技术特征：
1.一种银屑病基因筛查试剂盒，其特征在于，包括以下成分：0.5ml pcr buffer0.4ml 25mm mgcl20.1ml 25mm dntp mix0.1ml 5u/μl hotstar taq1ml pcr primer mix0.17ml 10x sap buffer0.3ml 1.7u/ul sap酶0.94ml extend primer mix 1or 20.2ml iplex buffer plus0.2ml iplex终止子0.041ml iplex酶80ml clean resin树脂80ml超纯水第一轮扩增引物0.5pmol/每条第二轮扩增引物0.5pmol/每条；所述第一轮扩增引物为上游引物、下游引物；所述第二轮扩增引物为单碱基延伸引物。2.银屑病基因筛查的检测方法，其特征在于使用权利要求1所述的试剂盒，其具体步骤如下：(1)dna提取：使用wizard genomic dna purification kit(promega)试剂盒提取血样中的dna，用分光光度计定量，琼脂糖凝胶电泳质检，基因组dna电泳条带通常不小于20kb，质检合格的dna将浓度调整到50ng/μl，转移至384孔板，-20℃储存备用；(2)pcr扩增：在一个新的1.5ml ep管中配制pcr master mix溶液，pcr master mix溶液按体积配制如下：pcr mix对每个反应体系，μl10
×
pcr buffer0.5mgcl2(25mm)0.4dntp mix(25mm)0.1hotstar taq(5u/μl)0.1water1.9pcr primer mix1总体积4使用24通道加样器，调节加样体积为4μl，在384孔板的每个加样孔中加入pcr master mix液，该384孔板即为pcr反应板；取出已经制备好的dna样品384孔板，使用24通道加样器，调节加样体积为1μl，每个5μl pcr反应体系中包含模板dna 20-50ng，hotstar taq 0.5u，每条扩增引物0.5pmol，0.1μl的25mm dntps；在兼容384孔板的pcr仪上设定pcr反应条件为：94℃4分钟；94℃20秒,56℃30秒，72℃1分钟，45个循环；72℃3分钟；4℃保持；将384孔pcr反应板放置于pcr仪上，启动pcr反应；
(3)pcr产物碱性磷酸酶处理：在pcr反应结束后，将pcr产物用sap(shrimp alkaline phosphatase，虾碱性磷酸酶)处理，以去除体系中游离的dntps；配制碱性磷酸酶处理反应液，sap mix，按体积配制如下：sap mix对每个反应体系，μlwater1.53sap buffer(10x)0.17sap酶(1.7u/ul)0.3总体积2使用24通道加样器，调节加样体积为2μl，将sap mix加入384孔pcr反应板，对于每个碱性磷酸酶处理反应孔，反应体系总体积为7μl，其中pcr产物5μl，sap混合液2μl(sap 0.5u,buffer 0.17μl)；将384孔板放置在兼容384孔板的pcr仪上，设定pcr反应条件：37℃40分钟；85℃5分钟；4℃维持，启动pcr仪进行碱性磷酸酶处理；(4)单碱基延伸：在碱性磷酸酶处理结束后，进行单碱基延伸反应，反应体系总体积9μl；配制单碱基延伸反应液，extend mix，按体积配制如下：extend mix对每个反应，μlwater0.619extend primer mix 1or 20.94iplex buffer plus0.2iplex终止子0.2iplex酶0.041总体积2使用24通道加样器，调节加样体积为2μl，将extend mix对应加入384孔反应板。对于每个反应孔，单碱基延伸反应体系包含sap处理后pcr产物7μl及extend mix液2μl(其中各延伸反应引物混合物0.94μl，iplex酶0.041μl,延伸混合物0.2μl)；将384孔板放置在兼容384孔板的pcr仪上，设定pcr反应条件：i.94℃for 30secondsii.94℃for 5secondsiii.52℃for 5secondsiv.80℃for 5secondsv.goto iii,4more timesvi.goto ii,39more timesvii.72℃for 3minutesvii.4℃forever；启动pcr仪进行单碱基延伸反应；(5)树脂纯化：将clean resin树脂平铺到6mg的树脂板中，加16μl水到延伸产物的对应孔内，将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜，低速垂直旋转30分钟,使树脂与反应物充分接触，离心使树脂沉入孔底部；(6)芯片点样：启动massarray nanodispenser rs1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至384孔spectrochip(sequenom)芯片上。
(7)质谱检测：将点样后的spectrochip芯片使用maldi-tof(matrix-assisted laser desorption/ionization
–
time of fligh，基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱)分析，检测结果使用typer 4.0软件(sequenom)分型并输出结果。
技术总结
本发明公开了一种银屑病基因筛查试剂盒，包括以下成分：0.5ml PCRBuffer、0.4ml 25mM MgCl2、0.1ml 25mM dNTP mix、0.1ml 5U/μLHotStar Taq、1ml PCR primer mix、0.17ml 10x SAP Buffer、0.3ml1.7U/ul SAP酶、0.94ml Extend primer Mix 1or 2、0.2ml iPLEX Bufferplus、0.2ml iPLEX终止子、0.041ml iPLEX酶、80ml Clean Resin树脂、80ml超纯水、第一轮扩增引物0.5pmol/每条、第二轮扩增引物0.5pmol/每条；所述第一轮扩增引物为上游引物、下游引物；所述第二轮扩增引物为单碱基延伸引物。本发明中的试剂盒为体外诊断用试剂，应用间接法原理检测人血清或血浆样品中的银屑病易感基因的表达情况，从而实现银屑病的早期筛查，为临床中预测发病、鉴别诊断、分层治疗提供方向。提供方向。
技术研发人员：邬可嘉 郑晓冬 王万融 程千惠 周斐然 张苑菁
受保护的技术使用者：安徽医科大学第一附属医院
技术研发日：2022.05.14
技术公布日：2022/7/5