吡咯烷酰胺衍生物及其制备和使用方法与流程

吡咯烷酰胺衍生物及其制备和使用方法
1.本技术是申请日为2016年07月08日、申请号为201680020220.8、发明名称为“吡咯烷酰胺衍生物及其制备和使用方法”的中国申请的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及吡咯烷酰胺(pyrrolidine carboxamido)衍生物、其光学异构体或其药学上可接受的盐，以及制备和使用其的方法。


背景技术：

3.已经提出了包括但不限于免疫抑制药物(例如，英夫利昔单抗)、氨基水杨酸(例如，柳氮磺吡啶)和类固醇的各种化合物/组合物/方法作为减少细胞因子和/或趋化因子的方法以预防和/或治疗包括但不限于炎症适应症 (inflammatory indication)、癌症和眼科适应症(expert opinion on emergingdrugs(2015)20(3)：349-352；cell.(2010)3月19日；140(6)：883-899； progress in retinal and eye research 37(2013)68e89，其通过引用包含于此) 的各种疾病。然而，至少因为它们是昂贵的和/或包含副作用和/或显示低的治疗效果(p&t 41(2016)，6月6日；gut 56(2007)：725-732；world j gastroenterol (2005)；11(16)：2462-2466，其通过引用包含于此)，所以它们不是令人满意的。因此，仍然需要新的化合物、组合物和/或方法。


技术实现要素：

4.本发明基于以下发现：某些吡咯烷酰胺衍生物能够抑制炎症细胞因子(例如il-6)和/或趋化因子的表达和活性，并且能够在靶组织/细胞中保持足够高的浓度，同时较少暴露于血液。本发明还基于以下发现：某些吡咯烷酰胺衍生物能够通过稳定iκb来抑制nf-κb的活性。本发明还基于以下发现：某些吡咯烷酰胺衍生物能够破坏由作用于包括toll样受体2/4和il-1β的信号通路的下游的骨髓分化原发性应答基因88(myd88)和/或受体相互作用蛋白1 (rip1)介导的炎症信号转导复合物的形成。
5.在一个方面，本发明提供由下面的式1表示的化合物、其光学异构体、或其药学上可接受的盐。
6.[式1]
[0007][0008]
其中：n为0、1或2；a为-a
1-，所述-a
1-是从丙氨酸(ala，a)、精氨酸 (arg，r)、天冬酰胺(asn，n)、天冬氨酸(asp，d)、半胱氨酸(cys，c)、谷氨酸(glu，e)、谷氨酰胺(gln，q)、甘氨
酸(gly，g)、组氨酸(his， h)、异亮氨酸(ile，i)、亮氨酸(leu，l)、赖氨酸(lys，k)、甲硫氨酸(met，m)、苯丙氨酸(phe，f)、脯氨酸(pro，p)、丝氨酸(ser，s)、苏氨酸(thr， t)、色氨酸(trp，w)、酪氨酸(tyr，y)和缬氨酸(val，v)构成的组中独立地选择的氨基酸，所述氨基酸的两个末端通过酰胺键结合到羰基或胺基； r1为直链或支链c
1-36
烷基、包括至少一个双键的直链或支链c
2-36
烯基、或者包括至少一个三键的直链或支链c
2-36
炔基。
[0009]
在另一方面，本发明提供用于制备所述化合物、所述光学异构体和所述盐的方法。
[0010]
在又一方面，本发明提供了用于预防、改善和治疗各种疾病(例如，炎症适应症、癌症和眼科适应症)的组合物。组合物均包括作为活性组分的至少一种该化合物、至少一种该光学异构体或至少一种该盐。
[0011]
在又一方面，本发明提供了用于预防、改善或治疗各种疾病(例如，炎症适应症、癌症和眼科适应症)的方法。所述方法均包括向需要的受试者施用包含作为活性组的至少一种该化合物、至少一种该光学异构体或至少一种该盐的组合物。
[0012]
根据本发明的某些实施例的化合物可以抑制由myd88(myddosome复合物)和/或rip1介导的炎症信号通路中的iκb的分解，从而防止nf-κb被转运到细胞的细胞核中，导致抑制细胞因子和趋化因子(例如，g-csf、il-2、 scf、vegf、cx3cl1、igfbp5、igfbp6、il-1α、il-1β、il-6、il-9、mcp-1、 mip-3α、il12p40/70、mig、tnf-α和vcam-1)的表达，并防止否则会由其表达引起的炎症反应。
[0013]
通过考虑具体实施方式和附图，本发明的其它方面和优点对于本领域技术人员将变得明显。
附图说明
[0014]
图1a是示出了根据本发明的实施例的化合物抑制il-6的表达的电泳结果。
[0015]
图1b是示出了根据本发明的实施例的化合物抑制il-6的表达的图。
[0016]
图2示出了根据本发明的实施例的化合物在细胞系raw264.7中抑制细胞因子和趋化因子的表达。
[0017]
图3示出了根据本发明的实施例的化合物在细胞系raw264.7中抑制宿主中的il6的表达。
[0018]
图4示出了根据本发明的实施例的化合物抑制nf-κb的活性。
[0019]
图5示出了根据本发明的实施例的化合物抑制nf-κb。
[0020]
图6示出了根据本发明的实施例的化合物抑制nf-κb的活性，同时不影响tgf-β和bmp的信号传导。
[0021]
图7是示出了根据本发明的实施例的化合物抑制由irak-1、myd88和/ 或rip1介导的炎症信号通路蛋白复合物的形成，并且示出了根据本发明的实施例的化合物改变iκb的浓度的免疫沉淀结果。
[0022]
图8是示出了根据本发明的实施例的化合物可以破坏由irak-1、myd88 和/或rip1介导的炎症信号通路蛋白复合物的形成。
[0023]
图9示出了根据本发明实施例的化合物的预处理浓度的变化改变了 raw 264.7巨噬细胞和bmdm细胞中iκb的浓度。
[0024]
图10是在口服施用本发明的实施例的化合物的的情况下，示出了根据本发明的实
施例的化合物的剂量在具有dss诱导的慢性结肠炎的动物模型中的疾病活性指数分数的图。
[0025]
图11a示出了表示根据本发明的实施例的化合物抑制具有dss诱导的急性结肠炎的动物模型中的急性结肠炎的能力的疾病活性指数得分。
[0026]
图11b示出了根据本发明的实施例的化合物影响具有dss诱导的慢性结肠炎的动物模型中的趋化因子(ccl2、ccl20和cxcl1)的表达量。
[0027]
图12-16是示出了来自未处理组、dds诱导的慢性结肠炎模型组和根据本发明的实施例的化合物治疗的组的大肠绒毛的形状的图像。
[0028]
图17是表示未处理组、dds诱导的慢性结肠炎模型组、根据本发明的实施例的化合物治疗的组和使用柳氮磺吡啶治疗的组的大肠壁的恢复水平的图。
[0029]
图18是示出了经由静脉施用的根据本发明的实施例的化合物随时间的血液浓度的变化的图。
[0030]
图19是示出了经由口施用的根据本发明的实施例的化合物随时间的血液浓度的变化的图。
[0031]
图20a是确认根据本发明的实施例的化合物是否抑制mapk/erk信号通路的蛋白质印迹图像。
[0032]
图20b是描绘toll样受体的信号通路的图。
[0033]
图21是确认根据本发明的实施例的化合物是否抑制mapk/erk信号通路的蛋白质印迹图像。
[0034]
图22a和图22b分别示出了根据本发明的实施例的化合物和irak1/4 抑制剂对nf-κb激活的抑制水平。
[0035]
图23a和图23b是确认根据本发明的实施例的化合物和irk1/4抑制剂是否改变iκb浓度的免疫印迹图像。
[0036]
图24a和图24b分别是比较本发明的实施例的化合物抑制mapk/erk 信号通路的能力和irak1/4抑制剂抑制mapk/erk信号通路的能力的图像和图。
[0037]
图25a是确认根据本发明的实施例的化合物是否在arpe-19中抑制 nox-4、vegf、vegfr1、vegfr2、ang-2、epo和epor的表达并且可以增加ang-1和tie2的表达的蛋白质印迹图。
[0038]
图25b是确认根据本发明的实施例的化合物是否抑制hrmec中的 vegf表达的qrt-pcr图像。
[0039]
图26是示出了根据本发明的实施例的化合物抑制hrmec中的管形成的图像。
[0040]
图27a和图27b是示出了根据本发明的实施例的化合物在stz诱导的1 型糖尿病视网膜病变的小鼠模型中抑制活化氧增加的图像。
[0041]
图28a是示出了根据本发明的实施例的化合物在mog诱导的eae小鼠中具有治疗效果的图。
[0042]
图28b是示出了根据本发明的实施例的化合物改变mog诱导的eae小鼠的重量的图。
[0043]
图29是示出了根据本发明的实施例的化合物在盲肠结扎和穿刺(clp) 模型中具有治疗效果的图。
具体实施方式
[0044]
1、定义
[0045]
除非另有定义，否则这里使用的所有技术术语和科学术语具有本公开所属领域的技术人员通常理解的含义。通过引用包含于此的下面的参考文献为技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般定义：剑桥科学技术词典 (walker编辑，1988)；the glossary of genetics，第五版，r.rieger等人(编辑)，springer verlag(1991)；和hale&marham，the harper collins dictionaryof biology(1991)。如这里所使用的，除非另有说明，否则下面的术语具有下面赋予它们的含义。
[0046]
除非明确地说明或从上下文中明显的，否则如这里所使用的，术语“或”被理解为包含。
[0047]
除非明确地说明或从上下文中明显的，否则如这里所使用的，术语“一种(者)”和“所述”被理解为单数或复数。因此，例如，提及“化合物”包括这些化合物的混合物；提及“载体”包括两种或更多种载体的混合物；等等。
[0048]
除非明确地说明或从上下文中明显的，否则如这里所使用的，术语“大约”被理解为本领域中的正常公差的范围内，例如，在平均值的2个标准偏差内。“大约”可以被理解为在所述值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、 3％、2％、1％，0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。除非另外从上下文中是清楚的，否则这里提供的所有数值都被术语“大约”修饰。
[0049]
术语“活性剂”、“药物”和“药物制剂”在这里可互换使用以表示化学物质或化合物，所述化学物质或化合物在通过任意方法和/或途径施用给受试者(例如，包括人或非人动物的任何动物)时引起期望的药理作用(例如，诸如炎症的减少)。
[0050]
这里所使用的术语“添加剂”可以指可以添加到这里描述的组合物中的任何附加组分。例如，如果附加组分对于待治疗的具体状况是药学上可接受的，则添加剂可以包括赋形剂(例如，一种或更多种赋形剂)、抗氧化剂(例如，一种或更多种抗氧化剂)、稳定剂(例如，一种或更多种稳定剂)、防腐剂(例如，一种或更多种防腐剂)、ph调节和/或缓冲剂(例如，一种或更多种ph调节和/或缓冲剂)、渗透压调节剂(例如，一种或更多种渗透压调节剂)、增稠剂(例如，一种或更多种增稠剂)、悬浮剂(例如，一种或更多的悬浮剂)、粘合剂(例如，一种或更多种粘合剂)、增粘剂(例如，一种或更多种增粘剂) 等。例如，添加剂还可以包括加工助剂、药物递送调节剂和增强剂，诸如磷酸钙、硬脂酸镁、滑石粉、单糖、二糖、淀粉、明胶、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、葡萄糖、羟丙基-β-环糊精、聚乙烯吡咯烷酮、低熔点蜡、离子交换树脂等，以及其任意两种或更多种的组合。其它适合的药学上可接受的赋形剂描述于通过引用包含于此的“remington's pharmaceuticalsciences”，mack pub.co.，new jersey(1991)”和“remington：the scienceand practice of pharmacy”，lippincott williams&wilkins，philadelphia，第20 版(2003)和第21版(2005)”中。这里描述的添加剂可以以任何合适的量使用。
[0051]
如这里所使用的，术语“施用”是指口服施用、栓剂施用、局部接触施用、静脉施用、肠胃外施用、腹腔施用、肌肉施用、病灶内施用、鞘内施用、鼻内施用或皮下施用，或向受试者植入例如小型渗透泵的缓释装置。施用是通过包括肠胃外和透粘膜的任何途径(例如，口、鼻、肺、直肠、口腔、阴道、眼和透皮途径)。
[0052]
术语“衍生物”和“类似物”在这里可互换使用，并且表示在不存在或存在一个或更
多个原子和/或原子的组的情况下，具有与母体化合物相同的母核，但与母体化合物的键合顺序不同的化合物及其组合。例如，衍生物与母体化合物的不同之处可以在于母核上存在的一个或更多个取代基，所述取代基可以包括一个或更多个原子、官能团或亚结构。衍生物与母体化合物的不同之处也可以在于母核内的原子之间的键合顺序不同。通常，衍生物可以被构想成至少在理论上由母体化合物经由化学和/或物理过程来形成。
[0053]
如这里所使用的，“抗氧化剂”可以指可以防止或延迟一些类型的细胞损伤和/或氧化的人造物质或天然物质。在包括水果和蔬菜的许多食物中发现了抗氧化剂。抗氧化剂也可以作为膳食补充剂。示例性抗氧化剂可以包括：β
‑ꢀ
胡萝卜素、叶黄素、番茄红素、硒、维生素a、维生素c和维生素e。也可以使用本领域技术人员已知的其它抗氧化剂。可以以任何合适的量使用这里描述的抗氧化剂。
[0054]“共施用”是指刚在施用这里描述的附加疗法或活性剂或添加剂之前或之后，同时施用这里描述的化合物或组合物。本公开的化合物或组合物可以单独施用或者可以共施用于需要的受试者。共施用意味着包括单独或组合(多于一种化合物或药剂)地同时或顺序施用化合物。当需要时，制剂也可以与其它活性物质组合。
[0055]
在本公开中，“包括”及其变型、“含有”和“具有”等可以具有美国专利法赋予它们的含义，并可以意味着“包括”及其变型等；“基本上由
……
构成”或“基本上构成”同样具有美国专利法赋予的含义，并且该术语是开放式的，只要其被列举的基本或新颖特征不被超过所列举的基本或新颖特征的存在改变，就允许存在超过被列举的基本或新颖特征，但是排除了现有技术实施例。
[0056]
如这里所使用的，“联合施用”包括在持续时间内至少部分地重叠。例如，当联合施用两种药剂(例如，这里所述的具有生物活性的任意药剂或一类药剂)时，它们的施用在特定期望的时间内发生。药剂的施用可以在同一天开始和结束。只要两种药剂在同一天至少服用至少一次，一种药剂的施用也可以在第二种药剂的施用之前一天(或若干天)。类似地，只要两种药剂在同一天服用至少一次，一种药剂的施用就可以超出第二种药剂的施用。活性剂不必每天同时服用来包括联合施用。
[0057]
如这里所使用的，“有效量”或“治疗有效量”是足以影响诸如有益效果的包括临床结果的期望的生物效应的量。如此，“有效量”取决于其适用的环境。有效量可以根据本领域已知的诸如被治疗个体的疾病状态、年龄、性别和体重的因素而变化。可以每天施用若干分开的剂量，或者剂量可以按照治疗情况的紧急程度指示地成比例减少。此外，本公开的化合物、组合物或制剂可以根据需要频繁施用以达到治疗量。
[0058]
如这里所使用的术语“凝胶”可以指不容易流动的液体且不是固体(即，半固体)的材料。凝胶可以由天然存在的材料或合成的材料形成。凝胶可以非有序到微有序来表现一些双折射、液晶特性。可以局部施用凝胶。
[0059]
如这里所使用的术语“炎症性肠病”具有其通常的医学含义，并且是指结肠和小肠的一组炎症适应症/疾病。示例性炎症性肠病可以包括但不限于克罗恩病、溃疡性结肠炎、约翰氏病、贝塞特综合征、胶原性结肠炎、转移性结肠炎、不确定性结肠炎、感染性结肠炎、缺血性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎以及紧密相关的病症和胃肠道紊乱。
[0060]
如这里所使用的术语“抑制”是指防止、减少、减慢或阻止。在一个实施例中，当与不存在化合物、组合物或制剂的情况下的量或速率相比时，在存在化合物、组合物或制剂的
情况下发生的过程或反应的量或速率降低至少大约10％，化合物、组合物或制剂可以被认为抑制至少一种蛋白质(例如， g-csf、il-2、scf、vegf、cx3cl1、igfbp5、igfbp6、il-1α、il-1β、 il-6、il-9、mcp-1、mip-3α、il12p40/70、mig、tnf-α、vcam-1和nf-κb) 的活力。在另一个实施例中，当与不存在化合物、组合物或制剂的情况下的量或速率相比时，在存在化合物、组合物或制剂的情况下发生的过程或反应的量或速率降低至少大约20％，化合物、组合物或制剂可以被认为抑制过程或反应。在其它实施例中，当与不存在化合物、组合物或制剂的情况下的量或速率相比时，在存在化合物、组合物或制剂的情况下发生的过程或反应的量或速率降低至少大约25％、大约30％、大约40％、大约50％、大约60％、大约70％、大约75％或大约80％，化合物、组合物或制剂可以被认为抑制一种或更多种蛋白质(例如，g-csf、il-2、scf、vegf、cx3cl1、igfbp5、 igfbp6、il-1α、il-1β、il-6、il-9、mcp-1、mip-3α、il12p40/70、mig、 tnf-α、vcam-1和nf-κb)的活力。在又一实施例中，化合物、组合物或制剂可以被认为抑制一种或更多种蛋白质的活力，即，阻止其发展。
[0061]
如这里所使用的，“间歇施用”包括施用活性剂一段时间(其可以被认为是“第一施用时间段”)，之后是未服用或以较低的维持剂量服用药剂的时间 (其可以被认为是“间歇时间段”)，之后是再次施用药剂的一段时间(其可以被认为是“第二施用时间段”)。通常，在施用的第二阶段期间，药剂的剂量水平将与施用的第一时间段期间施用的剂量水平相匹配，但可以按医学上必要的方式增加或减少。
[0062]
根据本公开的“胶状物”是一类凝胶，所述凝胶是由悬浮液构成的半固体体系，所述悬浮液由通过液体互穿的小无机颗粒或大的有机分子组成，其中结构粘着基质包含通常是水的高部分液体。
[0063]
如这里所使用的“液体”是由处于其液态下的组合物构成的剂型。液体是可倾倒的；它在室温下流动并与其容器共形。液体显示牛顿流动特性或假塑性流动特性。在实施例中，如这里所使用的“半液体”可以具有液体和另一制剂(即，悬浮液、乳液、溶液、霜剂、凝胶和胶状物等)两者的性质。
[0064]“骨髓分化初级应答基因88”或“myd88”是一种在人类中由myd88 基因编码的蛋白质。myd88在先天性免疫应答和适应性免疫应答中起核心作用。该蛋白质用作白细胞介素-1和toll样受体信号通路中的基本信号转导。这些通路调节许多促炎基因的激活。编码的蛋白质由n末端死亡结构域和c 末端toll-白介素1受体结构域构成。
[0065]
如这里所使用的，术语“软膏”可以指可用于病症、综合征或疾病(例如，炎症性肠病)的治疗性治疗的高度粘稠的液体或半液体制剂。
[0066]
如这里所使用的，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。可以基于预期的施用途径来选择载体的类型。药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散体以及用于临时制备无菌局部用溶液或分散体的无菌粉末。这种介质和药剂用于药物活性物质的使用是本领域公知的。除了任何常规介质或药剂与组合物(例如，这里所描述的式i、式i的衍生物/类似物、或其药学上可接受的盐、其溶剂、其水合物或其多晶型物)不相容之外，对于本公开，其在眼用组合物中的使用是预期的。
[0067]
如这里所使用的“药用载体”或“载体”还可以包括在所用剂量和浓度下对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒性的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。生理上可接受的
载体通常是含水ph缓冲溶液。生理上可接受的载体的示例包括：缓冲液，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于大约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和包括葡萄糖、甘露糖或糊精的其它碳水化合物；螯合剂，诸如edta；糖醇，诸如甘露醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如 tween
tm
、聚乙二醇(peg)和pluronics
tm
。
[0068]
此外，“药学上可接受的”意指被联邦或州政府的管理机构或者除了美国之外的国家中的相应机构批准或可批准的，或者被列入美国药典或其它普遍认可的药典中的用于动物的并且更具体地用于人类的。
[0069]
如这里所使用的术语“ph剂”或“缓冲剂”可以指用作ph调节剂的化合物或缓冲液。这些包括但不限于甘油缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、葡萄糖酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或也可包括柠檬酸磷酸盐缓冲液。可以以任何合适的量使用ph剂或缓冲剂。
[0070]
如这里所描述的术语“防腐剂”可以指防止这里所述的化合物或组合物或制剂的不期望的化学变化的物质或化学物质。合适的防腐剂可以包括例如苯扎氯铵、硫汞撒、氯丁醇、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、苯乙醇、依地酸二钠、山梨酸、聚季铵盐(onamer m polyquat)、溴十六烷、氯化十六烷基吡啶、苄基溴、edta、硝酸苯汞、乙酸苯汞、硫汞撒、硫柳汞、乙酸和硼酸苯汞、硫酸多粘菌素b、尼泊金甲酯和尼泊金丙酯(methyl andpropyl parabens)、氯化季铵、苯甲酸钠、丙酸钠和过硼酸钠以及本领域技术人员已知的其它试剂或者其组合。可以以任何合适的量使用防腐剂。
[0071]
如这里所使用的术语“预防”及其变型以及其它语法等同物包括防止发展、发生、阻碍或避免疾病或病症症状以及减少症状的发生。预防可以是完全的(即，没有可检测的症状)或部分的，使得观察到的症状比没有治疗将可能发生的症状少。所述术语还包括预防性益处。对于要预防的疾病或病症，即使该疾病的诊断可以还没被做出，也可以将组合物施用于患有特定疾病的风险的患者，或者报告一种或更多种生理症状的疾病的患者。
[0072]
这里提供的范围被理解为范围内的所有值的简写。例如，1至50的范围被理解为包括来自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、 32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、 49或50以及上述整数之间的诸如以1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8 和1.9为例的所有中间十进制值构成的组的任意数值、数值的组合或子范围。对于子范围，具体考虑从范围的任一端延伸的“嵌入子范围”。例如，1至50 的示例性范围的嵌入子范围可以包括在一个方向上的1至10、1至20、1至 30和1至40或者在另一方向上的50至40、50至30、50至20和50至10。范围可以在这里表达为从“大约”一个具体值和/或至“大约”另一具体值。当表达这样的范围时，另一方面包括从一个具体值和/或至另一个具体值。类似地，当值被表达为近似值时，理解的是，通过使用先前的“大约”，具体值形成另一方面。还理解的是，每个范围的端点对于另一端点都是有意义的，并且独立于另一端点。还理解的是，存在这里公开的多个值，并且除了值本身之外，每个值在这里也被公开为“大约”具体值。还理解的是，在整个申请中，以多种不同格式提供数据，并且该数据表示端点和起始点以及数据点的任何组合的范围。例如，如果公开了具体数据点“10”和具体数据点“15”，则理解的是，大于、大于或等于、小于、小于或
等于、等于10和15以及在 10和15之间被认为是公开的。还理解的是，两个具体单元之间的每个单元也被公开。例如，如果公开了10和15，则还公开了11、12、13和14。
[0073]
如这里所使用的“受体相互作用蛋白”或“rip1”描述了作为细胞存活和死亡的关键调节剂的蛋白激酶。rip1和rip2还具有属于死亡结构域超家族、允许招募大蛋白质复合物启动不同的信号通路的c末端结构域。
[0074]
如这里所使用的，“盐”、“盐形式”或“药学上可接受的盐”可以包括碱加成盐(由游离羧基或其它阴离子基团形成)，所述碱加成盐衍生自诸如以氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化氨、氢氧化钙或氢氧化铁为例的无机碱和诸如异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的有机碱。这些盐与任何游离阳离子基团形成为酸加成盐，并且通常与诸如以盐酸、硫酸或磷酸为例的无机酸或者诸如乙酸、柠檬酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等的有机酸形成。本公开的盐可以包括通过氨基与诸如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸等的无机酸的质子化而形成的胺盐。本公开的盐还包括通过氨基与诸如对甲苯磺酸、乙酸等的合适的有机酸的质子化而形成的胺盐，例如。预期用于本公开的实践的添加赋形剂是本领域普通技术人员可获得的添加赋形剂，例如，添加赋形剂记载在相关内容通过引用包含于此的美国药典第xxii卷和国家处方集第xvii卷，u.s.pharmacopoeia convention，inc.， rockville，md.(1989)中。
[0075]
根据本公开的“半固体凝胶”是半固体。半固体制剂表观粘度可以随着浓度的增加而增加。
[0076]
如这里所使用的，“顺序地施用”包括两种药剂(例如，这里所描述的化合物或组合物)的施用在同一天分开地发生或不在同一天发生(例如，连续多天发生)。
[0077]
根据本公开的“溶液”可以是透明、均一的液体剂型，所述溶液包含溶解在溶剂或相互混溶的溶剂的混合物中的一种或更多种化学物质。溶液是包含溶解在合适的溶剂或相互混溶的溶剂的混合物中的一种或更多种溶解的化学物质的液体制剂。由于溶液中药物物质的分子是均一分散的，所以使用溶液作为剂型通常提供施用时的均一剂量的保证和当稀释或另外混合溶液时的良好的准确性。
[0078]
如这里所使用的术语“溶剂”是指水性或非水性的液体溶剂。溶剂的选择主要取决于组合物对所述溶剂的溶解度和施用模式。水溶剂可以仅由水构成，或者可以由水加一种或更多种可混溶的溶剂构成，并且可以包含溶解的诸如糖、缓冲剂、盐或其它赋形剂的溶质。更常用的非水溶剂是短链有机醇 (诸如甲醇、乙醇、丙醇)、短链酮(诸如丙酮)以及聚醇(诸如甘油)。溶剂可以以任何合适的量存在。
[0079]“受试者”或“患者”是指人类或诸如哺乳动物的非人类动物。“受试者”可以包括任何动物，所述动物包括马、狗、猫、猪、山羊、兔、仓鼠、猴、豚鼠、大鼠、小鼠、蜥蜴、蛇、绵羊、牛、鱼和鸟。人类受试者可以被称为患者。
[0080]
如这里所使用的“悬浮液”是包含分散在液体载体中的固体颗粒的液体剂型。
[0081]
如这里所使用的，术语“综合征”可以指始终一起发生的一组症状或由一组相关症状表征的病症。综合征(例如，炎症性肠综合征)可以是一组彼此相关的医学体征和病症，并且经常与特定疾病相关。另一方面，疾病可以是其背后有明确的原因限定的健康状况。然而，综合征(来自于希腊词语“一起运行(run together)”)会产生许多症状而没有明确的原因。它们可以提出潜在疾病的可能性，或者甚至提出发展疾病的可能性。
[0082]
如这里所使用的术语“治疗”或其变型以及语法等同物包括缓解、缓和、改善或预防疾病、症状(例如炎症性肠病)或病症、预防并发症、改善或预防症状的潜在代谢原因、抑制疾病或症状(例如，阻止疾病或病症的发展、缓解疾病或症状、导致疾病或症状消退、缓解由疾病或症状引起的症状、或者停止疾病或症状的症状，并且意图包括预防。所述术语还包括获得治疗益处和/或预防益处。治疗益处是指根除或改善正在治疗的潜在疾病。另外，通过消除或改善与潜在疾病相关的一种或更多种生理学症状来实现治疗益处，使得观察到患者中的改善，尽管患者仍然可能患有潜在疾病。
[0083]
如这里所使用的，“粘度”是指流体的流动阻力。粘度剂可以在这里使用，并且包括例如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、本领域技术人员已知的其它试剂、或者它们的组合。
[0084]
术语“重量百分比”或“％(w/w)”是指基于组分和溶剂的重量计算的溶液中组分的百分比。例如，组分的1％(w/w)溶液将使1g的组分溶解在 100g溶剂中。术语“体积百分比”或“％(v/v)”是指基于组分和溶剂的体积计算的溶液中的组分的百分比。例如，组分的1％(v/v)溶液将使1ml的组分溶解在100ml的溶剂中。术语“重量/体积百分比”或“％(w/v)”是指基于组分的重量和基于溶剂体积计算的溶液中的组分的百分比。例如，组分的1.0％(w/v)溶液将使1g的组分溶解在100ml的溶剂中。
[0085]
2、化合物
[0086]
如上面所讨论的，本发明的一个方面提供由下面的式1表示的化合物、其光学异构体或其药学上可接受的盐。
[0087]
[式1]
[0088][0089]
其中：n为0、1或2；a为-a
1-，所述-a
1-是从由丙氨酸(ala，a)、精氨酸(arg，r)、天冬酰胺(asn，n)、天冬氨酸(asp，d)、半胱氨酸(cys， c)、谷氨酸(glu，e)、谷氨酰胺(gln，q)、甘氨酸(gly，g)、组氨酸(his， h)、异亮氨酸(ile，i)、亮氨酸(leu，l)、赖氨酸(lys，k)、甲硫氨酸(met， m)、苯丙氨酸(phe，f)、脯氨酸(pro，p)、丝氨酸(ser，s)、苏氨酸(thr， t)、色氨酸(trp，w)、酪氨酸(tyr，y)和缬氨酸(val，v)构成的组中独立地选择的氨基酸，所述氨基酸的两个末端通过酰胺键结合到羰基或胺基； r1为直链或支链c
1-36
烷基、包括至少一个双键的直链或支链c
2-36
烯基、或者包括至少一个三键的直链或支链c
2-36
炔基。
[0090][0091]
术语“本发明的化合物”和等同表述意味着包括如在上文中所描述的式的化合物，其表述包括药学上可接受的盐和溶剂化物，例如，水合物、上下文所允许的药学上可接受的盐的溶剂合物。
[0092]
根据本发明的一些实施例，a1可以是r1可以是直链或支链 c
1-36
烷基。
[0093]
化合物的非限制示例包括下面的化合物：
[0094]
[式a]
[0095][0096]
[式b]
[0097][0098]
[式c]
[0099][0100]
[式d]
[0101][0102]
[式e]
[0103][0104]
[式f]
[0105][0106]
[式g]
[0107][0108]
[式h]
[0109][0110]
[式i]
[0111][0112]
[式j]
[0113][0114]
[式k]
[0115][0116]
[式l]
[0117][0118]
[式m]
[0119][0120]
[式n]
[0121][0122]
[式o]
[0123][0124]
根据本发明实施例的化合物对于预防或治疗包括炎症适应症、癌症和眼科适应症的各种疾病是有效的。更具体地，所述化合物对于抑制细胞因子和/ 或趋化因子(例如，g-csf、il-2、scf、vegf、cx3cl1、igfbp5、igfbp6、 il-1α、il-1β、il-6、il-9、mcp-1、mip-3α、il12p40/70、mig、tnf-α和vcam-1)的表达。所述化合物对于抑制由myd88(myddosome复合物) 和/或rip1介导的炎症信号通路中的iκb的分解也是有效的，从而防止nf-κb 被转运到细胞的细胞核中。此外，化合物在靶细胞/组织中的有效浓度保持足够的时间。
[0125]
3、制备方法
[0126]
本发明的另一方面提供了用于制备由式1表示的化合物的方法。如下面示出的反应式1所示，所述方法包括：使化合物2与化合物3反应以制备化合物4(步骤1)；在碱的存在下使化合物4水解以制备化合物5(步骤2)；使化合物5与化合物6反应以制备化合物7(步骤3)；在碱的存在下使化合物7水解以制备化合物8(步骤4)；使化合物8与化合物9反应以制备化合物10(步骤5)；在碱的存在下使化合物10水解以制备式i的化合物(步骤6)。
[0127]
[反应式1]
[0128][0129]
其中，a、r1和n与前文中定义的相同，r2为直链或支链c
1-5
烷基。
[0130]
在一些实施例中，在步骤1中，化合物2可以在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edci)、羟基苯并三唑(hobt)和碱的存在下与化合物3结合。所述碱可以是有机碱或无机碱。有机碱的非限制性示例包括吡啶、三乙胺(tea)、n,n-二异丙基乙胺(dipea)和1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7
‑ꢀ
烯(dbu)。无机碱的非限制性实例包括氢氧化钠、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯和氢化钠。这些可以化学剂量地使用或过量使用，可以单独使用或组合使用。可以用于使化合物2与化合物3反应的溶剂的非限制性示例包括醚(例如，四氢呋喃(thf)、二氧六环、乙醚和1,2-二甲氧基乙烷)、醇(例如，甲醇、乙醇、丙醇和丁醇)、二甲基甲酰胺(dmf)、二甲基亚砜(dmso)、二氯甲烷(dcm)、二氯乙烷、水、丙酮、苯磺酸酯、甲苯磺酸酯、氯苯磺酸酯、二甲苯磺酸酯、乙酸乙酯、乙酸苯酯、苯丙酸酯、苯丁酸酯、柠檬酸酯、乳酸酯、羟基丁酸酯、乙醇酸酯、马来酸酯、酒石酸酯、甲烷磺酸酯、丙磺酸酯、萘-1-磺酸酯、萘-2-磺酸酯和扁桃酸酯。所述溶剂可以单独使用或组合使用。
[0131]
步骤2中的碱可以是有机碱或无机碱。同样地，可以在步骤2中使用的有机碱的非限制性示例包括吡啶、三乙胺、n,n-二异丙基乙胺(dipea)和 1,8-二氮杂双环[5.4.0]二烯-7-烯(dbu)。无机碱的非限制性示例包括氢氧化钠、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯和氢化钠。这些可以化学计量地使用或过量使用，可以单独使用或组合使用。可以用于使化合物4与化合物5反应的溶剂的非限制性示例包括醚(例如，四氢呋喃(thf)、二氧六环、乙醚和1,2-二甲氧基乙烷)、醇(例如，甲醇、乙醇、丙醇和丁醇)、二甲基甲酰胺(dmf)、二甲基亚砜(dmso)、二
氯甲烷(dcm)、二氯乙烷、水、丙酮、苯磺酸酯、甲苯磺酸酯、氯苯磺酸酯、二甲苯磺酸酯、乙酸乙酯、乙酸苯酯、苯丙酸酯、苯丁酸酯、柠檬酸酯、乳酸酯、羟基丁酸酯、乙醇酸酯、马来酸酯、酒石酸酯、甲烷磺酸酯、丙磺酸酯、萘-1-磺酸酯、萘-2-磺酸酯和扁桃酸酯。所述溶剂可以单独使用或组合使用。
[0132]
可以以与步骤1相同或相似的方式执行步骤3和步骤5。可以以与步骤2 相同或相似的方式执行步骤4和步骤6。
[0133]
化合物2的制备
[0134]
作为反应式1的起始材料的由下面式2表示的化合物2的示例可以通过例如下面描述的制备方法a来制备。
[0135]
[式2]
[0136][0137]
其中，n为0、1或2；a为-a
1-，所述-a
1-是从由丙氨酸(ala，a)、精氨酸(arg，r)、天冬酰胺(asn，n)、天冬氨酸(asp，d)、半胱氨酸(cys， c)、谷氨酸(glu，e)、谷氨酰胺(gln，q)、甘氨酸(gly，g)、组氨酸(his， h)、异亮氨酸(ile，i)、亮氨酸(leu，l)、赖氨酸(lys，k)、甲硫氨酸(met， m)、苯丙氨酸(phe，f)、脯氨酸(pro，p)、丝氨酸(ser，s)、苏氨酸(thr， t)、色氨酸(trp，w)、酪氨酸(tyr，y)和缬氨酸(val，v)构成的组中独立地选择的氨基酸，所述氨基酸的两个末端通过酰胺键结合到羰基或胺基； r1为直链或支链c
1-36
烷基、包括至少一个双键的直链或支链c
2-36
烯基、或者包括至少一个三键的直链或支链c
2-36
炔基。
[0138]
[制备方法a]
[0139]
由下面示出的式a表示的化合物在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、羟基苯并三唑和碱的存在下与从由丙氨酸(ala，a)、精氨酸(arg，r)、天冬酰胺(asn，n)、天冬氨酸(asp，d)、半胱氨酸(cys，c)、谷氨酸(glu， e)、谷氨酰胺(gln，q)、甘氨酸(gly，g)、组氨酸(his，h)、异亮氨酸 (ile，i)、亮氨酸(leu，l)、赖氨酸(lys，k)、甲硫氨酸(met，m)、苯丙氨酸(phe，f)、脯氨酸(pro，p)、丝氨酸(ser，s)、苏氨酸(thr，t)、色氨酸(trp，w)、酪氨酸(tyr，y)和缬氨酸(val，v)构成的组中选择的氨基酸结合以形成酰胺键，从而制备化合物2。
[0140]
[式a]
[0141][0142]
(r1与式2中定义的相同)
[0143]
4、组合物/制剂
[0144]
本发明的又一方面提供了用于预防、改善和治疗各种疾病(例如，炎症适应症、癌症和眼科适应症)的组合物，所述组合物包括作为活性组分的至少一种化合物、至少一种光学异构体或至少一种盐。
[0145]
根据一些实施例的组合物可以抑制包括g-csf、il-2、scf、vegf、 cx3cl1、igfbp5、igfbp6、il-1α、il-1β、il-6、il-9、mcp-1、mip-3α、 il12p40/70、mig、tnf-α和vcam-1的细胞
因子和/或趋化因子的表达。根据其它实施例的组合物可以抑制nf-κb的活性。根据其它实施例的组合物可以抑制由myd88介导的炎症信号转导复合物的形成。根据其它实施例的组合物可以抑制由rip1介导的炎症信号转导复合物的形成。根据其它实施例的组合物可以抑制由pellino-1介导的炎症信号转导复合物的形成。
[0146]
在一些实施例中，本发明提供了用于预防、改善和治疗炎症性肠病(包括紧密相关的病症)的组合物，所述组合物包括作为活性组分的至少一种化合物、至少一种光学异构体或至少一种盐。炎症性肠病可以包括但不限于溃疡性结肠炎、白塞病和克罗恩病。所述组合物还可以包括添加剂。
[0147]
在一些实施例中，本发明提供了用于预防、改善或治疗多发性硬化、牛皮癣、败血症、地图状萎缩、湿性老年性黄斑病、干性老年性黄斑病、糖尿病视网膜病变、感染性肺病、细菌性肺炎、病毒性肺炎、弥漫性大b细胞淋巴瘤、病毒感染、自身免疫性疾病、包括淋巴瘤的血癌和内部器官中的肿瘤，所述组合物包括作为活性组分的至少一种化合物、至少一种光学异构体或至少一种盐。
[0148]
在一些实施例中，本发明提供了用于预防、改善或治疗脱发的组合物，所述组合物包括作为活性组分的至少一种化合物、至少一种光学异构体或至少一种盐，其中，所述活性组分抑制头皮和毛囊中il-6的表达。
[0149]
本发明包括适于这里所述化合物的施用的制剂。如果附加组分对于待治疗的具体状况是药学上可接受的，则这里所述的化合物可以与诸如赋形剂(例如，一种或更多种赋形剂)、抗氧化剂(例如，一种或更多种抗氧化剂)、稳定剂(例如，一种或更多种稳定剂)、防腐剂(例如，一种或更多种防腐剂)、 ph调节和/或缓冲剂(例如，一种或更多种ph调节和/或缓冲剂)、渗透压调节剂(例如，一种或更多种渗透压调节剂)、增稠剂(例如，一种或更多种增稠剂)、悬浮剂(例如，一种或更多的悬浮剂)、粘合剂(例如，一种或更多种粘合剂)、增粘剂(例如，一种或更多种增粘剂)等的添加剂在制剂(包括药学组合物)中。在一些实施例中，制剂可以包括如这里所述的两种或更多种附加组分(例如2、3、4、5、6、7、8或更多种附加组分)的组合。例如，在一些实施例中，添加剂包括加工助剂、药物递送调节剂和增强剂，诸如磷酸钙、硬脂酸镁、滑石粉、单糖、二糖、淀粉、明胶、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、葡萄糖、羟丙基-β-环糊精、聚乙烯吡咯烷酮、低熔点蜡、离子交换树脂等，以及其任意两种或更多种的组合。其它适合的药学上可接受的赋形剂描述于通过引用包含于此的“remington's pharmaceuticalsciences”，mack pub.co.，new jersey(1991)”和“remington：the scienceand practice of pharmacy”，lippincott williams&wilkins，philadelphia，第20 版(2003)和第21版(2005)”中。
[0150]
适用于通过任何医学上可接受的方法施用的药物组合物的制剂包括在本发明中。药物制剂可以包括适合施用方式的药学上可接受的载体和药学上可接受的化合物(组合物)。例如，这里所述的组合物的制剂可以适用于口服施用。它们可以以包括溶液、悬浮液、半液体、半固体、凝胶、乳剂、软膏，片剂和霜剂的各种形式形成。片剂形式可以包括乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、磷酸钙、玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、明胶、二氧化硅胶体、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸和其它赋形剂中的一种或更多种、着色剂、填料、粘合剂、稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂、调味剂、染料、崩解剂和药学上相容的载体。
[0151]
组合物(制剂)可以经由包括但不限于口、鼻、肺、直肠、口腔、阴道、眼部和透皮途
28.3mmol)、edci(5.96g，31.1mmol)、hobt(4.20g，31.1mmol)和三乙胺 (11.8ml，84.9mmol)混合在二氯甲烷中制得混合溶液。将脯氨酸甲酯盐酸盐(proline methyl ester hydrochloride，5.15g，31.1mmol)加入到混合物溶液中。将所得混合物在室温下搅拌过夜，减压浓缩，使用碳酸氢钠水溶液稀释，使用乙酸乙酯萃取3次。全部有机层使用盐溶液洗涤，并使用1n hcl洗涤3 次。使用盐溶液洗涤产物，使用无水硫酸镁干燥，减压浓缩，得到(s)-甲基 1-((s)-1-棕榈酰基吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-羧酸酯(11.4g，产率87％)。
[0164]1h-nmr(300mhz，cdcl3)δ4.69-4.65(m，1h)，4.54-4.58(m，1h)， 3.83-3.93(m，1h)，3.58-3.72(m,5h)，3.45-3.53(m，1h)，1.89-2.31(m， 10h)，1.60-1.64(m，2h)，1.25(m，24h)，0.88(t，j＝6.87hz，3h)。
[0165]
ms(esi)，计算值c
27h48
n2o4464.4，发现值m/z465.2(m+h
+
)。
[0166]
步骤2：(s)-1-((s)-1-棕榈酰基吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-羧酸的制备
[0167]
将步骤1中制备的(s)-甲基1-((s)-1-棕榈酰基吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-羧酸酯(15.0g，32.3mmol)与四氢呋喃混合。向混合溶液中加入氢氧化钠(2.58g， 64.6mmol)水溶液。将所得混合物在室温下搅拌过夜并浓缩。加入1n hcl 以调节ph至1.0。使用乙酸乙酯萃取其水层3次。将全部有机层使用无水硫酸镁干燥并浓缩，得到为白色固体的(s)-1-((s)-1-棕榈酰基吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-羧酸(13.2g，产率91％)。
[0168]
ms(esi)，计算值c
26h46
n2o4450.3，发现值m/z451.1(m+h
+
)。
[0169]
步骤3：乙基2-((s)-1-((s)-1-棕榈酰基吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-酰氨基)乙酸酯(ethyl 2-((s)-1-((s)-1-palmitoylpyrrolidine-2-carbonyl)pyrrolidine-2-carboxamido)acetate)的制备
[0170]
将步骤2中制备的(s)-1-((s)-1-棕榈酰基吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-羧酸 (12g，26.6mmol)与二氯甲烷混合。向混合溶液中加入甘氨酸乙酯盐酸盐 (4.09g，29.3mmol)、edci(5.62g，29.3mmol)、hobt(3.96g，29.3mmol) 和三乙胺(11.1ml，79.8mmol)。将所得混合物在室温下搅拌过夜，减压浓缩，使用碳酸钠水溶液稀释，使用乙酸乙酯萃取3次。使用盐溶液洗涤全部有机层，并且使用1n hcl洗涤3次。使用盐溶液洗涤有机层，使用无水硫酸镁干燥，浓缩得到乙基2-((s)-1-((s)-1-棕榈酰基吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-酰氨基) 乙酸酯(11.1g，产率78％)。
[0171]
ms(esi)，计算值c
30h53
n3o5535.4，发现值m/z536.5(m+h
+
)。
[0172]
步骤4：2-((s)-1-((s)-1-棕榈酰基吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-酰氨基)乙酸的制备
[0173]
将步骤3中制备的乙基2-((s)-1-((s)-1-棕榈酰基吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2
‑ꢀ
酰氨基)乙酸酯(12g，22.4mmol)与四氢呋喃混合。向混合溶液中加入氢氧化钠(1.79g，44.8mmol)水溶液。将所得混合物在室温下搅拌过夜并浓缩。加入1n hcl以调节ph至1.0。水层用乙酸乙酯萃取3次。使用无水硫酸镁干燥全部有机层并浓缩全部有机层，得到2-((s)-1-((s)-1-棕榈酰基吡咯烷-2
‑ꢀ
羰基)吡咯烷-2-酰氨基)乙酸(9.5g，产率84％)。
[0174]
ms(esi)，计算值c
28h49
n3o5507.4，发现值m/z508.2(m+h
+
)。
[0175]
步骤5：(s)-甲基3-(4-羟基苯基)-2-(2-((s)-1-((s)-1-棕榈酰基吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-酰氨基)乙酰氨基)丙酸酯的制备
[0176]
将步骤4中制备的2-((s)-1-((s)-1-棕榈酰基吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-酰氨基)
乙酸(10g，19.7mmol)与四氢呋喃混合。向混合溶液中加入酪氨酸甲酯 (4.23g，21.7mmol)、edci(4.16g，21.7mmol)、hobt(2.93g，21.7mmol) 和三乙胺(8.19ml，59.1mmol)。将所得混合物在室温下搅拌过夜，减压浓缩，使用碳酸氢钠水溶液稀释，使用乙酸乙酯萃取3次。使用盐溶液洗涤全部有机层，并且使用1n hcl洗涤3次。使用盐溶液洗涤有机层，使用无水硫酸镁干燥，浓缩，并且使用mplc纯化以得到(s)-甲基3-(4-羟基苯基)-2-(2-((s)-1-((s)-1-棕榈酰基吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-酰氨基)乙酰氨基)丙酸酯(8.4g，产率62％)。
[0177]
ms(esi)，计算值c
37h60
n4o7684.4，发现值m/z685.2(m+h
+
)。
[0178]
步骤6：(s)-3-(4-羟基苯基)-2-(2-((s)-1-((s)-1-棕榈酰基吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-酰氨基)乙酰氨基)丙酸的制备
[0179]
将步骤5中制备的(s)-甲基3-(4-羟基苯基)-2-(2-((s)-1-((s)-1-棕榈酰基吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-酰氨基)乙酰氨基)丙酸酯(4.9g，7.16mmol)与四氢呋喃混合。向混合溶液中加入氢氧化钠(0.86g，21.5mmol)水溶液。将所得混合物在室温下搅拌过夜并浓缩。加入1n hcl以调节ph至1.0。水层使用乙酸乙酯萃取3次。使用无水硫酸镁干燥全部有机层并浓缩全部有机层，得到 (s)-3-(4-羟基苯基)-2-(2-((s)-1-((s)-1-棕榈酰基吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-酰氨基)乙酰氨基)丙酸(4.5g，产率93％)。
[0180]1h-nmr(300mhz，meod)δ7.04(d，j＝8.31hz，2h)6.70(d，j＝8.37hz， 2h)，4.38-4.68(m，3h)，3.44-4.04(m，6h)，2.91-3.13(m，2h)，1.81-2.38 (m，10h)，1.54-1.60(m，2h)，1.30(m，24h)，0.88(t，j＝6.63hz，3h)。
[0181]
ms(esi)，计算值c
37h58
n4o7670.4,，发现值m/z671.3(m+h
+
)。
[0182]
示例1.2：(s)-3-(4-羟基苯基)-2-(2-((s)-1-棕榈酰基吡咯烷-2-酰氨基)乙酰氨基)丙酸(pal-pgy-oh)
[0183][0184]
步骤1：(s)-甲基1-棕榈酰基吡咯烷-2-羧酸酯的制备
[0185]
将棕榈酸(7g，27.3mmol)、edci(5.78g，30.0mmol)、hobt(4.05g， 30.0mmol)和三乙胺(11.4ml，81.9mmol)与二氯甲烷混合。将脯氨酸甲酯盐酸盐(4.97g，30.0mmol)加入到混合溶液中。将所得混合物在室温下搅拌过夜，减压浓缩，使用碳酸钠水溶液稀释，使用乙酸乙酯萃取3次。使用盐溶液洗涤全部有机层，使用1n hcl洗涤3次。使用盐溶液洗涤有机层，使用无水硫酸镁干燥，减压浓缩，得到为粘稠液体的(s)-甲基1-棕榈酰基吡咯烷-2
‑ꢀ
羧酸酯(9.6g，产率96％)。
[0186]1h-nmr(300mhz，cdcl3)δ4.46-4.50(m，1h)，3.47-3.75(m,5h)， 1.90-2.36(m，6h)，1.59-1.69(m，2h)，1.25(m，24h)，0.88(t，j＝6.84hz， 3h)
[0187]
ms(esi)，计算值c
22h41
no3367.3，发现值m/z368(m+h
+
)。
[0188]
步骤2：(s)-1-棕榈酰基吡咯烷-2-羧酸的制备
[0189]
将步骤1中制备的(s)-1-棕榈酰基吡咯烷-2-羧酸酯(10.0g，27.2mmol) 与四氢呋
喃混合。向混合溶液中加入氢氧化钠(3.26g，81.6mmol)水溶液。将所得混合物在室温下搅拌过夜并浓缩。加入1n hcl调节ph至1.0。水层使用乙酸乙酯萃取3次。使用无水硫酸镁干燥全部有机层并浓缩全部有机层，得到白色固体的(s)-1-棕榈酰基吡咯烷-2-羧酸(8.6g，产率89％)。
[0190]1h-nmr(300mhz，cdcl3)δ4.59-62(m，1h)，3.42-3.59(m，2h)， 2.46-2.53(m，1h)，2.33-2.38(m，2h)，1.93-2.01(m，3h)，1.62-1.69(m， 2h)，1.25(m，24h)，0.88(t，j＝6.90hz，3h)
[0191]
ms(esi)，计算值c
21h39
no3353.3，发现值m/z354.2(m+h
+
)。
[0192]
步骤3：(s)-乙基2-(1-棕榈酰基吡咯烷-2-酰氨基)乙酸酯的制备
[0193]
将步骤2中制备的(s)-1-棕榈酰基吡咯烷-2-羧酸(10g，28.3mmol)、甘氨酸乙酯盐酸盐(4.34g，31.1mmol)、edci(5.76g，31.1mmol)、hobt(4.20g， 31.1mmol)和三乙胺(15.7ml，113mmol)与二氯甲烷混合。将所得混合物在室温下搅拌过夜，减压浓缩，使用碳酸钠水溶液稀释，使用乙酸乙酯萃取 3次。使用盐溶液洗涤全部有机层，使用1n hcl洗涤3次。使用盐溶液洗涤有机层，使用无水硫酸镁干燥，浓缩，得到(s)-乙基2-(1-棕榈酰基吡咯烷-2
‑ꢀ
酰氨基)乙酸酯(10.7g，产率86％)。
[0194]
ms(esi)，计算值c
25h46
n2o4438.3，发现值m/z439.1(m+h
+
)。
[0195]
步骤4：(s)-2-(1-棕榈酰基吡咯烷-2-酰氨基)乙酸的制备
[0196]
将步骤3中制备的(s)-乙基2-(1-棕榈酰基吡咯烷-2-酰氨基)乙酸酯(12g， 27.4mmol)与四氢呋喃混合。向混合溶液中加入氢氧化钠(2.20g，54.7mmol) 水溶液。将所得混合物在室温下搅拌过夜并浓缩。加入1n hcl调节ph至1.0。水层使用乙酸乙酯萃取3次。使用无水硫酸镁干燥全部有机层并浓缩全部有机层，得到为白色固体的(s)-2-(1-棕榈酰基吡咯烷-2-酰氨基)乙酸(10.2g，产率91％)。
[0197]
ms(esi)，计算值c
23h42
n2o4410.3，发现值m/z 411.3(m+h
+
)。
[0198]
步骤5：(s)-甲基3-(4-羟基苯基)-2-(2-((s)-1-棕榈酰基吡咯烷-2-酰胺基)乙酰氨基)丙酸酯的制备
[0199]
将步骤4中制备的(s)-2-(1-棕榈酰基吡咯烷-2-酰氨基)乙酸(7g， 27.3mmol)与二氯甲烷混合。向混合物溶液中加入酪氨酸甲酯(5.86g， 30.0mmol)、edci(5.78g，30.0mmol)、hobt(4.05g，30.0mmol)和三乙胺 (11.4ml，81.9mmol)。将所得混合物在室温下搅拌过夜，减压浓缩，使用碳酸氢钠水溶液稀释，使用乙酸乙酯萃取3次。使用盐溶液洗涤全部有机层，使用1n hcl洗涤3次。使用盐溶液洗涤有机层，使用无水硫酸镁干燥，浓缩，用mplc纯化，得到(s)-甲基3-(4-羟基苯基)-2-(2-((s)-1-棕榈酰基吡咯烷-2
‑ꢀ
酰胺基)乙酰氨基)丙酸酯(9.8g，产率61％)。
[0200]1h-nmr(300mhz，cdcl3)δ7.25-7.50(m，3h)，6.93(d，j＝8.34hz， 2h)6.70(d，j＝8.34hz，2h)，4.70-4.77(m，1h)，4.39-4.43(m，1h)， 3.95-4.21(m，1h)，3.41-3.72(m，5h)，2.92-3.12(m，2h)，1.91-2.35(m， 7h)，1.57-1.61(m，2h)，1.25(m，24h)，0.88(t，j＝6.87hz，3h)。
[0201]
ms(esi)，计算值c
33h53
n3o6587.4，发现值m/z588.1(m+h
+
)。
[0202]
步骤6：(s)-3-(4-羟基苯基)-2-(2-((s)-1-棕榈酰基吡咯烷-2-酰胺基)乙酰氨基)丙酸的制备
[0203]
将步骤5中制备的(s)-甲基3-(4-羟基苯基)-2-(2-((s)-1-棕榈酰基吡咯烷-2
‑ꢀ
酰胺基)乙酰氨基)丙酸酯(2.85g，4.85mmol)与四氢呋喃混合。向混合溶液中加入氢氧化钠(0.58g，14.6mmol)水溶液。将所得混合物在室温下搅拌过夜并浓缩。加入1n hcl调节ph至1.0。水层使用乙酸乙酯萃取3次。使用无水硫酸镁干燥全部有机层并浓缩全部有机层，得到为白色固体的(s)-3-(4
‑ꢀ
羟基苯基)-2-(2-((s)-1-棕榈酰基吡咯烷-2-酰胺基)乙酰氨基)丙酸(2.2g，产率 79％)。
[0204]1h-nmr(300mhz，meod)δ7.03(d，j＝8.40hz，2h)，6.70(d，j＝8.40hz， 2h)，4.58-4.61(m，1h)，4.33-4.56(m，1h)，3.58-4.37(m，4h)，2.96-3.15 (m，2h)，1.92-2.39(m，6h)，1.55-1.62(m，2h)，1.29(m，24h)，0.91 (t，j＝6.87hz，3h)。
[0205]
ms(esi)，计算值c
32h51
n3o6573.4，发现值m/z574.2(m+h
+
)。
[0206]
示例1.3：棕榈酰-l-丙氨酰-l-脯氨酰甘氨酰-l-酪氨酸(pal-apgy-oh)
[0207]
根据下面的反应式2制备所述化合物。
[0208]
[反应式2]
[0209][0210]
将化合物(1)(10g，46.5mmol)、化合物(2)(7.15g，51.2mmol)、edci
·
hcl (9.82g，51.2mmol)、hobt(6.92g，51.2mmol)和三乙胺(19.4ml，140mmol) 与二氯甲烷混合。将所得
混合物在室温下搅拌过夜，减压浓缩，使用碳酸钠水溶液稀释，使用乙酸乙酯萃取3次。使用盐溶液洗涤全部有机层，使用1n hcl洗涤3次。使用盐溶液洗涤有机层，使用无水硫酸镁干燥，减压浓缩，得到为粘稠液体的化合物(3)(产率91％)。
[0211]
lc-ms(esi)：计算值c
14h24
n2o5300.2，发现值m/z301.2(m+h
+
)。
[0212]
将化合物(3)(12g，40mmol)与四氢呋喃混合。向混合溶液中加入氢氧化钠(6.40g，160mmol)水溶液。将所得混合物在室温下搅拌过夜并浓缩。加入1n hcl调节ph至1.0。水层使用乙酸乙酯萃取3次。使用无水硫酸镁干燥全部有机层，并浓缩全部有机层，得到为白色固体的化合物(4)(产率 96％)。
[0213]
lc-ms(esi)：计算值c
12h20
n2o5272.1，发现值m/z 273.1(m+h
+
)。
[0214]
将化合物(4)(6.25g，23mmol)、化合物(5)(4.85g，25.3mmol)、edci
·
hcl (4.85g，25.3mmol)、hobt(43.42g，25.3mmol)和三乙胺(tea，12.8ml， 96mmol)与二氯甲烷混合。将所得混合物在室温下搅拌过夜，减压浓缩，使用碳酸钠水溶液稀释，使用乙酸乙酯萃取3次。全部有机层使用碳酸氢钠水溶液洗涤两次，使用盐溶液洗涤，使用1n hcl洗涤3次。使用盐溶液洗涤有机层，使用无水硫酸镁干燥，浓缩，得到为白色固体的化合物(6)(产率87％)。
[0215]
lc-ms(esi)：计算值c
22h31
n3o7449.2，发现值m/z 450.2(m+h
+
)。
[0216]
将化合物(6)(8g，17.8mmol)溶解于乙酸乙酯中。在室温下加入过量的二氧六环中4n hcl。将所得混合物在室温下搅拌4小时，减压浓缩，得到为白色固体的化合物(7)。
[0217]
lc-ms(esi)：计算值c
17h23
n3o5349.2，发现值m/z 350.2(m+h
+
)。
[0218]
将化合物(7)(0.25g，0.65mmol)、化合物(8)(boc-丙氨酸，0.12g， 0.65mmol)、edci
·
hcl(0.25g，1.30mmol)、hobt(0.18g，1.30mmol)和三乙胺(0.36ml，2.60mmol)与二氯甲烷混合。将所得混合物在室温下搅拌过夜，减压浓缩，使用碳酸钠水溶液稀释，使用乙酸乙酯萃取3次。将全部有机层使用碳酸氢钠水溶液洗涤两次，使用盐溶液洗涤，使用1n hcl洗涤3 次。使用盐溶液洗涤有机层，使用无水硫酸镁干燥，浓缩，使用mplc(二氯甲烷/2-丙醇)纯化，得到化合物(9)(产率3％)。
[0219]
lc-ms(esi)：计算值c
25h36
n4o8520.3，发现值m/z 520.7(m+h
+
)。
[0220]
将化合物(9)(0.11g，0.21mmol)溶解在乙酸乙酯中。在室温下加入过量的二氧六环中4n hcl的溶液，并在室温下搅拌4小时。将所得混合物减压浓缩，得到为白色固体的化合物(10)。
[0221]
lc-ms(esi)：计算值c
20h28
n4o6420.2，发现值m/z 420.6(m+h
+
)。
[0222]
向二氯甲烷中的棕榈酸(0.02g，0.08mmol)溶液加入化合物(10)(0.04g， 0.09mmol)、edci
·
hcl(0.03g，0.16mmol)、hobt(0.02g，0.16mmol)和三乙胺(0.04ml，0.32mmol)。将所得产物在室温下搅拌过夜，减压浓缩，使用碳酸钠水溶液稀释，使用乙酸乙酯萃取三次。使用盐溶液洗涤全部有机层，使用1n hcl洗涤3次。使用盐溶液洗涤有机层，使用无水硫酸镁干燥，浓缩，使用mplc(二氯甲烷/2-丙醇)纯化，得到化合物(11)(产率58％)。
[0223]
lc-ms(esi)：计算值c
36h58
n4o7658.4，发现值m/z 659.1(m+h
+
)。
[0224]
将化合物(11)(0.03g，0.05mmol)与四氢呋喃混合。加入氢氧化钠(0.008g， 0.20mmol)水溶液。将所得混合物在室温下搅拌过夜并浓缩。加入1n hcl 调节ph至1.0。水层使用乙酸乙酯萃取3次。使用无水硫酸镁干燥全部有机层并浓缩全部有机层，得到为白色固体的化合物(12)(产率93％)。
[0225]1h nmr(500mhz，cd3od)δ7.05(d，j＝8.50hz，2h)，6.70(d，j＝8.50hz， 2h)，4.59-4.65(m，2h)，4.39-4.41(m，1h)，3.96-3.99(m，1h)，3.84-3.89 (m，1h)，3.65-3.76(m，2h)，3.10-3.14(m，1h)，2.97-3.01(m，1h)， 2.20-2.24(m，3h)，2.09-2.14(m，1h)，1.96-2.03(m，2h)，1.58-1.60(m， 3h)，1.31-1.36(m，30h)，0.92(t，j＝7.15hz，3h)。lc-ms(esi)：计算值c
35h56
n4o7644.4，发现值m/z644.6(m+h
+
).
[0226]
使用化合物(7)作为起始原料，以与示例1.3中描述的方式相同的方式制备示例1.4至示例1.15的化合物。这些化合物的nmr数据如下所示。
[0227][0228]
示例1.4：棕榈酰甘氨酰-l-脯氨酰甘氨酰-l-酪氨酸(pal-gpgy-oh)1hnmr(500mhz，cd3od)δ7.03(d，j＝8.50hz，2h)，6.70(d，j＝8.50hz， 2h)，4.58-4.63(m，1h)，4.39-4.42(m，1h)，3.90-4.08(m，4h)，3.59-3.74 (m，3h)，3.09-3.12(m，1h)，2.96-3.00(m，1h)，1.99-2.31(m，7h)， 1.56-1.66(m，3h)，1.24-1.35(m，26h)，0.92(t，j＝7.05hz，3h)。lc-ms (esi)：计算值c
34h54
n4o7630.4，发现值m/z630.8(m+h
+
)。
[0229][0230]
示例1.5：((9z,12z)-十八烷-9,12-二烯酰)甘氨酰-l-脯氨酰甘氨酰-l-酪氨酸(linoleyl-gpgy-oh)1h nmr(500mhz，cd3od)δ7.03(d，j＝8.50hz， 2h)，6.71(d，j＝8.50hz，2h)，5.31-5.41(m，4h)，4.58-4.62(m，1h)， 4.39-4.42(m，1h)，3.99-4.08(m，2h)，3.70-3.73(m，1h)，3.59-3.67(m， 1h)，3.09-3.12(m，1h)，2.96-3.00(m，1h)，2.78-2.79(m，3h)，2.25-2.31 (m，1h)，2.18-2.22(m，2h)，1.99-2.13(m，7h)，1.56-1.64(m，3h)， 1.31-1.42
(m，18h)，0.93(t，j＝7.10hz，3h)。lc-ms(esi)：计算值 c
36h54
n4o7654.4，发现值m/z655(m+h
+
)。
[0231][0232]
示例1.6：棕榈酰-l-苯丙氨酰-l-脯氨酰甘氨酰-l-酪氨酸(pal-fpgy-oh) 1
h nmr(500mhz，cd3od)δ7.27-7.28(m，5h)，7.07(d，j＝8.45hz，2h)， 6.71(d，j＝8.30hz，2h)，4.59-4.63(m，1h)，4.40-4.42(m，1h)，3.99-4.02 (m，1h)，3.85-3.89(m，1h)，3.73-3.78(m，1h)，3.52-3.55(m，1h)， 3.09-3.16(m，2h)，2.86-3.02(m，3h)，1.95-2.22(m，8h)，1.44-1.62(m，4h)，1.31(m，25h)，0.92(t，j＝7.10hz，3h)。lc-ms(esi)：计算值c
41h60
n4o7720.4，发现值m/z721.1(m+h
+
)。
[0233][0234]
示例1.7：己酰-l-脯氨酰-l-脯氨酰甘氨酰-l-酪氨酸(hexanoyl-ppgy-oh) 1
h nmr(500mhz，cd3od)δ7.05(d，j＝8.50hz，2h)，6.70(d，j＝8.50hz，2h)，4.66-4.68(m，1h)，4.54-4.57(m，1h)，4.40-4.44(m，1h)，3.96-4.00 (m，1h)，3.85-3.89(m，1h)，3.73-3.76(m，1h)，3.51-3.68(m，3h)， 3.08-3.12(m，1h)，2.97-3.02(m，1h)，2.31-2.41(m，2h)，2.20-2.29(m， 2h)，1.92-2.12(m，5h)，(m，8h)，1.57-1.66(m，3h)，1.31-1.38(m， 5h)，0.93(t，j＝7.00hz，3h)。lc-ms(esi)：计算值c
27h38
n4o7530.3，发现值m/z530.7(m+h
+
)。
[0235][0236]
示例1.8：辛酰-l-脯氨酰-l-脯氨酰甘氨酰-l-酪氨酸(octanoyl-ppgy-oh) 1
h nmr(500mhz，cd3od)δ7.05(d，j＝8.50hz，2h)，6.71(d，j＝8.50hz，2h)，4.66-4.68(m，1h)，4.54-4.57(m，1h)，4.40-4.42(m，1h)，3.96-4.00 (m，1h)，3.85-3.89(m，1h)，3.73-3.77(m，1h)，3.51-3.68(m，3h)， 3.08-3.12(m，1h)，2.97-3.02(m，1h)，2.18-2.34(m，4h)，1.92-2.12(m， 5h)，1.57-1.61(m，2h)，1.32-1.35(m，10h)，0.92(t，j＝7.00hz，3h)。 lc-ms(esi)：计算值c
29h42
n4o7558.3，发现值m/z558.5(m+h
+
)。
[0237][0238]
示例1.9：癸酰-l-脯氨酰-l-脯氨酰甘氨酰-l-酪氨酸(decanoyl-ppgy-oh) 1
h nmr(500mhz，cd3od)δ7.03(d，j＝8.55hz，2h)，6.71(d，j＝8.40hz， 2h)，4.66-4.68(m，1h)，4.54-4.57(m，1h)，4.40-4.42(m，1h)，3.96-4.00 (m，1h)，3.85-3.89(m，1h)，3.73-3.77(m，1h)，3.51-3.68(m，3h)， 3.08-3.12(m，1h)，2.97-3.02(m，1h)，2.18-2.39(m，5h)，1.92-2.14(m， 6h)，1.57-1.61(m，2h)，1.32-1.36(m，14h)，0.92(t，j＝7.15hz，3h)。 lc-ms(esi)：计算值c
31h46
n4o7586.3，发现值m/z586.8(m+h
+
)。
[0239][0240]
示例1.10：十八烷酰-l-脯氨酰-l-脯氨酰甘氨酰-l-酪氨酸 (stearoyl-ppgy-oh)1h nmr(500mhz，cd3od)δ7.03(d，j＝8.55hz， 2h)，6.71(d，j＝8.25hz，2h)，4.66-4.68(m，1h)，4.55-4.57(m，1h)， 4.40-4.44(m，1h)，3.96-4.02(m，1h)，3.84-3.89(m，1h)，3.71-3.76(m， 1h)，3.48-3.68(m，4h)，3.08-3.12(m，1h)，2.97-3.02(m，1h)，2.14-2.42 (m，5h)，1.90-2.14(m，6h)，1.57-1.61(m，2h)，1.32-1.35(m，30h)， 0.92(t，j＝7.15hz，3h)。lc-ms(esi)：计算值c
39h62
n4o7698.5，发现值 m/z698.5(m+h
+
)。
[0241][0242]
示例1.11：己-5-烯酰-l-脯氨酰-l-脯氨酰甘氨酰-l-酪氨酸 (5-hexenoyl-ppgy-oh)1h nmr(500mhz，cd3od)δ7.05(d，j＝8.55hz， 2h)，6.70(d，j＝8.25hz，2h)，5.78-5.89(m，1h)，4.98-5.08(m，3h)， 4.66-4.69(m，1h)，4.54-4.57(m，1h)，4.40-4.44(m，1h)，3.97-4.01(m， 1h)，3.84-3.90(m，1h)，3.73-3.76(m，1h)，3.47-3.68(m，4h)，3.08-3.12 (m，1h)，2.97-3.01(m，1h)，2.33-2.42(m，2h)，2.20-2.30(m，2h)， 2.06-2.15(m，4h)，1.92-2.04(m，4h)，1.67-1.76(m，3h)。lc-ms(esi)：计算值c
27h36
n4o7528.3，发现值m/z529(m+h
+
)。
[0243][0244]
示例1.12：油酰-l-脯氨酰-l-脯氨酰甘氨酰-l-酪氨酸(oleyl-ppgy-oh) 1
h nmr(500mhz，cd3od)δ7.03(d，j＝8.50hz，2h)，6.71(d，j＝8.50hz， 2h)，5.34-5.38(m，2h)，4.66-4.68(m，1h)，4.55-4.57(m，1h)，4.40-4.42 (m，1h)，3.96-4.01(m，1h)，3.84-3.90(m，1h)，3.73-3.77(m，1h)， 3.53-3.69(m，4h)，3.08-3.12(m，1h)，2.97-3.01(m，1h)，2.18-2.39(m， 5h)，2.06-2.12(m，2h)，1.92-2.05(m，3h)，1.58-1.61(m，3h)，1.31-1.35 (m，25h)，0.92(t，j＝7.0hz，3h)。lc-ms(esi)：计算值c
39h60
n4o7696.4，发现值m/z697.3(m+h
+
)。
[0245][0246]
示例1.13：((9z,12z)-十八烷-9,12-二烯酰)-l-脯氨酰-l-脯氨酰甘氨酰-l
‑ꢀ
酪氨酸(linoleyl-ppgy-oh)1h nmr(500mhz，cd3od)δ7.05(d，j＝8.45hz， 2h)，6.71(d，j＝8.45hz，2h)，5.32-5.41(m，4h)，4.66-4.68(m，1h)， 4.55-4.57(m，1h)，4.40-4.43(m，1h)，3.96-4.01(m，1h)，3.84-3.89(m， 1h)，3.73-3.77(m，1h)，3.53-3.68(m，4h)，3.08-3.12(m，1h)，2.97-3.01 (m，1h)，2.80(t，j＝6.40hz，2h)，2.19-2.39(m，5h)，1.93-2.13(m， 10h)，1.59-1.61(m，3h)，1.31-1.40(m，15h)，0.92(t，j＝6.59hz，3h)。 lc-ms(esi)：计算值c
39h58
n4o7694.4，发现值m/z695.2(m+h
+
)。
[0247][0248]
示例1.14：棕榈酰-l-缬氨酰-l-脯氨酰-l-脯氨酰甘氨酰-l-酪氨酸 (pal-vppgy-oh)1h nmr(500mhz，cd3od)δ7.04(d，j＝8.35hz，2h)， 6.71(d，j＝8.35hz，2h)，4.67-4.70(m，1h)，4.52-4.58(m，1h)，4.39-4.43 (m，1h)，3.77-4.05(m，4h)，3.64-3.73(m，2h)，3.49-3.60(m，1h)，3.01-3.11(m，2h)，1.87-2.31(m，15h)，1.61-1.63(m，3h)，1.31(m， 24h)，1.01(d，j＝6.58hz，3h)，0.98(d，j＝6.58hz，3h)，0.92(t，j＝6.96hz， 3h)。lc-ms(esi)，计算值c
42h67
n5o8769.5，发现值m/z770.7(m+h
+
)。
[0249][0250]
示例1.15：癸酰-l-缬氨酰-l-脯氨酰-l-脯氨酰甘氨酰-l-酪氨酸 (decanoyl-vppgy-oh)1h nmr(500mhz，cd3od)δ7.05(d，j＝8.45hz， 2h)，6.71(d，j＝8.45hz，2h)，4.67-4.70(m，1h)，4.50-4.57(m，1h)， 4.39-4.43(m，1h)，3.95-4.05(m，2h)，3.80-3.91(m，1h)，3.65-3.70(m， 2h)，3.64-3.73(m，2h)，3.53-3.57(m，1h)，3.01-3.10(m，2h)，1.89-2.31 (m，12h)，1.61-1.63(m，3h)，1.31(m，24h)，1.01(d，j＝6.68hz，3h)， 0.97(d，j＝6.55hz，3h)，0.92(t，j＝7.05hz，3h)。lc-ms(esi)，计算值c
36h55
n5o8685.4，发现值m/z686.6(m+h
+
)。
[0251]
表1描绘了根据示例1至示例1.15的化合物
[0252]
表1：根据示例1至示例1.15的化合物
[0253]
[0254]
[0255]
[0256]
[0257]
[0258][0259]
示例2：试验
[0260]
示例2.1：抑制il-6的表达
[0261]
为了评价本发明的化合物对il-6表达的抑制，进行下面的实验。
[0262]
首先，raw264.7巨噬细胞购自美国典型培养物保藏中心(atcc； manassas，va)，并且在37℃的温度、5％co2气氛下，使用10％胎牛血清(fbs) 和含有1％青霉素/链霉素的达尔伯克改良伊格尔培养基(dmem)来培养。
[0263]
将培养的raw264.7巨噬细胞分入6孔细胞培养皿中。24小时之后，分别使用100nm浓度的化合物1.1、化合物1.2和smaducin-6预处理细胞30分钟，并使用脂多糖(lps)进一步处理2小时。使用收集这些细胞，并提取rna。从2μg的提取的rna中，合成cdna(互补脱氧核糖核酸)，进行逆转录聚合酶链反应(rt-pcr)和实时聚合酶链反应(实时pcr)。通过在琼脂糖凝胶上电泳确认来自rt-pcr的样品，并使用密度计进行定量。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)基因用作白细胞介素-6基因的内参照(loadingcontrol)。
[0264]
图1a示出了化合物1.1和化合物1.2抑制白细胞介素-6的表达的图像，图1b是示出化合物1.1和化合物1.2定量抑制白细胞介素-6表达的图。与未处理的样品相比，当使用根据本发明的化合物处理细胞时，抑制了由lps处理诱导的白细胞介素-6的表达。
[0265]
此外，将如上所述培养的raw264.7巨噬细胞细胞也分入6孔板中，24 小时后，使用100nm化合物1.1预处理30分钟，并使用lps进一步处理2 小时。使用细胞因子阵列(小鼠细胞因子阵列c3，raybiotech)收集上述细胞培养物，通过密度计定量细胞因子和趋化因子的量的变化。由本发明的化合物检测的细胞因子和趋化因子包括g-csf、il-2、scf、vegf、cx3cl1、 igfbp5、igfbp6、il-1α、il-1β、il-6、il-9、mcp-1、mip-3α、il12p40/70、 mig、tnf-α和vcam-1。与未处理的样品相比，当使用本发明的化合物处理细胞时，通过lps处理诱导的上面的细胞因子和趋化因子的表达被抑制为具有统计意义的(图2)。
[0266]
使用从50pm至500nm的不同浓度的化合物1.1处理raw264.7巨噬细胞30分钟，并使用100ng/ml的lps处理2小时。如上所述定量白细胞介素
ꢀ‑
6的诱导表达，结果如图3中所示。在raw264.7巨噬细胞中，在将白细胞介素-6的表达抑制在50％或以下(即ic
50
)的情况下，化合物1.1的浓度为大约1.6nm。
[0267]
示例2.2：nf-κb的活性的抑制
[0268]
为了评价本发明的化合物是否特异性地抑制由lps诱导的nf-κb信号，进行下面的
实验。
[0269]
具体地，使用effectene(qiagen，usa)将5x nf-κb-luc报告质粒转染到raw264.7细胞中。将转染的细胞使用100nm的化合物1.1预处理30分钟，并使用lps(100ng/ml)进一步处理2小时，并测量细胞中的荧光素酶活性 (图4描绘了示出化合物1.1和化合物1.2对nf-κb活化的相对抑制活性的图)。当使用根据本发明的化合物1.1和化合物1.2处理细胞时，lps诱导的 nf-κb的活化被抑制(图4)。
[0270]
此外，将5xnf-κb-luc报告质粒转染到raw264.7巨噬细胞中，并使用如上所述的本发明的化合物来处理。转染24小时之后，使用dmso(对照)、 100pm、1nm、和100nm的不同浓度的化合物1.1、参照化合物1(从化合物 1.1中除去棕榈酸的化合物)和smaducin-6预处理细胞30分钟，然后使用100ng/ml的lps处理细胞2小时。测量细胞中的荧光素酶活性，结果示于图 5中。
[0271]
如图5中所示，当使用化合物1.1预处理细胞(与使用smaducin-6预处理的细胞相似)时，由lps处理诱导的nf-κb活性的抑制随着化合物1.1的剂量的增大而增大。相比之下，当使用dmso或参照化合物1预处理细胞时， nf-κb的活性不以剂量依赖性的方式抑制。
[0272]
示例2.3：信号通路选择性
[0273]
为了评价根据本发明的化合物1.1的信号通路选择性，进行了下面的实验。进行下面的实验以测试化合物1.1是否特异性地抑制由个别诱导物 (individual inducer)诱导的信号通路。
[0274]
具体地，将5x nf-κb-luc报告质粒、sbe-luc报告质粒和bre-luc报告质粒分别转染到raw264.7巨噬细胞中。24小时之后，使用100ng/ml的 lps处理使用nf-κb-luc报告质粒转染的细胞，使用5ng/ml的tfg-β1处理使用sbe-luc报告质粒转染的细胞，使用100ng/ml的bmp6处理使用 bre-luc报告质粒转染的细胞2小时。
[0275]
图6是示出化合物1.1对不同信号通路的相对抑制活性的图。如图6中所示，当使用根据本发明的化合物1.1处理细胞时，lps处理诱导的nf-κb 的激活被抑制。然而，由bmp6处理诱导的bre的激活或由tfg-β1处理诱导的sbe的激活没有被化合物1.1抑制。因此，化合物1.1选择性地抑制nf-κb 信号通路的激活。
[0276]
具体地，最近研究已经报道，为了治疗炎症性肠病，tfg-β和bmp信号通路可以特异性地与粘膜伤口愈合等有关(nature 449(2007)，361-365，amj path，162(2)，(2003)，nature immunol.6，(2005)，507-514，j cell physiol.196 (2)：(2003)；258-64)和nature protocols，8(3)，(2013)627-637，其通过引用包含于此)，并且tfg-β可以是控制肠中的炎症状态(树突状细胞调节) 的非常重要的因素(j.clin.invest.，111(2003)，1297-1308，immunity，10(1999)， 39-49，eur.j.immunol.，36(2006)，864-874，immunity，25(2006)，319-329， cell 118(2004)，229-241，和j.immunol.179(2007)，2690-2694，其通过引用包含于此)。因此，本发明的化合物不抑制tfg-β和bmp信号通路的激活，这表明这些化合物对炎症性肠病的治疗具有显著效果。
[0277]
示例2.4：信号复合物的形成的破坏和κb抑制剂(iκb)的降解
[0278]
为了测试本发明的化合物是否可以破坏由myd88和/或rip1介导的炎症信号通路蛋白复合物(例如toll样受体(tlr)信号通路蛋白复合物)的形成，进行免疫沉淀实验。同时，执行下面的实验来测量随着测量iκb的浓度的改变的由于本发明的化合物的iκb的降
解。
[0279]
具体地，使用与toll样受体(tlr)信号通路蛋白复合物(例如irak1、 traf6、myd88、rip1和pellino-1)的形成有关的蛋白对应的抗体，通过免疫沉淀证实炎症信号通路蛋白复合物的形成的破坏。作为参照对照，使用蛋白质印迹比较并呈现来自总细胞裂解物的β-肌动蛋白的相对表达量。
[0280]
使用化合物1.1、化合物1.2和smaducin-6分别再处理raw264.7巨噬细胞细胞，并使用lps进一步处理。收集这些raw264.7巨噬细胞，在裂解缓冲液(包含0.5％triton x-100、20mmhepes(ph7.4)、150mm nacl、12.5mm β-甘油磷酸盐、1.5mm mgcl2、10mm naf、2mm dtt、1mm na3o4v、2mmegta和1mm蛋白酶抑制剂(pmsf)的pbs)中裂解，并以13000rpm离心 10分钟。对于免疫沉淀试验，使用蛋白a琼脂糖珠和与上述蛋白质对应的抗体将上清液在4℃下孵育12小时，随后使用裂解缓冲液洗涤所述珠三次。通过加入2x样品缓冲液将免疫沉淀的物质从珠中解离，并煮沸。将制备的样品装载在sds-聚丙烯酰胺凝胶上(图7)。
[0281]
为了测量iκb浓度的变化，分别使用在100nm浓度下的化合物1.1、化合物1.2和smaducin-6预处理raw264.7巨噬细胞，然后使用lps处理。提取的细胞裂解物用于使用iκbα抗体的免疫印迹，并使用β-肌动蛋白作为参照 (图7)。
[0282]
图7示出了表示化合物1.1和化合物1.2破坏由myd88或rip1介导的炎症信号通路蛋白复合物的免疫沉淀图像，另外表明这些化合物引起的iκb 的浓度变化。当根据本发明的化合物处理细胞时，与总细胞裂解物的对照相比，验证信号通路蛋白复合物(由myd88或rip1介导的)的形成被破坏(图 7)。与β-肌动蛋白参照的表达相比，使用本发明化合物处理的细胞通过去磷酸化iκb来稳定。
[0283]
当使用本发明的化合物处理细胞时，与总细胞裂解物的对照相比， myd88蛋白复合物和rip1蛋白复合物的形成及其活性基本上被破坏并被抑制(图7)。这些结果表明本发明的化合物可以用于治疗与pellino-1有关的疾病。此外，除了上述炎症性肠病以外，本发明的化合物可以有效预防或治疗地图状萎缩、湿性老年性黄斑病(湿性amd)、干性老年性黄斑病(干性 amd)、糖尿病视网膜病变、多发性硬化(ms)、肺部炎症、细菌性肺炎、病毒性肺炎、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl、gcb型或abc型)和脱发 (journal of clinical investigation，124(11)(2014)，4976-4988，j virology， 86(12)，(2012)，6595-6604，nature medicine，19(5)，(2013)，595-602， j.immunol.，187(2011)1-14，j.ind.derm.，132(2012)，43-49，med.intlamm.， (2010)，article id 928030，hair the transplant，4(2014)，4：1，exp.derm.，17(2007)，12-19和ddt dis.mech.5(2009)，e163-171，其通过引用包含于此)。
[0284]
分别使用100pm、1nm和100nm的各种浓度的化合物1.1、参照化合物 1和smaducin-6预处理骨髓源性巨噬(bmdm)细胞，然后使用100ng/ml 的lps进一步处理。提取的细胞裂解物如上所述用于免疫印迹，结果示于图 8中。
[0285]
与使用smaducin-6预处理的细胞相比，在使用化合物1.1预处理的细胞的情况下，由myd88和rip1介导的炎症信号通路复合物(例如，toll样受体(tlr)的形成还以化合物1.1的增大的剂量依赖性方式被破坏(图8)。同时，使用dmso或参照化合物1预处理的细胞形成以非剂量依赖性方式由 myd88和rip1介导的炎症信号通路复合物。
[0286]
同样，与总细胞裂解物的控制相比，当使用本发明的化合物1.1预处理细胞时，由
myd88和rip1介导的炎症信号通路复合物的形成基本上被破坏。使用bmdm细胞与本发明的化合物的实验表明本发明的化合物可以有效预防和治疗与myd88相关的多种疾病、预防和治疗与pellino-1的表达有关的疾病，诸如病毒感染(呼吸性病毒感染、病毒性肺炎)、细菌性肺炎、自身免疫性疾病、包括淋巴瘤的血癌、各种内脏(例如肝、肺、肠、前列腺、胰腺等)中的肿瘤以及预防和治疗多发性硬化(ms)。
[0287]
如图9中所示，分别使用100pm、1nm和100nm的各种浓度下的化合物1.1、参照化合物1和smaducine-6预处理raw 264.7巨噬细胞(顶部)和 bmdm细胞(底部)，然后使用100ng/ml的lps进一步处理。将结果与参考的β-肌动蛋白的表达进行比较。随着预处理化合物1.1和smaducin-6的剂量增大，细胞中的iκb的表达增加。同时，因为iκb被表明是磷酸化的，所以在使用dmso或参考化合物1预处理的细胞中iκb被降解。因此，本发明的化合物1.1抑制iκb的降解。
[0288]
示例2.5：评价剂量与疾病活动指数的相关性
[0289]
为了评价本发明的化合物在具有由硫酸葡聚糖钠(dss)诱导的慢性结肠炎动物模型中的疾病活动指数，进行了下面的实验。
[0290]
将小鼠(7-8周，雌性，c57bl/6)喂养在饮用水中的2％dss聚合物(大约50000da的mw)持续5至7天，每2至15天诱导结肠炎。然后，从喂养dds之后第三天，每天分别以50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg和400mg/k 的量向已经被dds诱导的结肠炎的小鼠口服施用化合物1.1，持续11天。每天检查小鼠的体重、腹泻和便血，并测量疾病活动指数(图10)。
[0291]
图10是根据口服施用的化合物1.1和化合物1.2的剂量的具有dss诱导的慢性结肠炎动物模型中的疾病活动指数分数的图。如图10中所示，当以从 50mg/kg至400mg/kg的不同剂量施用本发明的化合物1.1时，随着剂量的增加，本发明的化合物1.1的疾病活动指数减小，并且疾病活动指数的减小在 200mg/kg的剂量处达到饱和。因此，本发明的化合物以剂量依赖性的方式按比例地增加活性。
[0292]
示例2.6：肠病的活性的抑制
[0293]
为了评价本发明的化合物在具有诱导性急性结肠炎(由dss诱导)的动物模型中的抑制活性，进行下面的实验。
[0294]
将小鼠(7-8周，雌性，c57bl/6)喂养在饮用水中的2％dss聚合物(大约50000da的mw)7至8天，并诱导结肠炎。然后，每天分别以500mg/kg 的量施用柳氮磺吡啶(sulfasalazine)和以100mg/kg的量施用化合物1.1，持续14天。每天检查小鼠的体重、腹泻和便血，并测量疾病活动指数(dai) (图11a)。
[0295]
dai测量如下：
[0296]
1)体重减轻(0分：无体重减轻；1分：减重1-5％；2分：减重6-10％； 3分：减重11-20％；4分：减重20％以上)；
[0297]
2)腹泻(0分：正常大便；2分：松散大便；4分：腹泻)；以及
[0298]
3)便血(0分：正常粪便；2分：粪便轻度血；4分：粪便重度血)。
[0299]
图11a是表示呈现在具有dss诱导的急性结肠炎的动物模型中施用化合物的抑制活性的疾病活性指数分数的图。与抗炎症柳氮磺吡啶相比，本发明化合物在减少的剂量下具有足够的疾病活性指数分数，因此本发明化合物对治疗结肠炎更有效(图11a)。
[0300]
同时，如图11b中所示，由dss诱导的慢性结肠炎的小鼠以500mg/kg 的量口服施用
柳氮磺吡啶和以100mg/kg的量口服施用化合物1.1，持续10天。施用10天之后，从小鼠获得大肠组织，如上所述使用实时聚合酶链反应(实时pcr)测量组织中的趋化因子(ccl20、ccl2和cx3cl1)的表达。化合物1.1是通过抑制病原性免疫细胞向发炎组织的趋化性的有效的趋化因子阻断剂。
[0301]
示例2.7：结肠绒毛的组织学分析
[0302]
为了证实本发明化合物1.1对dds诱导的慢性结肠炎的治疗效果，对来自未处理组的大肠绒毛、dds诱导的慢性结肠炎模型组的大肠绒毛和使用化合物1.1处理的组的大肠绒毛进行拍照(图12至图16)。
[0303]
图12至图14是示出了来自未处理组的大肠绒毛、dds诱导的慢性结肠炎模型组的大肠绒毛和使用化合物1.1处理的组的大肠绒毛的图像。如图12 至图14中所示，与来自dss诱导的慢性结肠炎模型组的大肠绒毛相比，使用化合物1.1处理的组的绒毛与未处理组的绒毛相似。
[0304]
图15示出了从未处理组、dds诱导的慢性结肠炎模型组、使用化合物 1.1(100mpk)处理的组和使用作为用于结肠炎治疗的抗炎药的柳氮磺吡啶 (500mpk)处理的组获得的大肠组织的拍摄图像。图16示出了从未处理组、 dds诱导的慢性结肠炎模型组、使用化合物1.1(100mpk)处理的组和使用作为用于结肠炎治疗的抗炎药的柳氮磺吡啶(500mpk)处理的组获得的大肠粘膜的形态的拍摄图像，并且使用alcian蓝染色黏膜。如图15至图16中所示，当使用化合物1.1处理dss诱导的慢性结肠炎模型时，可以减轻发炎组织中可以发现的组织学损伤。此外，与未处理的组和使用柳氮磺吡啶处理的组相比，使用化合物1.1处理的组通过阻断发炎的细胞到组织中而具有较大的黏膜恢复。
[0305]
图17是示出了未处理组、dds诱导的慢性结肠炎模型组、使用化合物 1.1(100mpk)的处理组和使用柳氮磺吡啶(500mpk)的处理组中的大肠壁的恢复水平的图。
[0306]
具体地，如nature protocols，8(3)，(2013)627-637中所述，在dds 诱导的慢性结肠炎模型中的治疗第8天，以每100g体重44mg的剂量口服施用fitc-葡聚糖。施用4小时后，从小鼠的心脏以300-400μl的量收集血液。使用分光光度计测量血液中释放的fitc-葡聚糖。
[0307]
图17通过分析血液中释放的fitc-葡聚糖定量地示出了大肠粘膜的栓塞引起的大肠上皮组织的紧密连接或大肠壁的功能恢复得与目前的柳氮磺吡啶处理的差不多。因此，本发明的化合物对慢性结肠炎组织中肠上皮屏障和紧密连接功能的恢复具有显著的效果。
[0308]
示例2.8：血药浓度
[0309]
为了评价本发明的化合物1.1的静脉施用和口服施用的血(血液)浓度的变化，进行下面的实验。
[0310]
向小鼠静脉施用(i.v.，5mg/kg)或口服施用(50mg/kg)化合物1.1，施用24小时后，测量血浆中化合物1.1的浓度(图18和图19)。
[0311]
测量静脉施用时不同时间间隔处的化合物1.1的浓度的变化(图18)。浓度在距施用的1-2小时内减少至其原始浓度的1/100。血液中检测到非常低的浓度的化合物1.1。
[0312]
测量口服施用时不同时间段处化合物1.1的血药浓度的变化(图19)。在距口服施用30分钟后，血液中未检测到化合物1.1。
[0313]
表2示出了化合物1.1的药物代谢动力学参数。
[0314]
表2：化合物1.1的药物代谢动力学参数
[0315][0316]
示例2.9：组织分布
[0317]
为了评价根据本发明的化合物1.1的组织分布，进行下面的实验。
[0318]
向大鼠以10mg/kg的剂量口服施用化合物1.1，2小时和8小时后，在小肠组织、大肠组织、阑尾组织、小肠内残留物(retrimentum in small intestine) 和大肠内残留物(retrimentum in large intestine)中测定化合物1.1的浓度。结果在下面的表3中示出。
[0319]
表3：口服施用后的化合物1.1的浓度
[0320][0321][0322]
nd：未测出
[0323]
定量范围：肠8-2000ng/kg，残留物(retrimentum)30-1000ng/ml
[0324]
如表3中所示，距施用2小时、8小时处化合物1.1在诸如小肠、大肠和阑尾组织的肠组织中以定量范围分布，施用后8小时化合物1.1还分布于内部组织中。
[0325]
因此，当口服施用时，即使8小时后，在肠组织中也连续保持本发明的化合物的有效浓度。因为本发明的化合物是小分子药物，所以化合物可以容易地吸收到肠中，从而可以容易地达到其有效浓度。因此，通过口服施用，这里描述的化合物可以用于有效治疗炎症性肠病。
[0326]
示例2.10：mapk信号通路的激活的抑制
[0327]
为了测试本发明的化合物1.1和化合物1.2是否抑制mapk/erk信号通路，进行了蛋白质印迹分析(图20)。
[0328]
使用化合物1.1、化合物1.2和参照化合物1以100nm的浓度预处理 raw246.7巨噬细胞30分钟，然后使用lps进一步处理0小时、0.5小时、1 小时和2小时。来自使用化合物1.1和化合物1.2处理的细胞的mapk信号通路蛋白(erk1/2、jnk、p38)的磷酸化以与参照化合物1的情况相同的模式在0.5小时处激活，并且在处理的1小时或2小时后，以与参照化合物1 的情况相同的模式逐渐降低了这些蛋白质的磷酸化。β-肌动蛋白用作参照对照。通过使用抗磷酸化抗体的免疫印迹测量每种蛋白质磷酸化的浓度变化。参照化合物1、化合物1.1和化合物1.2不抑制mapk信号通路蛋白的磷酸化。
[0329]
图21示出了确定mapk信号通路蛋白(erk1/2、jnk、p38)的磷酸化的抑制的图像。使用dmso、参照化合物1、化合物1.1和smaducin-6以100pm、 1nm和100nm的不同浓度预处理bmdm细胞，然后使用lps进一步处理2 小时。此后，进行蛋白质印迹分析。根据本发明的化合物1.1与dmso和参照化合物1相似，尽管化合物1.1的剂量增大，但是化合物1.1与抑制 mapk/erk信号通路蛋白的磷酸化无关。
[0330]
示例2.11：与irak1/4抑制剂比较
[0331]
如示例2.3中所描述的，将5xnf-κb-luc报告质粒转染到raw246.7巨噬细胞中。24小时之后，使用化合物1.1(100nm)、白细胞介素-1受体相关激酶-1/4(irak1/4)抑制剂(25μm，cas 509093-47-4)和smaducin-6(100nm) 预处理使用nf-κb-luc报道质粒转染的细胞，持续30分钟，然后使用lps (100ng/ml)进一步处理2小时。随后，测量细胞中的荧光素酶活性。
[0332]
图22a示出了化合物1.1和irak1/4抑制剂(图22b)对nf-κb激活的抑制。在高irak1/4抑制剂浓度(例如，25μm)下，nf-κb激活被抑制，这与化合物1.1相似。
[0333]
测定raw246.7巨噬细胞的细胞裂解液中的iκb浓度的变化(图23)， raw246.7巨噬细胞被化合物1.1(100nm)、irak1/4抑制剂(25μm)和 smaducin-6(100nm)预处理并且然后被lps(100ng/ml)进一步处理。与化合物1.1类似，rak1/4抑制剂也抑制iκb的降解(图23)。
[0334]
图24示出了比较化合物1.1和irak1/4抑制剂对mapk/erk信号通路的抑制的图和图像。具体地，使用dmso、化合物1.1(100nm)、irak1/4 抑制剂(25μm)和smaducin-6(100nm)预处理raw246.7巨噬细胞30分钟，然后使用lps(100ng/ml)进一步处理两个小时。图24a具体地示出了免疫印迹结果以评价mapk信号通路蛋白(诸如erk、jnk和p38)的磷酸化是否受到上述处理的抑制。β-肌动蛋白用作参照。化合物1.1和smaducin-6 既不抑制mapk信号通路也不抑制蛋白质的磷酸化。相反，irak1/4抑制剂抑制至少一种或更多种mapk信号通路。
[0335]
此外，为了检查不期望的副作用(例如，通过irak1/4抑制剂抑制由 lps诱导的mapk通路中的ap-1转录信号的事实，这与化合物1.1相反)，进行了下面的实验。
[0336]
如示例2.3中所述，使用ap-1-luc报道质粒转染raw246.7巨噬细胞。 24小时后，使用化合物1.1(100nm)、irak1/4抑制剂(25μm)和smaducin-6 (100nm)预处理具有ap-1-luc报道质粒的转染细胞30分钟，然后使用lps (100ng/ml)进一步处理2小时。测量细胞中的荧光素酶活性，结果示于图 24b中。本发明的化合物1.1选择性抑制nf-κb信号通路的激活，但不抑制对细胞生物活性重要的mapk信号通路。然而，irak1/4抑制剂抑制mapk 信号通路，这会导致ap-1转录因子的抑制，使得当应用于生物学受试者时，会出现不期望的副作用。
[0337]
上面的示例2.1至2.11中的结果表明本发明的化合物可以(1)抑制使用 lps诱导的白细胞介素-6的表达和nf-κb的活性；(2)破坏由myd88和rip1 介导的炎症信号通路；以及(3)以比作为目前的结肠炎抗炎药物的柳氮磺吡啶的剂量小的剂量提供近似的疾病活动指数。此外，当口服施用本发明化合物时，血液中的浓度低，而有效浓度保持在细胞和/或组织中。具体地，在肠组织中，即使在施用8小时后也可以维持其有效浓度。因此，本发明的化合物用于治疗肠组织中的炎症疾病，具体地，有效地用于预防、缓解和治疗诸如溃疡性结肠炎、白塞病、克罗恩病等炎症性肠病。
[0338]
示例2.12：对视网膜色素上皮细胞的作用
[0339]
化合物1.1影响血管生成相关因子或抑制因子。
[0340]
使用5.5mm的葡萄糖作为参照对照处理arpe-19细胞。对于实验组，使用30mm葡萄糖处理arpe-19细胞48小时以诱导高血糖状况，同时使用 dmso、化合物1.1(10nm)和化合物1.1(50nm)处理。通过蛋白质印迹分析来测量nox-4、vegf、vegfr1、vegfr2、ang1、ang2、tie-2、epo和 epor蛋白的表达的变化。
[0341]
作为通过增强血管来控制出血的因子的ang1和tie-2根据化合物1.1的浓度的增加而增加(图25a)。然而，通过使用化合物1.1处理来降低产生ros (活性氧)的因子的nox4、诱导新血管因子的vegf、vegfr1、vegfr2、 ang1拮抗因子的ang2和糖尿病视网膜病变的因子的epo和epor的表达。
[0342]
此外，使用5.5mm的葡萄糖处理hrmec细胞作为参照。对于实验组，使用30mm葡萄糖处理hrmec细胞48小时以诱导高血糖状况，同时使用 dmso、化合物1.1(10nm)和化合物1.1(50nm)处理。通过qrt-pcr(定量rt-pcr)定量测定nox-4、vegf、vegfr1、vegfr2、ang1、ang2、 tie-2、epo和epor蛋白的表达变化。通过使用化合物1.1处理来降低作为新生血管的刺激因子的vegf前体的表达(图25b)。
[0343]
为了评价化合物1.1在血管生成期间对管形成的影响，在覆盖基质胶的微载玻片上培养hrmec细胞(8
×
103)，并使用20ng/ml的vegf处理4小时以诱导管形成。同时，对于参考组，用dmso处理细胞，对于实验组，细胞用50nm化合物1.1和1um钙黄绿素am处理。使用荧光显微镜观察细胞。
[0344]
图26示出了使用荧光显微镜观察细胞中的管形成的图像，其可以示出了化合物1.1抑制管形成。实际上，在人视网膜色素上皮细胞的arpe-19细胞中，观察到化合物1.1根据其浓度梯度抑制nox-4、vegf、vegfr1、vegfr2、 ang2、epo和epor蛋白的表达，并且ang1和tie-2的表达增加。如此，化合物1.1有效地用于预防、缓解或治疗诸如糖尿病视网膜病变的眼科适应症。此外，通过破坏myd88的信号通路复合物的形成，化合物1.1有效地用于预防、缓解或治疗地图状萎缩、湿性老年性黄斑病(湿性amd)、干性老年性黄斑病(干性amd)等(cell.149(4)，(2012)；847-859)。
[0345]
示例2.13：对糖尿病视网膜病变的作用
[0346]
每日以50mg/kg的剂量向小鼠施用链脲霉素(stz)，持续5天，获得具有诱导糖尿病视网膜病变的小鼠模型。从施用的第20天至第24天，将小鼠模型的实验组以0.2μg的量注射到小鼠的一只眼中，三次，间隔两天。施用 50天后，收集未使用化合物1.1处理的dr样品和使用化合物1.1处理的dr 样品。
[0347]
使用5μm的二硫代乙酸乙酯染色如上所述的来自每个小鼠组的收集的视网膜组
织，并测量每组的活性氧率(图27b)。与未处理的dr样品相比，注射化合物1.1的dr样品显示出降低的活性氧率。因此，本发明的化合物 1.1可有效地用于预防、缓解或治疗来自使用小鼠的生物实验的诸如糖尿病视网膜病变的眼部适应症。
[0348]
示例2.14：对多发性硬化的作用
[0349]
为了证实化合物1.1对多发性硬化的作用，使用mog35-55/cfu和ptx 对小鼠(10周龄，雌性)进行致敏，并获得实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型。实验方法在通过引用包含于此的oncotarget，第7卷(2016)no.13， 15382-15393中描述。
[0350]
如图28a中所示，以1mg/kg和40mg/kg的剂量皮下注射化合物1.1，持续25天，每隔一天一次。作为参照组，将10000单位的干扰素-β皮下注射25 天，每隔一天一次。测量并呈现临床评分。因此，与目前用于多发性硬化治疗的常规药物干扰素-β相比，化合物1.1显示以1mg/kg的最小剂量治疗多发性硬化是有效的。
[0351]
此外，当从每个实验组测量体重变化时，与eae疾病模型组相比，使用化合物1.1处理的组的体重未减轻(图28b)。换句话说，与目前用于治疗多发性硬化症的主要药物(例如，干扰素-β)相比，化合物1.1表现出相同或更高的治疗效果和安全性，因此有效地用于预防、缓解或治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎模型中的多发性硬化。
[0352]
示例2.15：对败血症的作用
[0353]
为了证实化合物1.1对败血症的作用，每组(7周龄，雄性)中的10只小鼠被麻醉，其后通过腹部切开暴露阑尾。将暴露的阑尾的回盲瓣的下部系在一起，并使用22号注射器针头制成单个孔。将治疗的阑尾重新插入腹腔中，并用线缝合以获得败血症诱导的小鼠模型(盲肠结扎和穿刺模型，clp模型)。实验方法描述于通过引用包含于此的embo mol med.(2015)3月12日；7 (5)：577-92中。
[0354]
在clp步骤2小时之后，以1mg/kg的剂量向治疗的小鼠皮下注射化合物1.1，以12小时为间隔，皮下注射3次。作为参照对照，以与化合物1.1 相同的方法以12mg/kg的剂量皮下注射smaducin-6。测量每组小鼠的存活率 (图29)。腹腔切开吻合后，阴性对照组未进行处理，在准备盲肠结扎和穿刺模型后，使用磷酸缓冲盐水(pbs)而不是药物化合物处理clp+pbs对照组，用代替药物治疗。因此，化合物1.1(1mg/kg)以60％的存活率对于治疗败血症是有效的，与高剂量的smadudin-6(例如12mg/kg)相比，先前没有使用低剂量的常规药物治疗败血症。换句话说，化合物1.1对盲肠结扎和穿刺(clp)模型有效，表明化合物1.1有效地用于预防、缓解或治疗败血症。
[0355]
《制剂1》颗粒
[0356]
式1的化合物
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2g
[0357]
乳糖
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1g
[0358]
根据本领域已知的方法制备颗粒。
[0359]
《制剂2》片剂
[0360]
[0361]
根据本领域已知的方法制备片剂。
[0362]
《制剂3》胶囊
[0363][0364][0365]
根据本领域已知的方法制备胶囊。
[0366]
《制剂4》注射剂
[0367][0368]
根据本领域已知的方法制备注射剂。
[0369]
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