4-磷酸羟基-L-苏氨酸脱氢酶PdxA突变体及其在制备维生素B6中的应用

4-磷酸羟基-l-苏氨酸脱氢酶pdxa突变体及其在制备维生素b6中的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及4-磷酸羟基-l-苏氨酸脱氢酶pdxa突变体及其在制备维生素b6中的应用。


背景技术：

2.维生素 b6在医药、食品、饲料工业和化妆品中具有广泛的应用，是人类或其他动物不可缺少的维生素。维生素 b6包括六种形式：吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺以及相应的磷酸酯形式，其中主要的活性形式磷酸吡哆醛参与近百种酶反应，其中多数与氨基酸代谢有关，例如转氨基、脱羧、脱水及转硫化反应等。
3.目前维生素b6的产品形式是吡哆醇盐酸盐，工业上主要采用4-甲基-5-乙氧基噁唑路线以化学法人工合成，中间体噁唑合成过程中用到强腐蚀性的三氯氧磷和有毒溶剂苯，反应控制难，潜在安全隐患大；制备工艺繁琐，能耗高，废水量大，废盐含量高，不利于环境保护，原子经济性差，产品成本高；另外，所得产品着色较重，精制工艺较为复杂等。生物制造过程具有原料无毒、反应过程温和、安全隐患小和环境友好等优点，因此维生素 b6的生物合成研究具有重大的科学意义和应用需求，是维生素 b6绿色工业化生产的一个必然趋势，经济效益和社会效益显著。
4.维生素b6的生物合成已有50多年的研究历史，其中报道称根瘤菌具有天然高产吡哆醇的能力，但产量较低（tazoe m et al., production of vitamin b
6 in rhizobium. bioscibiotechnol and biochem, 1999; 63(8):1378-1382.）。根瘤菌生长慢，生长周期较长，自身的遗传操作复杂，难以进行大规模的遗传研究，严重制约了根瘤菌作为底盘细胞进行维生素b6生产的研究。大肠杆菌，因其遗传背景清晰，分子手段多样，是一种被广泛用作表达重要化学品的生产宿主。
5.本发明人前期对野生型大肠杆菌菌株mg1655进行了途径改造（zl202110059483.2），以此为底盘细胞进一步探究其发酵生产维生素b6的能力。在大肠杆菌中，4-磷酸羟基-l-苏氨酸脱氢酶（4-phosphohydroxy-l-threoninedehydrogenase=pdxa）催化4-磷酸羟基-l-苏氨酸脱氢生成3-磷酸羟基-1-氨基丙酮（pha），其kcat为= 1.66 s-1
，km=85μm，kcat/km=0.019 s-1
μm-1
，其催化常数较低不仅影响整条生物合成途径的代谢效率，而且其底物4-磷酸羟基-l-苏氨酸具一定的细胞毒性，pdxa的催化活性较低将影响底物的转化效率，并可能造成有毒中间代谢产物的积累从而抑制细胞生长，从而进一步限制维生素b6产量的提升，因此4-磷酸羟基-l-苏氨酸脱氢酶pdxa的活性对增强维生素b6生物合成具有重要的作用。


技术实现要素：

6.针对现有技术的需求，本发明提供一种能够提高维生素b6的发酵产量的4-磷酸羟基-l-苏氨酸脱氢酶pdxa突变体。
7.本发明提供一种4-磷酸羟基-l-苏氨酸脱氢酶pdxa突变体，其氨基酸序列是以seqidno:1所示的氨基酸序列为参考序列，在对应于seqidno：1的p245，h136，g119，e214，d267，t285，v149，m151，t164，l270，t165，t248，d296，l273，v121，v160，f133，a212，g207，a317，v35，s313，t137，s294，v295，c206，a154，k323位中的至少一个位置的氨基酸残基发生突变；或者所述4-磷酸羟基-l-苏氨酸脱氢酶突变体的氨基酸序列具有所述发生突变的氨基酸序列中的所述突变位点，且与所述发生突变的氨基酸序列具有80％以上同源性、具有4-磷酸羟基-l-苏氨酸脱氢酶活性的功能性片段，优选具有90％以上、95％以上或98％以上的同源性。
8.在本发明公开的一个实施方案中，所述4-磷酸羟基-l-苏氨酸脱氢酶pdxa突变体包括对应于seqidno:1，发生如下位点的取代：p245c，h136n，g119c，e214n，d267l，t285l，t285v，v149l，m151e，m151w，t164i，l270e，t165r，t248l，t248c，d296i，l273c，v121l，v160i，f133m，a212w，g207a，a317v，v35i，s313t，t137f，s294m，v295i，c206f，a154l，k323h中的任一种或二种或三种或四种以上的组合。
9.上述任一所述4-磷酸羟基-l-苏氨酸脱氢酶pdxa可为以下（1）-（30）中的任一种：（1）所述的酶突变体是将seqidno.1中的第245位的p置换为c；（2）所述的酶突变体是将seqidno.1中的第136位的h置换为n；（3）所述的酶突变体是将seqidno.1中的第119位的g置换为c；（4）所述的酶突变体是将seqidno.1中的第214位的e置换为n；（5）所述的酶突变体是将seqidno.1中的第267位的d置换为l；（6）所述的酶突变体是将seqidno.1中的第285位的t置换为l；（7）所述的酶突变体是将seqidno.1中的第149位的v置换为l；（8）所述的酶突变体是将seqidno.1中的第151位的m置换为e，且第136位的h置换为n；（9）所述的酶突变体是将seqidno.1中的第165位的t置换为r，且第285位的t置换为l；（10）所述的酶突变体是将seqidno.1中的第149位的v置换为l，且第248位的t置换为l；（11）所述的酶突变体是将seqidno.1中的第149位的v置换为l，且第296位的d置换为i；（12）所述的酶突变体是将seqidno.1中的第151位的m置换为e，且第273位的l置换为c；（13）所述的酶突变体是将seqidno.1中的第151位的m置换为e，且第121位的v置换为l；（14）所述的酶突变体是将seqidno.1中的第160位的v置换为i，第248位的t置换为c；（15）所述的酶突变体是将seqidno.1中的第133位的f置换为m，且第214位的e置换为n；（16）所述的酶突变体是将seqidno.1中的第212位的a置换为w；（17）所述的酶突变体是将seqidno.1中的第207位的g置换为a；
（18）所述的酶突变体是将seqidno.1中的第317位的a置换为v；（19）所述的酶突变体是将seqidno.1中的第35位的v置换为i；（20）所述的酶突变体是将seqidno.1中的第164位的t置换为i，且第270位的l置换为e（21）所述的酶突变体是将seqidno.1中的第151位的m置换为w，第137位的t置换为f；（22）所述的酶突变体是将seqidno.1中的第294位的s置换为m，第295位的v置换为i；（23）所述的酶突变体是将seqidno.1中的第212位的a置换为w，第206位的c置换为f，且第207位的g置换为a；（24）所述的酶突变体是将seqidno.1中的第294位的s置换为m，第295位的v置换为i，且第151位的m置换为w；（25）所述的酶突变体是将seqidno.1中的第294位的s置换为m，第295位的v置换为i，且第154位的a置换为l；（26）所述的酶突变体是将seqidno.1中的第294位的s置换为m，第295位的v置换为i，且第313位的s置换为w；（27）所述的酶突变体是将seqidno.1中的第151位的m置换为w，第137位的t置换为f，且第313位的s置换为w；（28）所述的酶突变体是将seqidno.1中的第285位的t置换为v，第151位的m置换为w，且第137位的t置换为f；（29）所述的酶突变体是将seqidno.1中的seqidno.1中的第212位的a置换为w，第206位的c置换为f，且第207位的g置换为a，且第35位的v置换为i；（30）所述的酶突变体是将seqidno.1中的seqidno.1中的第212位的a置换为w，第206位的c置换为f，且第207位的g置换为a，且第323位的k置换为h；本发明还涉及含所述重组4-磷酸羟基-l-苏氨酸脱氢酶pdxa突变体编码基因的重组载体。所述重组载体包含与适合指导在宿主细胞中表达的控制序列可操作地连接的多核苷酸。优选该表达载体为prsfduet-1。
10.本发明在一个具体实施方式中：将重组4-磷酸羟基-l-苏氨酸脱氢酶pdxa突变体编码基因同表达载体prsfduet-1连接，构建了含有4-磷酸羟基-l-苏氨酸脱氢酶pdxa突变体编码基因的表达重组质粒。将表达重组质粒转化至宿主菌中，获得含有重组质粒的重组微生物（基因工程菌）。
11.本发明尤其提供重组4-磷酸羟基-l-苏氨酸脱氢酶pdxa突变体、重组载体、重组微生物在制备维生素b6中的应用。
12.本发明还提供制备维生素b6的方法，包括培养所述重组微生物后，收集所产生的维生素b6。优选地，采用分泌型重组表达载体转化的重组微生物，在培养后的发酵液中收集维生素b6。
13.本发明通过研究同源性比对、晶体结构分析以及催化机理的理解，模拟底物与酶的对接方式，筛选可设计的残基，再通过酶设计突变体的氨基酸序列，最终实验验证获得了一系列的4-磷酸羟基-l-苏氨酸脱氢酶pdxa突变体。经对比研究证实，本发明重组4-磷酸羟
基-l-苏氨酸脱氢酶pdxa基因和突变基因的工程菌生物安全，对发酵培养的生物量几乎没有任何影响，尤其可以有效的提高大肠杆菌生产维生素b6的能力。实验数据表明其中对于野生型基因在大肠杆菌中过表达，维生素b6的能力并没有明显提高，而4-磷酸羟基-l-苏氨酸脱氢酶pdxa突变体在大肠杆菌中过表达能提高产维生素b6的能力。
附图说明
14.图1为载体prsfduet-1_pdxa improved的图谱。
15.图2为维生素b6的标准曲线图。
16.图3为不同pdxa突变的工程菌株发酵70h后的产量。
17.图4为不同pdxa突变的工程菌株发酵70h后的生物量。
具体实施方式
18.本发明的以下实施例和附图仅说明实现本发明的具体实施方案，这些方案和附图不可以理解为对本发明的限制，任何在不脱离本发明的原理和实质的情况下所做的任何改变，均落在本发明的保护范围之内。
19.本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。
20.实施例1：4-磷酸羟基-l-苏氨酸脱氢酶pdxa原始基因载体的构建1、野生型mg1655的4-磷酸羟基-l-苏氨酸脱氢酶pdxa原始基因如seq id no: 2所示，经过jcat在线网站进行密码子优化后，如seq id no: 3所示，由genewiz（苏州金唯智生物科技有限公司）进行基因合成，合成的基因位于puc57-kan标准载体上。
21.2、从puc57-kan标准载体上为模板扩增得到编码氨基酸序列如seqidno:1所示的4-磷酸羟基-l-苏氨酸脱氢酶pdxa优化后的基因，其核苷酸序列如seq id no: 3所示，所用引物为liulx-1/liulx-2，以原始的prsfduet-1质粒为模板扩增骨架（引物liulx-3/liulx-4），通过gibson组装将pdxa基因与质粒骨架连接，转化dh5α大肠杆菌，涂布于lb平板（含50 μg/ml卡那霉素），筛选阳性克隆并验证（引物duetup1/duetdown1）条带正确后进行测序确认，得到验证正确的重组质粒prsfduet-1_pdxa improved（图谱见图1），提质粒备用。
22.表1 pdxa原始基因载体构建的引物实施例2：4-磷酸羟基-l-苏氨酸脱氢酶pdxa突变位点的设计首先，将大肠杆菌来源的4-磷酸羟基-l-苏氨酸脱氢酶pdxa与genbank数据库中已报道的4-磷酸羟基-l-苏氨酸氨基酸脱氢酶序列进行同源性比对分析，通过对大肠杆菌来源的pdxa的晶体结构（pdb: 1ps6）分析以及催化机理的理解，由于晶体结构中没有nad的结
晶，首先通过对接的方法确定nad的位置，并验证结晶底物所在位点是否可以容纳辅酶，并确定底物结合模式，构建第一步质子化转换后的底物和蛋白的复合物，根据过渡态理论模拟突变底物周围的残基，并获取比野生型结合更好的突变体进行实验验证。
23.实施例3：4-磷酸羟基-l-苏氨酸脱氢酶pdxa突变体的构建1、通过一步pcr法引入定点突变位点，以实施例1获得的重组质粒prsfduet-1_pdxa improved原始为模板进行单点突变，在进行2或3或4组合突变时则以相应获得的单或双或三位点突变体为质粒模板。基本流程为首先设计突变引物（引物见表2），在引物上引入突变位点，进行overlap pcr，然后用dpnl酶识别甲基化位点并将其酶切消化模板，dpnl酶处理过的pcr产物转化，最后进行挑菌测序验证，验证正确者提质粒备用。
24.表2实施例3中用到的引物引物序列（5
’‑3’
）p245c-ftgcgctgacaccctgttccagccp245c-raacagggtgtcagcgcacagcggaccgttcagtttcah136n-fcaccggtaacaccgaattcttcgaagaacgtth136n-rattcggtgttaccggtgaacgggataccag119c-ftgatcacctgcccggttcacaaaggtgttatcag119c-raaccgggcaggtgatcagagcagcgaattcace214n-ftggtaacggtggtcacatgggtaccgaagaaae214n-rtgtgaccaccgttaccagcgtgcgggttcagad267l-ftatgtaccacctgcagggtctgccggttctgad267l-rcctgcaggtggtacatagccagaacagcgt285l-ftaacatcctgctgggtctgccgttcatccgtat285l-rgacccagcaggatgttaacaccacgaccgaaat285v-ftaacatcgttctgggtctgccgttcatccgtat285v-rgacccagaacgatgttaacaccacgaccgaaav149l-factggttatgatgctggctaccgaagaactgcv149l-rccagcatcataaccagttttttagcctgagaacgttcttcgm151e-fgttgttgaaatgctggctaccgaagaactgcm151e-rgccagcatttcaacaacttttttagcctgagaacgtm151w-fagttgtttggatgctggctaccgaagaactgcm151w-rccagcatccaaacaacttttttagcctgagaacgtt164i-fttgctctggctatcacccacctgccgctgcgtt164i-rggtgatagccagagcaacacgcagttcttcggl270e-fggtgaaccggttctgaaataccagggtttcggl270e-rttcagaaccggttcaccctggtcgtggtacatagcct165r-fttgctctggctacccgtcacctgccgctgcgtgact165r-racgggtagccagagcaacacgcagttcttcggt248l-fgctgacctgctgttccagccgaaatacctggt248l-rtggaacagcaggtcagccggcagcggacc
t248c-fgctgactgcctgttccagccgaaatacctggat248c-rtggaacaggcagtcagccggcagcggaccgttl273c-fgccggtttgcaaataccagggtttcggtcgtgl273c-rggtatttgcaaaccggcagaccctggtcgtggv121l-fcgctgcacaaaggtgttatcaacgacgctggtv121l-raacacctttgtgcagcggaccggtgatcagagcav160i-faactgcgtatcgctctggctaccacccacctgv160i-rcagagcgatacgcagttcttcggtagccagcaf133m-ftatcccgatgaccggtcacaccgaattcttcgf133m-rgaccggtcatcgggataccagcgtcgttgataa212w-factggggtgaaggtggtcacatgggtaccgaaa212w-raccaccttcaccccagtgcgggttcagaccgcag207a-ftggtttgcgctctgaacccgcacgctggtgaag207a-rgttcagagcgcaaaccaggatacgcggttcaga317v-fcatcaccgttctgaacctggctatcaaaatgatca317v-rggttcagaacggtgatgaaagaaccaacgtcagv35i-fttgagctcatcgtctgcgcagacgctacccv35i-rgcagacgatgagctcaaccggccattcas313t-fcgttggtaccttcatcaccgctctgaacctgs313t-rtgatgaaggtaccaacgtcagctttaccacgt137f-fcggtcacttcgaattcttcgaagaacgttctcaggt137f-ragaattcgaagtgaccggtgaacgggataccs294m-ftccgtaccatggttgaccacggtaccgctctgs294m-rgtcaaccatggtacggatgaacggcagacv295i-ftacctctatcgaccacggtaccgctctggv295i-rcgtggtcgatagaggtacggatgaacggcac206f-fcctggttttcggtctgaacccgcacgctggtgc206f-rtcagaccgaaaaccaggatacgcggttcagcga154l-ftgatgctgctgaccgaagaactgcgtgttgcta154l-rttcggtcagcagcatcataacaacttttttagcck323h-fggctatccacatgatcgttaacacccagtaacgck323h-rcgatcatgtggatagccaggttcagagcggtgd296i-fctctgttatccacggtaccgctctggaactggd296i-rtaccgtggataacagaggtacggatgaacggcs313w-fcgttggttggttcatcaccgctctgaacctggs313w-rtgatgaaccaaccaacgtcagctttaccacga2、共获得30个pdxa突变体，分别命名为pdxa1-pdxa30。与prsfduet-1_pdxa improved原始基因相比，pdxa1-pdxa30的氨基酸差异见表3中第2列。
25.表3 突变体及其相对于原始基因的氨基酸差异
原始基因或突变体氨基酸差异工程菌株发酵产量prsfduet-1_pdxaimprovedn/all05-prsfduet-1_pdxaimproved1.07
±
0.33pdxa1p245cll05-pdxa12.17
±
0.01pdxa2h136nll05-pdxa22.12
±
0.07pdxa3g119cll05-pdxa31.80
±
0.09pdxa4e214nll05-pdxa42.11
±
0.07pdxa5d267lll05-pdxa51.64
±
0.11pdxa6t285lll05-pdxa62.17
±
0.17pdxa7v149lll05-pdxa72.17
±
0.19pdxa8m151e/h136nll05-pdxa81.44
±
0.53pdxa9t165r/t285lll05-pdxa92.08
±
0.10pdxa10v149l/t248lll05-pdxa101.59
±
0.08pdxa11v149l/d296ill05-pdxa112.04
±
0.13pdxa12m151e/l273cll05-pdxa121.72
±
0.32pdxa13m151e/v121lll05-pdxa131.87
±
0.05pdxa14v160i/t248cll05-pdxa141.79
±
0.12pdxa15f133m/e214nll05-pdxa151.93
±
0.08pdxa16a212wll05-pdxa161.42
±
0.23pdxa17g207all05-pdxa171.67
±
0.10pdxa18a317vll05-pdxa181.29
±
0.78pdxa19v35ill05-pdxa192.07
±
0.001pdxa20t164i/l270ell05-pdxa201.46
±
0.42pdxa21m151w/t137fll05-pdxa211.97
±
0.004pdxa22s294m/v295ill05-pdxa221.88
±
0.12pdxa23a212w/c206f/g207all05-pdxa231.76
±
0.03pdxa24s294m/v295i/m151wll05-pdxa241.83
±
0.02pdxa25s294m/v295i/a154lll05-pdxa251.99
±
0.04pdxa26s294m/v295i/s313wll05-pdxa262.02
±
0.04pdxa27m151w/t137f/s313wll05-pdxa271.97
±
0.02pdxa28t285v/m151w/t137fll05-pdxa281.41
±
0.10pdxa29a212w/c206f/g207a/v35ill05-pdxa291.88
±
0.15pdxa30a212w/c206f/g207a/k323hll05-pdxa301.79
±
0.02
实施例4：含突变载体的大肠杆菌工程菌株的构建将上述方法所获得的prsfduet-1系列质粒载体，通过化学转化法按照以下步骤转化至大肠杆菌工程菌ll05（该菌株来自于本发明人此前专利：zl202110059483.2）中，在lb平板(含50 μg/ml卡那霉素)上分别筛选得到重组大肠杆菌菌株。
26.（1）从-80度冰箱活化大肠杆菌 mg1655衍生菌株ll05，37℃，200 rpm/min的恒温培养箱中振荡培养12小时左右，次日无菌条件下，按照初始od为0.1的接种量接入5 ml lb液体培养基中，取1ml od600nm约0.5-0.6的菌到1.5ml的微量离心管中。
27.（2）4,000 rpm离心4-5分钟，彻底去除上清，再加0.1ml的预冷的sscs溶液（shanghai generay biotech co.，ltd.）轻轻悬浮菌休。
28.（3）加入100pg-10ng质粒dna用于转化。
29.（4）dna和细胞混匀后在冰上放置30分钟，然后在42℃放置90秒，再在冰上放置15～20分钟。
30.（5）加0.8ml的lb培养基到离心管中而后在摇床37℃，200rpm培养1小时。
31.（6）将细胞涂布于相应抗性的平板上。
32.（7）挑取阳性克隆验证保种，工程菌株编号如表3第3列。
33.实施例5：4-磷酸羟基-l-苏氨酸脱氢酶pdxa的发酵与预处理培养基配方：lb 培养基（g/l）：氯化钠 10，胰蛋白胨10，酵母提取物5，固体培养基加琼脂粉15。
34.种子培养基（g/l）：甘油 10，胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠5。
35.发酵培养基(g/l)：甘油15，酸水解酪蛋白5，酵母提取物5，氯化钠5，葡萄糖1，mgso4·
7h2o 200 mg/l, feso4·
7h2o 10mg/l, mnso4·
5h2o 10mg/l，ph通过koh控制在6.8。
36.操作步骤如下：（1）取新鲜活化的ll05-prsfduet-1_pdxa improved和ll05-pdxa1~pdxa30于5ml种子培养基的试管中(含50 ug/ml卡那霉素)，37℃摇床，200rpm振荡培养15h；（2）次日，测定试管中菌液的od600，转接到24孔板，初始od
600
=0.1，37℃孔板摇床，800rpm，湿度80%，振荡培养70 h。每一发酵菌株做3个平行；（3）发酵结束后测定菌液od600，取1ml菌液至ep管，8000rpm离心3分钟后，取上清用0.22 μm滤膜过滤后置入色谱样品瓶进行高效液相色谱检测，实施例6：维生素b6的检测采用配有荧光检测器的高效液相色谱仪进行检测。
37.（1）标准品的制备配置梯度维生素b6标准品-吡哆醇(0.1 mg/l，1 mg/l，10 mg/l，20 mg/l，50 mg/l)。
38.（2）hplc检测条件cosmosil 5c18-ar-ii packed column色谱柱（cosmosil，4.6 mm i.d.
ꢀ×
250 mm，5
ꢀµ
m）。流动相a:33mm磷酸，8mm 1-辛烷磺酸钠的水溶液，koh调ph=2.2；流动相b：80%乙腈。
39.液相条件为：第0-5min，100% a到99% a/1% b，第5-10min梯度到81% a/19% b，第10-20 min梯度到72% a/28% b，第20-25 min梯度到37% a/63% b，第25-30min，梯度到100% a，每一样品总时长30 min。荧光检测器设置激发波长293nm，发射波长395 nm，柱温设为35℃，流速0.8 ml/min，进样体积20
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40.（4）维生素b6标准曲线的绘制将不同浓度的标准品按上述条件进行hplc检测，绘制峰面积a-vb6浓度标准曲线。以测得的峰面积a为纵坐标，维生素b6质量浓度c（mg/l）记为横坐标，绘制维生素b6标准曲线。见图2，得回归方程y = 132317x + 6899.2，r2=1，吸收度与质量浓度呈良好的线性关系。液相结束后根据维生素b6标准曲线计算样品产量。
41.发酵产量结果见图3和表3第4列，生物量如图4所示。由图表中的数据可以看出，4-磷酸羟基-l-苏氨酸脱氢酶pdxa经过理性改造后，所有突变体的生物量几乎维持不变（个别突变体的生物量甚至有明显的增加），而突变体明显促进了维生素b6的发酵产量的提升，尤其是部分突变体如ll05-pdxa1，pdxa4，pdxa6，pdxa7，pdxa19等突变体更是显著促进了维生素b6的发酵产量的提升，产量提升100%左右。鉴于4-磷酸羟基-l-苏氨酸脱氢酶pdxa在维生
素b6合成中的重要作用，本发明中提供的突变体为工程化需求元件的构建提供了基础，对提高维生素b6产量具有极大的促进作用。
42.以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。