一种微生物菌微胶囊的制备方法、微生物菌群的合成方法

本发明涉及微生物菌群，尤其涉及一种微生物菌微胶囊的制备方法、微生物菌群的合成方法。

背景技术：

1、随着合成生物学的迅猛发展，微生物菌群的研究已从单一微生物扩展到多种微生物构成的共生体系。在共生体系中，同种及不同种微生物之间通过代谢作用保持着协同、竞争、互惠共生等关系，赋予了微生物更强的适应性和抗逆能力，同时也具备更多且复杂的生物功能，这是单一微生物无法实现的。然而，合成微生物菌群的基础构成原理、群落中微生物群体之间的相互关系、物质与信息的交换原理及应用基础等问题仍没有很好的阐明，以至于在实验室中构建稳定持续的微生物群落非常困难。

2、区别于天然的微生物群落，合成微生物菌群主要分为有三种，一是经过不同遗传改造的同一种微生物的共培养体系；二是两种不同微生物的共培养体系；三是三种或以上的不同微生物共培养体系。合成微生物菌群成员都经过必要的遗传改造(称为工程菌)，可以通过信号分子交换，相互检测和响应来进行交流；不同工程菌可以通过分工来执行不同的任务，从而使菌群可以执行单一工程菌无法实现的复杂功能。然而，合成微生物菌群在培养过程中由于物种差异带来的营养竞争中的“赢家通吃”，大多数共同培养这些人工微生物群落的尝试都失败了。

3、大多数单一和共培养的微生物生产工艺依赖于大规模的悬浮发酵技术，这些技术不易移植，不可重复使用或不适合按需生产。合成生物学的飞速发展拓展了单菌的功能，然而其功能仍然较为简单及单一，无法实现复杂及多样化的功能。例如，在重组菌株中，复杂的异源途径表达会增加底盘细胞的代谢压力，导致细胞中能量分配失衡，进而对底盘细胞的正常生长和目标产物的生物合成产生不利影响。而作为合成生物学的前沿领域，利用合成功能菌群(synthetic microbial consortia)在为目标产物的生物合成提供多样且适配的表达环境的同时，通过分工协作，有效地分配底盘细胞的代谢负担，使得途径的全局调控更加灵活。然而，对于多菌群的控制是一个未能解决的难题,目前仍然存在三个瓶颈。第一，当前的设计框架无法实现菌群内组分的精准调控，而精准调控是菌群协作效率的决定因素之一；第二，目前的合成功能菌群构建主要是集中在同一物种内，缺乏对跨物种菌群的合成能力；第三，目前构建菌群共存的基础通常以基因线路构建共生关系，需要跨物种的信号交流工具，目前跨物种间的通讯工具严重缺乏，阻碍了多样化的功能菌群构建，即使可利用通讯工具设计群体感应模块，从而控制菌群中的不同微生物密度，这种线路设计需要占用大量的遗传信息负载以及产生代谢负担。基因线路及通讯工具都需要频发根据物种需求修改，方法缺乏普适性。由此，探索跨物种功能菌群及跨物种活体材料的普适的组装机制及合成方法具有重要的理论价值及实际应用意义。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提出了一种微生物菌微胶囊的制备方法、微生物菌群的合成方法，以解决或部分解决现有技术中存在的问题。

2、第一方面，本发明提供了一种微生物菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：

3、将微生物菌接种至培养基中培养，得到菌体；

4、将菌体加入至壳聚糖溶液中得到悬浮液；

5、将悬浮液注入至电喷雾设备的注射器内，以三聚磷酸钠溶液为接收液，通过电喷雾方法制备得到包裹微生物菌的微胶囊。

6、优选的是，所述的微生物菌微胶囊的制备方法，所述壳聚糖溶液的配制方法为：将壳聚糖加入至质量浓度为0.5～2％的冰醋酸溶液中混合均匀即得壳聚糖溶液，所述壳聚糖溶液的质量浓度为1～3％。

7、优选的是，所述的微生物菌微胶囊的制备方法，所述三聚磷酸钠溶液的质量浓度为3～7％。

8、优选的是，所述的微生物菌微胶囊的制备方法，电喷雾过程中控制的工艺参数为：电压为2～20kv、接收距离为5～20cm、喷头孔径为0.1～0.3mm；

9、在电喷雾方法制备得到包裹微生物菌的微胶囊过程中，还对三聚磷酸钠溶液进行搅拌，搅拌速率为200～800rpm。

10、第二方面，本发明还提供了一种微生物菌群的合成方法，包括以下步骤：

11、提供至少两种微生物菌；

12、分别按照所述的制备方法制备得到包裹微生物菌的微胶囊；

13、再将包裹不同微生物菌的微胶囊共同培养即完成微生物菌群的合成。

14、优选的是，所述的微生物菌群的合成方法，所述微生物菌包括大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、谷氨酸棒杆菌、蓝细菌、常表达绿色荧光蛋白的酿酒酵母重组菌株、常表达红色荧光蛋白的大肠杆菌重组菌株、产生群体感应分子的大肠杆菌重组菌株、常表达红色荧光蛋白的谷氨酸棒杆菌重组菌株、甲醇诱导表达rh-gh的毕赤酵母重组菌株、甲醇诱导表达rh-pon1的毕赤酵母重组菌株、蓝色荧光蛋白表达的大肠杆菌重组菌株、依据密度自主裂解并表达β-内酰胺酶的大肠杆菌重组菌株、群体感应分子信号接收的酿酒酵母重组菌株中的至少两种。

15、优选的是，所述的微生物菌群的合成方法，所述常表达绿色荧光蛋白的酿酒酵母重组菌株的制备方法为：将绿色荧光蛋白基因连接到常表达启动子ptdh3下游并与酿酒酵母基因组同源臂上下游连接，构建得到表达载体，将表达载体通过电转化法转入至酿酒酵母基因组中，即得常表达绿色荧光蛋白的酿酒酵母重组菌株；

16、所述常表达红色荧光蛋白的大肠杆菌重组菌株的制备方法为：将红色荧光蛋白基因构建到含有attb同源位点的大肠杆菌整合载体上，表达载体通过电转化法转入至大肠杆菌基因组中即得常表达红色荧光蛋白的大肠杆菌重组菌株；

17、所述产生群体感应分子的大肠杆菌重组菌株的制备方法为：将高丝氨酸内酯的基因lasi连接到阿拉伯糖诱导型启动子下游并克隆至pbad质粒构建表达载体，将表达载体通过电转化法转入至大肠杆菌基因组中即得产生群体感应分子的大肠杆菌重组菌株；

18、所述常表达红色荧光蛋白的谷氨酸棒杆菌重组菌株的制备方法为：以穿梭质粒pec-xk99e作为质粒骨架，将其上的乳糖操纵子替换成常表达启动子peftu，并将红色荧光蛋白基因连接至peftu下游构建红色荧光蛋白表达载体，将表达载体通过电转化法转入至谷氨酸棒杆菌基因组中即得常表达红色荧光蛋白的谷氨酸棒杆菌重组菌株；

19、所述甲醇诱导表达rh-gh的毕赤酵母重组菌株的制备方法为：将重组人生长素基因构建到表达载体ppiczα-a的α-factor信号肽下游形成分泌表达载体；通过核酸内切酶sacⅰ将分泌表达载体酶切线性化后，使用电转化法转入至毕赤酵母基因组中即得甲醇诱导表达rh-gh的毕赤酵母重组菌株。

20、优选的是，所述的微生物菌群的合成方法，所述甲醇诱导表达rh-pon1的毕赤酵母重组菌株的制备方法为：将重组人对氧磷酶基因构建到表达载体ppiczα-a的α-factor信号肽下游形成分泌表达载体；通过核酸内切酶sacⅰ将分泌表达载体酶切线性化后，使用电转化法转入至毕赤酵母基因组中即得甲醇诱导表达rh-pon1的毕赤酵母重组菌株；

21、所述蓝色荧光蛋白表达的大肠杆菌重组菌株的制备方法为：将蓝色荧光蛋白基因克隆至携带乳糖操纵子的表达载体pacyc184中获得蓝色荧光蛋白表达载体，通过电转化方法将表达载体转入至大肠杆菌基因组中即得蓝色荧光蛋白表达的大肠杆菌重组菌株；

22、所述依据密度自主裂解并表达β-内酰胺酶的大肠杆菌重组菌株的制备方法为：将致使细胞裂解的e蛋白基因连接到诱导型启动子pluxi下游并克隆至ptu2s-a质粒构建自裂解表达载体；将β-内酰胺酶基因克隆至携带乳糖操纵子的表达载体pacyc184中获得蛋白表达质粒，将蛋白表达质粒与自裂解表达载体通过电转化方法转入至大肠杆菌基因组中，即得依据密度自主裂解的大肠杆菌重组菌株；

23、所述群体感应分子信号接收的酿酒酵母重组菌株的制备方法为：将表达转录激活因子的基因lasr连接到脱水四环素诱导表达启动子pteto下游并克隆至pesc-ura质粒构建表达载体；然后将黄色荧光蛋白基因连接到诱导表达启动子plaso下游并克隆至pesc-leu质粒构建表达载体；同时将两个表达载体通过电转化方法转入酿酒酵母基因组中，即得群体感应分子信号接收的酿酒酵母重组菌株。

24、优选的是，所述的微生物菌群的合成方法，若所述微生物菌包括大肠杆菌、产生群体感应分子的大肠杆菌重组菌株、蓝色荧光蛋白表达的大肠杆菌重组菌株、常表达红色荧光蛋白的大肠杆菌重组菌株、依据密度自主裂解并表达β-内酰胺酶的大肠杆菌重组菌株中的任一种，则将微生物菌接种至培养基中培养得到菌体具体为：将微生物菌接种至lb培养基中，在36～38℃下于180～220rpm的摇床过夜培养，离心，即得菌体；

25、若所述微生物菌包括酿酒酵母、毕赤酵母、常表达绿色荧光蛋白的酿酒酵母重组菌株、甲醇诱导表达rh-gh的毕赤酵母重组菌株、甲醇诱导表达rh-pon1的毕赤酵母重组菌株、群体感应分子信号接收的酿酒酵母重组菌株中的任一种，则将微生物菌接种至培养基中培养得到菌体具体为：将微生物菌接种至ypd培养基和/或sc培养基中，在29～31℃下于180～220rpm的摇床培养20～28h，离心，即得菌体；

26、若所述微生物菌包括谷氨酸棒杆菌、常表达红色荧光蛋白的谷氨酸棒杆菌重组菌株中的任一种，则将微生物菌接种至培养基中培养得到菌体具体为：将微生物菌接种至bhi培养基中，在29～31℃下于180～220rpm的摇床过夜培养，离心，即得菌体。

27、优选的是，所述的微生物菌群的合成方法，若所述微生物菌包括常表达绿色荧光蛋白的酿酒酵母重组菌株、常表达红色荧光蛋白的大肠杆菌重组菌株，则将包裹不同微生物菌的微胶囊共同培养具体为：将包裹不同微生物菌的微胶囊接种于lb和sc混合培养基中于29～31℃下培养；

28、若所述微生物菌包括甲醇诱导表达rh-pon1的毕赤酵母重组菌株、依据密度自主裂解的β-内酰胺酶表达大肠杆菌重组菌株，则将包裹不同微生物菌的微胶囊共同培养具体为：将包裹不同微生物菌的微胶囊接种于bmgy培养基中，在29～31℃下于180～220rpm的摇床培养；

29、若所述微生物菌包括产生群体感应分子的大肠杆菌重组菌株、群体感应分子信号接收的酿酒酵母重组菌株，则将包裹不同微生物菌的微胶囊共同培养具体为：将包裹不同微生物菌的微胶囊接种于lb和sc混合培养基中，同时加入诱导剂，于29～31℃下培养；

30、若所述微生物菌包括常表达绿色荧光蛋白的酿酒酵母重组菌株、常表达红色荧光蛋白的谷氨酸棒杆菌重组菌株、蓝色荧光蛋白表达的大肠杆菌重组菌株，则将包裹不同微生物菌的微胶囊共同培养具体为：将包裹不同微生物菌的微胶囊接种于lb和sc混合培养基中于29～31℃下培养。

31、本发明的一种微生物菌微胶囊的制备方法、微生物菌群的合成方法，相对于现有技术具有以下有益效果：

32、本发明的微生物菌微胶囊的制备方法，通过将微生物菌进行培养得到菌体；再将菌体加入至壳聚糖溶液中得到悬浮液，以三聚磷酸钠溶液为接收液，通过电喷雾方法制备得到包裹微生物菌的微胶囊；利用壳聚糖与三聚磷酸钠发生交联反应即形成包裹微生物菌的微胶囊，三维交联结构的微胶囊隔离不同的微生物菌；微胶囊的半透膜性质允许营养物质、代谢产物以及目标蛋白的输送及目标蛋白的运输，保证了菌群间信号传递以及底物传输的需求；但微胶囊的三维交联结构限制了微生物的运动；再将包裹不同微生物菌的微胶囊共同培养即形成微生物菌群，三维交联结构的微胶囊隔离不同的微生物菌，在不同的物种间建立屏障，因此，最终菌群的组成可通过调整不同物种的微胶囊数量进行精确调控，通过融合不同物种的微生物，可实现具有分工及通信、光能自养等一系列跨物种菌群的组装。