一种银屑病基因筛查试剂盒及其检测方法

1.本发明涉及银屑病基因筛查技术领域，具体为一种银屑病基因筛查试剂盒及其检测方法。


背景技术：

2.银屑病是一种常见的、慢性的、免疫介导的炎症性皮肤疾病，没有明确的病因，银屑病分型包括斑块性银屑病、点滴型银屑病、红皮性银屑病和脓疱性银屑病，其中绝大部分患者是患有慢性斑块型银屑病，经典的临床表现是被银色鳞片覆盖的、明确划分的红斑与红斑性瘙痒斑块。银屑病的发病率在西方的发达国家极高，在亚洲、非洲和太平洋的发展中国家相对较低，但均呈增长趋势。我国银屑病患者数量、年龄标准发病率、发病率和年龄标准发病率均呈持续增长趋势。银屑病多发于青壮年，春冬季节易复发或加重，严重者会发展为银屑病关节炎，病情迁延，难以彻底治愈；而且，患者有更高的风险伴发其他慢性疾病，如代谢综合征、心血管疾病、焦虑和抑郁、非酒精性脂肪肝、克隆恩病、淋巴瘤等。银屑病对患者的生活造成了极大的困扰，其疾病状态严重危害患者的心理和精神健康，影响到患者的社会工作和活动的参与，这些使得患者身心受到双重折磨，生活质量严重下降，也给其家庭和社会带来了沉重的经济负担。虽然银屑病的全身治疗已经取得了很大进展，但对更有效的局部治疗和更广泛使用生物仿制药的需求仍未得到满足,目前治疗方法也难以做到根治，因此对于银屑病的早期预防和筛查尤其重要。
3.皮肤组织病理学是银屑病的传统诊断金标准。由于这种方法需要由专门的组织学家来进行，包括侵入性皮肤活检、活检处理和分析，因此这是一种资源密集型的方法，需要训练有素的医疗保健专业人员。在很多情况下，这种诊断方法可能很难实施，非紧急病例通常需要几周时间。这种情况会耽误对患者的治疗。同时，对于不属于典型斑块型银屑病或表现出微小病理的病变，会存在诊断挑战；同时，出现在足底、耳后、外耳道和头皮的病变，对于全科医生和训练有素的皮肤科医生来说也可能是一个挑战，尤其是皮肤褶皱处的病变常被误诊为真菌感染。因而我们认为可以发明一种更加高效的银屑病筛查方法。
4.目前的研究表明，银屑病是一种具有多因素遗传模式的复杂疾病，可由遗传、免疫力、感染和多种环境引起，其遗传因素解释了约70％的疾病易感性。个体的遗传背景可以与他们的银屑病易感性有关。在遗传学中，多种人类白细胞抗原(hla)基因与发生银屑病的风险最为密切相关，尤其是hla-c*06：02。在过去10年里，银屑病的大规模全基因组关联研究(gwas)大大增加了人们已知的银屑病易感性相关的基因位点数量(n》80)。尽管gwas对牛皮癣的研究做出了巨大贡献，但在gwas中，即使是基因组中最重要的位点效应也不大，而且这些重要的结果加在一起，只能解释一小部分预测的遗传变异，这被称为遗传度缺失问题。遗传度缺失的其中一种解释便是多个易感基因组合所带来的遗传度。银屑病作为一种多基因参与的常见疾病，其发病是由多个微效基因累加作用，并在特定环境诱发下发生，每一个易感基因/位点对疾病的发生仅有微弱的作用，而多个微弱的易感基因联合效应可能是银屑病发病的致病原因。


技术实现要素：

5.针对上述存在的技术不足，本发明的目的是提供一种银屑病基因筛查试剂盒，应用间接法原理检测人血清或血浆样品中的银屑病易感基因的表达情况，从而实现银屑病的早期筛查。
6.基于复杂疾病中的两个遗传学规律：一是复杂的疾病是由特定多个基因的综合效应共同作用引起的；二是复杂疾病的总体患病率近似等于所有致病基因型模式频率的综合。根据银屑病基因组合研究结果确定了由133个不同基因组成的303个基因组合，包括620个基因型组合，针对其包含的313个位点，使用agena平台结合多重pcr技术设计出银屑病易感基因捕获试剂盒。
7.本发明提供一种银屑病基因筛查试剂盒，包括以下成分：
8.0.5ml pcr buffer
9.0.4ml 25mm mgcl2
10.0.1ml 25mm dntp mix
11.0.1ml 5u/μl hotstar taq
12.1ml pcr primer mix
13.0.17ml 10x sap buffer
14.0.3ml 1.7u/ul sap酶
15.0.94ml extend primer mix 1or 2
16.0.2ml iplex buffer plus
17.0.2ml iplex终止子
18.0.041ml iplex酶
19.80ml clean resin树脂
20.80ml超纯水
21.第一轮扩增引物0.5pmol/每条
22.第二轮扩增引物0.5pmol/每条。
23.还涉及银屑病基因筛查的检测方法，使用权利要求1所述的试剂盒，其具体步骤如下：
24.(1)dna提取：使用wizard genomic dna purification kit(promega) 试剂盒提取血样中的dna，用分光光度计定量，琼脂糖凝胶电泳质检，基因组 dna电泳条带通常不小于20kb，质检合格的dna将浓度调整到50ng/μl，转移至384孔板，-20℃储存备用；
25.(2)pcr扩增：在一个新的1.5ml ep管中配制pcr master mix溶液， pcr master mix溶液按体积配制如下：
26.pcr mix对每个反应体系，μl10
×
pcr buffer0.5mgcl2(25mm)0.4dntp mix(25mm)0.1hotstar taq(5u/μl)0.1water1.9pcr primer mix1
总体积4
27.使用24通道加样器，调节加样体积为4μl，在384孔板的每个加样孔中加入pcr master mix液，该384孔板即为pcr反应板；取出已经制备好的dna 样品384孔板，使用24通道加样器，调节加样体积为1μl，每个5μl pcr 反应体系中包含模板dna 20-50ng，hotstar taq 0.5u，每条扩增引物0.5pmol， 0.1μl的25mm dntps；在兼容384孔板的pcr仪上设定pcr反应条件为：94℃ 4分钟；94℃20秒,56℃30秒，72℃1分钟，45个循环；72℃3分钟；4℃保持；将384孔pcr反应板放置于pcr仪上，启动pcr反应；
28.(3)pcr产物碱性磷酸酶处理：在pcr反应结束后，将pcr产物用sap (shrimp alkaline phosphatase，虾碱性磷酸酶)处理，以去除体系中游离的dntps；配制碱性磷酸酶处理反应液，sap mix，按体积配制如下：
[0029][0030][0031]
使用24通道加样器，调节加样体积为2μl，将sap mix加入384孔pcr 反应板，对于每个碱性磷酸酶处理反应孔，反应体系总体积为7μl，其中pcr 产物5μl，sap混合液2μl(sap 0.5u,buffer 0.17μl)；将384孔板放置在兼容384孔板的pcr仪上，设定pcr反应条件：37℃40分钟；85℃5分钟； 4℃维持，启动pcr仪进行碱性磷酸酶处理；
[0032]
(4)单碱基延伸：在碱性磷酸酶处理结束后，进行单碱基延伸反应，反应体系总体积9μl；配制单碱基延伸反应液，extend mix，按体积配制如下：
[0033]
extend mix对每个反应，μlwater0.619extend primer mix 1or 20.94iplex buffer plus0.2iplex终止子0.2iplex酶0.041总体积2
[0034]
使用24通道加样器，调节加样体积为2μl，将extend mix对应加入384孔反应板。对于每个反应孔，单碱基延伸反应体系包含sap处理后pcr 产物7μl及extend mix液2μl(其中各延伸反应引物混合物0.94μl， iplex酶0.041μl,延伸混合物0.2μl)；将384孔板放置在兼容384孔板的pcr仪上，设定pcr反应条件：
[0035]
i.94℃for 30seconds
[0036]
ii.94℃for 5seconds
[0037]
iii.52℃for 5seconds
[0038]
iv.80℃for 5seconds
[0039]
v.goto iii,4more times
[0040]
vi.goto ii,39more times
[0041]
vii.72℃for 3minutes
[0042]
vii.4℃forever；
[0043]
启动pcr仪进行单碱基延伸反应；
[0044]
(5)树脂纯化：将clean resin树脂平铺到6mg的树脂板中，加16μl水到延伸产物的对应孔内，将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜，低速垂直旋转30分钟,使树脂与反应物充分接触，离心使树脂沉入孔底部；
[0045]
(6)芯片点样：启动massarray nanodispenser rs1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至384孔spectrochip(sequenom)芯片上。
[0046]
(7)质谱检测：将点样后的spectrochip芯片使用maldi-tof (matrix-assisted laser desorption/ionization
–
time of fligh，基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱)分析，检测结果使用typer 4.0软件 (sequenom)分型并输出结果。
[0047]
本发明的有益效果在于：本发明中的试剂盒为体外诊断用试剂，应用间接法原理检测人血清或血浆样品中的银屑病易感基因的表达情况，从而实现银屑病的早期筛查，为临床中预测发病、鉴别诊断、分层治疗提供方向。
具体实施方式
[0048]
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0049]
实施例1，根据银屑病基因组合研究结果确定了由133个不同基因组成的 303个基因组合，包括620个基因型组合，针对其包含的313个位点，具体如下表所示：
[0050]
银屑病基因组合：
[0051]
[0052]
[0053]
[0054]
[0055]
[0056]
[0057]
[0058]
[0059]
[0060]
[0061]
[0062]
[0063][0064]
根据上述基因，设计的检测引物如下：
[0065]
[0066]
[0067]
[0068]
[0069]
[0070]
[0071]
[0072][0073]
一种银屑病基因筛查试剂盒，包括以下成分：
[0074]
0.5ml pcr buffer
[0075]
0.4ml 25mm mgcl2
[0076]
0.1ml 25mm dntp mix
[0077]
0.1ml 5u/μl hotstar taq
[0078]
1ml pcr primer mix
[0079]
0.17ml 10x sap buffer
[0080]
0.3ml 1.7u/ul sap酶
[0081]
0.94ml extend primer mix 1or 2
[0082]
0.2ml iplex buffer plus
[0083]
0.2ml iplex终止子
[0084]
0.041ml iplex酶
[0085]
80ml clean resin树脂
[0086]
80ml超纯水
[0087]
第一轮扩增引物0.5pmol/每条
[0088]
第二轮扩增引物0.5pmol/每条。
[0089]
还涉及银屑病基因筛查的检测方法，使用权利要求1所述的试剂盒，其具体步骤如
下：
[0090]
(1)dna提取：使用wizard genomic dna purification kit(promega) 试剂盒提取血样中的dna，用分光光度计定量，琼脂糖凝胶电泳质检，基因组 dna电泳条带通常不小于20kb，质检合格的dna将浓度调整到50ng/μl，转移至384孔板，-20℃储存备用；
[0091]
(2)pcr扩增：在一个新的1.5ml ep管中配制pcr master mix溶液， pcr master mix溶液按体积配制如下：
[0092]
pcr mix对每个反应体系，μl10
×
pcr buffer0.5mgcl2(25mm)0.4dntp mix(25mm)0.1hotstar taq(5u/μl)0.1water1.9pcr primer mix1总体积4
[0093]
使用24通道加样器，调节加样体积为4μl，在384孔板的每个加样孔中加入pcr master mix液，该384孔板即为pcr反应板；取出已经制备好的dna 样品384孔板，使用24通道加样器，调节加样体积为1μl，每个5μl pcr 反应体系中包含模板dna 20-50ng，hotstar taq 0.5u，每条扩增引物0.5pmol， 0.1μl的25mm dntps；在兼容384孔板的pcr仪上设定pcr反应条件为：94℃ 4分钟；94℃20秒,56℃30秒，72℃1分钟，45个循环；72℃3分钟；4℃保持；将384孔pcr反应板放置于pcr仪上，启动pcr反应；
[0094]
(3)pcr产物碱性磷酸酶处理：在pcr反应结束后，将pcr产物用sap (shrimp alkaline phosphatase，虾碱性磷酸酶)处理，以去除体系中游离的dntps；配制碱性磷酸酶处理反应液，sap mix，按体积配制如下：
[0095]
sap mix对每个反应体系，μlwater1.53sap buffer(10x)0.17sap酶(1.7u/ul)0.3总体积2
[0096]
使用24通道加样器，调节加样体积为2μl，将sap mix加入384孔pcr 反应板，对于每个碱性磷酸酶处理反应孔，反应体系总体积为7μl，其中pcr 产物5μl，sap混合液2μl(sap 0.5u,buffer 0.17μl)；将384孔板放置在兼容384孔板的pcr仪上，设定pcr反应条件：37℃40分钟；85℃5分钟； 4℃维持，启动pcr仪进行碱性磷酸酶处理；
[0097]
(4)单碱基延伸：在碱性磷酸酶处理结束后，进行单碱基延伸反应，反应体系总体积9μl；配制单碱基延伸反应液，extend mix，按体积配制如下：
[0098]
extend mix对每个反应，μlwater0.619extend primer mix 1or 20.94iplex buffer plus0.2
iplex终止子0.2iplex酶0.041总体积2
[0099]
使用24通道加样器，调节加样体积为2μl，将extend mix对应加入384孔反应板。对于每个反应孔，单碱基延伸反应体系包含sap处理后pcr 产物7μl及extend mix液2μl(其中各延伸反应引物混合物0.94μl，iplex酶0.041μl,延伸混合物0.2μl)；将384孔板放置在兼容384孔板的pcr仪上，设定pcr反应条件：
[0100]
i.94℃for 30seconds
[0101]
ii.94℃for 5seconds
[0102]
iii.52℃for 5seconds
[0103]
iv.80℃for 5seconds
[0104]
v.goto iii,4more times
[0105]
vi.goto ii,39more times
[0106]
vii.72℃for 3minutes
[0107]
vii.4℃forever；
[0108]
启动pcr仪进行单碱基延伸反应；
[0109]
(5)树脂纯化：将clean resin树脂平铺到6mg的树脂板中，加16μ l水到延伸产物的对应孔内，将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜，低速垂直旋转30分钟,使树脂与反应物充分接触，离心使树脂沉入孔底部；
[0110]
(6)芯片点样：启动massarray nanodispenser rs1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至384孔spectrochip(sequenom)芯片上。
[0111]
(7)质谱检测：将点样后的spectrochip芯片使用maldi-tof (matrix-assisted laser desorption/ionization
–
time of fligh，基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱)分析，检测结果使用typer 4.0软件 (sequenom)分型并输出结果。
[0112]
注意事项：
[0113]
1、操作前必须先将试剂盒平衡至室温；
[0114]
2、检测剩余的板条应密封保存，试剂盒开启后尽量在一个月内用完；
[0115]
3、不同批号的试剂不得混用；
[0116]
4、凡是染菌、溶血或高血脂的待检血清可能引起错误结果，应重新采样复检；
[0117]
5、任何临床样本都应作为具有传染性样品对待。
[0118]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。