体中避光加入探针和步骤（1）得到的待测液，进行孵育以充分切割探针；（4）用对应于探针的检测方法进行结果测定；其中，步骤（2）中，所述crrna混合物包括识别靶标核酸序列aera的crrna和识别靶标核酸序列hlya的crrna。
23.以下可以说明本发明的具体内容。
24.（1）raa引物和crrna设计通过对已公布的嗜水气单胞菌aera和hlya序列比对分析，结合raa引物设计原则，分别设计得到四对raa引物，并进行筛选，各筛选出1对高特异性、高扩增效率的raa引物，如图2所示，最终筛选得到的raa引物序列如表1所示。
25.表1. raa引物序列及产物大小
ttatt-3’bhq1）均需提前分装于pcr管中，每管10 μl，浓度分别为200 nm、200 nm和500 nm。反应步骤如下：1）各取一管cas12a和crrna混合物，合并于一管，振荡离心后置于37℃水浴锅中孵育20 min。
34.）向形成的核糖核蛋白体中避光加入10 μl探针和3 μl模板（两重raa的扩增产物）。37℃孵育35 min以充分切割探针。
35.）用对应于探针的检测方法进行结果测定。
36.以aera-/hlya-、aera
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/hlya-、aera-/hlya
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和aera
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/hlya
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型嗜水气单胞菌基因组为模板，分别对acr1+acr2（图3a）、hcr1+hcr2（图3b）、acr1+acr2+hcr1+hcr2（图3c）同时进行两重raa-crispr/cas12a反应，酶标仪测定各反应的荧光强度，基于检测结果，可以充分说明本发明所提供的crrna是有效的。
37.浓度优化使用荧光探针构建的两重raa-crispr/cas12a方法来优化cas12a浓度。具体步骤如下：1）两重raa反应操作如(1)所示。选用的模板为10
4 copies/μl的嗜水气单胞菌基因组，扩增产物用于后续crispr反应。
38.）同时分别各取6管cas12a和200nm crrna混合物，使cas12a浓度为100 nm、200 nm、300 nm、400 nm、500 nm、1000 nm，合并为6管，振荡离心后置于37℃水浴锅中孵育20 min。
39.）分别向形成的核糖核蛋白复合体中避光加入10 μl 1 μm探针和对应3 μl raa扩增产物，37℃孵育35 min以充分切割探针。
40.）用对应于探针的检测方法进行结果测定。
41.以5、8号引物为raa扩增引物、10
4 copies/μl 嗜水气单胞菌基因组为raa扩增模板、acr1+acr2+hcr1+hcr2为crrna进行两重raa-crispr实验，如图4a所示，cas12a最适浓度是600 nm。
42.报告子浓度优化使用(5)中cas12a浓度优化结果用于优化ssdna-fq报告子浓度，同样使用荧光探针构建的两重raa-crispr/cas12a方法来优化ssdna-fq报告子浓度。具体步骤如下：1) 两重raa反应操作如(1)所示。选用的模板为10
4 copies/μl的嗜水气单胞菌基因组，扩增产物用于后续crispr反应。
43.同时分别各取5管cas12a和200nm crrna混合物，合并为5管，振荡离心后置于37℃水浴锅中孵育20 min。
44.分别向形成的核糖核蛋白复合体中中避光加入10 μl 100 nm、300 nm、500 nm、700 nm和900 nm探针和对应3 μl raa扩增产物，37℃孵育35 min以充分切割探针。
45.用对应于探针的检测方法进行结果测定。
46.如图4b所示，ssdna-fq报告子最适浓度是500 nm。
47.切割时间优化在得出ssdna-fq报告子浓度后，以该浓度及(5)中cas12a优化后浓度来优化cas12a切割时间。同样使用荧光探针构建的两重raa-crispr/cas12a方法来优化cas12a切
割时间。具体步骤如下：1）以10
4 copies/μl的嗜水气单胞菌基因组为模板，进行raa反应如(1)所示。反应结束后放置-20℃中备用。
48.）与此同时，各取10管cas12a和crrna混合物，合并于10管，振荡离心后置于37℃水浴锅中孵育20 min。
49.）孵育结束后，分别将10管核糖核蛋白复合体标记为0 min、5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min、40 min和45 min。
50.）每管加入10 μl荧光探针和3 μl raa产物，振荡离心后，放置37℃水浴锅中。
51.）分别在对应时间进行样品收取放置-20℃，最后一起使用酶标仪检测荧光强度。
52.如图4c所示，cas12a最适切割时间为25 min。
53.两重raa-crispr/cas12a方法的灵敏度评价以5、8号引物为raa扩增引物、acr1+acr2+hcr1+hcr2为crrna，cas12a最适浓度是600 nm, ssdna-fq报告子最适浓度是500 nm和cas12a切割时间为25 min，对0 copy/μl、100、101、102、103、104、105和10
6 copies/μl的aera
+
/hlya-、aera-/hlya
+
和aera
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/hlya
+
型嗜水气单胞菌基因组进行两重raa-crispr反应，得到的产物使用uv手电筒和酶标仪进行测定，以反映两种测定手段的灵敏度。
54.如图5所示，所构建的两重raa-cripsr方法检测灵敏度低至10 copies/μl。
55.两重raa-crispr/cas12a方法的特异性评价选取副溶血弧菌、蜡样芽胞杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、杀鱼爱德华氏菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、创伤弧菌、温和气单胞菌、维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌等16种细菌作为检测对象，评价两重raa-crispr/cas12a方法的特异性。
56.如图6所示，结果表明，所建方法特异性良好，能够检测致病性嗜水气单胞菌。
57.两重raa-crispr/cas12a方法的实用性评价两重raa-crispr/cas12a方法检测模拟样品中嗜水气单胞菌的有无，评价方法的实用性。用棉签擦拭模拟样品表面后，置于50 μl pbs中，晃动5 min以获取细菌溶液。随后，加入200 μl 0.5 m naoh，经混匀后室温放置5 min，所得细菌裂解液用te 1:50稀释。取1 μl稀释液进行两重raa-crispr/cas12a。同时，使用试剂盒提取细菌基因组作为对比试验，来反映用naoh裂解提取基因组的可行性。
58.结果表明，阳性结果的样品编号与人工感染编号一致，吻合度100%（图7a）。将该方法应用于检测人血和大便加标样品，结果也显示了检测人类标本的可行性（图7b）。
59.以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。