表达全长ABCA4基因的腺相关病毒载体及应用的制作方法

pcc73102 dnae内含肽(npu intein，seq id no.4)和consensus dnae内含肽(cfa intein，seq id no.5)。
13.所述的内含肽选择seq id no.3所示的rma intein或seq id no.4所示的npu intein。
14.作为本发明的一种优选，所述的abca4基因片段选自以下任意一个：
15.(1)如seq id no.8所示的含内含肽片段的人abca4-n蛋白片段的编码基因，
16.(2)如seq id no.9所示的含内含肽片段的人abca4-c蛋白片段的编码基因。
17.一种abca4-n或abca4-c端蛋白表达框，由增强子-启动子-内含子-目的基因序列-polya信号组成，所述的增强子选自人214bp interphotoreceptor retinoid-binding protein(irbp)enhancer增强子序列(pmid:9723991或us20140275231)，启动子选自视网膜感光细胞特异的人rs1(retinoschisin 1)启动子，人rho(rhodopsin)启动子、人rk(rhodopsin kinase)启动子或小鼠car(cone arrestin)启动子；内含子选自sv40内含子；目的基因选自含内含肽片段的人abca4-n或abca4-c蛋白片段的编码基因；polya信号序列选自sv40 polya，bgh polya，hgh polya或rbg polya序列；所述的增强子、启动子、内含子、目的基因序列和polya之间通过键或核苷酸连接序列连接；所述的人abca4-n和abca4-c蛋白片段为abca4全长蛋白以p1150cys为分裂位点断裂所得。
18.作为本发明的一种优选，所述的内含肽选择seq id no.3所示的rma intein或seq id no.4所示的npu intein；优选seq id no.3所示的rma intein。
19.作为本发明的进一步优选，所述的含内含肽片段的人abca4-n端氨基酸序列如seq id no.6所示，所述的含内含肽片段的人abca4-c端氨基酸序列如seq id no.7所示。所述的含内含肽片段的人abca4-n蛋白片段的编码基因核苷酸序列如seq id no.8所示，含内含肽片段的人abca4-c蛋白片段的编码基因核苷酸序列如seq id no.9所示。
20.作为本发明的一种优选，所述的启动子选自rk启动子，序列如seq id no.10所示；内含子序列选自sv40内含子，序列如genbank登录号mk225672.1公开的核苷酸序列的第4863bp-4959bp所示；polya选自bgh ploya，序列如genbank登录号mt267334.1公开的核苷酸序列的第957bp-1181bp所示。
21.作为本发明的更进一步优选，所述的abca4-n端蛋白表达框的核苷酸序列如seq id no.11；所述的abca4-c端蛋白表达框的核苷酸序列如seq id no.12。
22.一种载体，含有本发明所述的abca4基因片段、或本发明所述的abca4-n或abca4-c端蛋白表达框。
23.作为本发明的一种优选，所述载体选自以下任意一种重组腺相关病毒载体血清型：aav1、aav2、aav3b、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aavrh10、aav-lk03或aavanc80d，优选aav2、aav5、aav8或aav9。
24.一种质粒组合物，包含本发明所述的含有所述的abca4-n端蛋白表达框的载体和含有所述的abca4-c端蛋白表达框的载体；优选包含所述的载体、aav的rep及cap蛋白表达质粒、辅助质粒；进一步优选包含所述的载体、aav的rep及cap蛋白表达质粒paav2/8以及辅助质粒padδf6。
25.一种重组腺相关病毒，由本发明所述的载体、aav的rep及cap蛋白表达质粒、辅助质粒共转染hek293细胞包装制备得到。
26.作为本发明的一种优选，所述的重组腺相关病毒由本发明所述的含有abca4-n蛋白表达框的载体、aav的rep及cap蛋白表达质粒、辅助质粒共转染hek293细胞包装制备得到。
27.作为本发明的一种优选，所述的重组腺相关病毒，由本发明所述的含有abca4-c蛋白表达框的载体、aav的rep及cap蛋白表达质粒、辅助质粒共转染hek293细胞包装制备得到。
28.一种重组腺相关病毒组合物，包含由本发明所述的含有abca4-n蛋白表达框的载体、aav的rep及cap蛋白表达质粒，以及辅助质粒共转染hek293细胞包装制备得到重组腺相关病毒；以及由本发明所述的含有abca4-c蛋白表达框的载体、aav的rep及cap蛋白表达质粒、以及辅助质粒共转染hek293细胞包装制备得到重组腺相关病毒。
29.本发明所述的abca4基因片段、所述的abca4-n或abca4-c端蛋白表达框、所述的载体、所述的质粒组合物、所述的重组腺相关病毒、所述的重组腺相关病毒组合物在制备治疗stgdi疾病的药物中的应用。
30.有益效果：
31.本发明提供了一种新设计高效且组织特异性表达abca4蛋白的重组腺相关病毒及其治疗stgdi的应用。本发明首先对abca4基因进行密码优化，提高了abca4蛋白表达水平。现有技术中未见对目标蛋白的断裂位点和内含肽序列进行系统筛选。而对于断裂内含肽介导的双aav载体技术，确定目标蛋白的最佳序列和分裂点将是至关重要的，因为这将极大的影响其在细胞内的蛋白剪切效率，以及目的蛋白质的三级结构和翻译后修饰，进而影响蛋白功能。在本发明中，我们基于蛋白结构和优化的abca4基因序列，对内含肽对目的蛋白的断裂位点和内含肽序列进行了系统的筛选。在本发明中，我们还在体内外发现使用rma内含肽能够使abca4蛋白的p1150cys位点分裂形成的两段多肽反式剪接形成全长蛋白，副产物几乎检测不到，显示出非常好安全性。最后，构建高效组织特异表达全长abca4的aav8 intein病毒载体，制备了aav8.rk.abca4-n与aav8.rk.abca4-c病毒，用于stgdi疾病的基因治疗研究。在stgdi(abca4-ko)疾病模型中，将低剂量(1
×
108gc/μl的aav8.rk.abca4-n与aav8.rk.abca4-c病毒等体积混合，每只眼注射1μl)，中剂量(1
×
109gc/μl的aav8.rk.abca4-n与aav8.rk.abca4-c病毒等体积混合，每只眼注射1μl)和高剂量(1
×
10
10
gc/μl的aav8.rk.abca4-n与aav8.rk.abca4-c病毒等体积混合，每只眼注射1μl)重组腺相关病毒组合分别通过视网膜下腔，注射至疾病小鼠眼底后评估基因治疗疗效。在给药后第3个月和第6个月，低剂量、中剂量和高剂量治疗组的眼底自发荧光强度均明显低于未治疗组的stgdi疾病小鼠(abca4-ko)，与野生型小鼠相似；给药后六个月，通过视网膜电图(electroretinogram，erg)检测发现，治疗组小鼠b波波幅均高于未治疗组，视网膜功能得到显著改善；高效液相色谱(hplc)检测发现aav8 intein基因治疗后3个月，有毒的类视黄醇二聚体a2e降低至正常水平，且全长的abca4蛋白在视网膜感光细胞中的表达恢复至正常水平的22％(低剂量治疗组)、24％(中剂量治疗组)和30％(高剂量治疗组)。以上结果显示，通过新设计优化的abca4蛋白编码序列、对内含肽断裂位点和内含肽序列的设计、以及对abca4蛋白aav8 intein表达框的设计，可在stgdi疾病模型中高效的转导视网膜光感受器细胞，并在高效地表达全长的abca4蛋白，实现疾病治疗的目标。
附图说明
32.图1 paav.cbh.abca4wt.bgh(a图)和paav.cbh.abca4co.bgh(b图)表达载体的质粒谱图
33.图2 abca4蛋白表达载体体外表达水平验证
34.图3 abca4目的基因序列内含肽断裂位点的设计、载体构建及验证
35.a为abca4目的基因序列内含肽断裂位点的设计
36.b为四种断裂内含肽系统示意图
37.c为实施例3中蛋白免疫印迹法对12个实验组以及对照组的载体全长abca4蛋白及副产物表达水平进行比较
38.d为c的统计图
39.图4 paav.rk.abca4.rmaintn.bgh和paav.rk.rmaintc.abca4.bgh两个载体的质粒图谱
40.图5重组腺相关病毒aav8.rk.abca4-n和重组腺相关病毒aav8.rk.abca4-c结构示意图
41.图6在病毒给药后一个月(a图)和六个月(b图)，低剂量治疗组、中剂量治疗组、高剂量治疗组、未治疗组、野生型小鼠b波波幅统计图
42.图7 aav8 intein基因治疗后视网膜细胞中abca4蛋白表达情况
43.a为abca4蛋白免疫荧光检测。基因治疗后3月通过免疫荧光检测所有组别小鼠眼球组织中abca4蛋白的表达，标尺＝50μm；
44.b为体内abca4蛋白表达水平检测。wb检测基因治疗后3月小鼠视网膜组织中abca4和gapdh；
45.c为体内abca4蛋白表达水平wb检测灰度值统计。用image j对(a)图进行分析统计相对灰度值。
46.图8各组小鼠眼底脂褐质的积累结果
47.图9用海德堡激光眼科诊断仪faf模块检测各组小鼠眼底自发荧光强弱结果
具体实施方式
48.实施例1：abca4蛋白目的基因序列优化及表达载体构建
49.abca4蛋白氨基酸序列如genbank数据库np_000341.2所示，全基因合成野生型abca4基因(abca4wt，genbank数据库nm_000350.3(104bp-6925bp))和密码子优化的abca4基因(abca4co，seq id no.1)，通过酶切连接分别构建paav.cbh.abca4wt.bgh(图1a，seq id no.15)和paav.cbh.abca4co.bgh(图1b，seq id no.16)表达载体。
50.实施例2：abca4蛋白表达载体体外表达水平验证
51.将实施例1中的paav.cbh.abca4wt.bgh和paav.cbh.abca4wt.bgh以相同的质粒量(250ng),通过peimax转染试剂转染培养于24孔板中的hek293细胞，72h后提取蛋白，利用蛋白免疫印迹法(western blot)对abca4蛋白的表达水平进行比较。结果显示密码子优化可以显著提高蛋白的表达水平(图2a)，通过对蛋白条带灰度值进行对比，密码子优化后abca4蛋白表达水平提高了4.7倍(图2b)。
52.实施例3：abca4目的基因序列内含肽断裂位点的设计、载体构建及验证
53.使用内含肽分别在abca4蛋白的p1150cys、p1140cys、p1177cys位点进行反式剪接，从1号位到1150号位半胱氨酸、从1号位到1140号位半胱氨酸或从1号位到1177号位半胱氨酸作为氮端序列(abca4-n)，从1151号位半胱氨酸到2235号位、或从1141号位半胱氨酸到2235号位、或从1178号位半胱氨酸到2235号位作为碳端序列(abca4-c)(图3a)。分别选择ssp内含肽(ssp
intein
，seq id no.2)、npu内含肽(npu
intein
，seq id no.3)、rma内含肽(rma
intein
，seq id no.4)和cfa内含肽(cfa
intein
，seq id no.5)四种断裂内含肽系统(图3b)，构建断裂内含肽abca4表达载体，共转染hek293细胞，检测全长abca4蛋白的表达效率。
54.按照ssp
intein
、npu
intein
、rma
intein
、cfa
intein
四种断裂内含肽系统和abca4蛋白的p1150cys、p1140cys、p1177cys三种内含肽断裂位点设置12组实验组，用全长abca4目的基因和egfp作为对照组，转染培养于24孔板中的hek293细胞，72h后提取蛋白，利用蛋白免疫印迹法对各组载体全长abca4蛋白表达水平进行比较。结果显示使用rma
intein
在abca4蛋白的p1150cys位点进行反式剪接，副产物几乎检测不到，全长abca4蛋白的表达效率最高(图3c，d)。
55.实施例4：基因治疗候选载体设计构建
56.为了进一步评估构建rma
intein
在abca4蛋白的p1150cys位点进行反式剪接后在体内的表达，基因治疗疗效和安全性。我们全基因合成了视网膜感光细胞特异rk启动子(seq id no.10)，通过t4连接亚克隆构建了病毒包装顺式质粒载体paav.rk.abca4.rmaintn.bgh(图4a，seq id no.17)和paav.rk.rmaintc.abca4.bgh两个载体(图4b，seq id no.18)，分别包含本发明所述的abca4-n端蛋白表达框(seq id no.11)和abca4-c端蛋白表达框(seq id no.12)。
57.实施例5：aav病毒制备与纯化
58.参考martin lock等报道包装和纯化重组aav病毒的方法[8]，采用pei将aav的rep及cap蛋白表达质粒(paav2/8)、辅助质粒(padδf6)和aav包装顺式质粒(paav.rk.rmaintc.abca4.bgh，seq id no.18；paav.rk.abca4.rmaintn.bgh，seq id no.17)分别共转染hek293细胞包装制备病毒aav8.rk.abca4-n(图5a，seq id no.13)和aav8.rk.abca4-c病毒(图5b，seq id no.14)，转染48h后，收获细胞和培养上清，使用碘克沙醇超速梯度离心纯化aav病毒，用数字定量pcr(ddpcr)法测定病毒滴度aav8.rk.abca4-n病毒滴度为7.38
×
10
13
gc/ml，aav8.rk.abca4-c病毒滴度为2.77
×
10
13
gc/ml。
[0059]
实施例6：aav8 intein基因治疗改善stgdi疾病小鼠erg功能
[0060]
使用实施例5中制备的aav8.rk.abca4-n和aav8.rk.abca4-c病毒等比例混合(简称aav8 intein)，通过视网膜下腔共同注射stgdi疾病小鼠(abca4-ko，4周龄，n＝10)。根据病毒注射剂量分为低剂量治疗组(1
×
108gc aav8 intein)，中剂量治疗组(1
×
109gc aav8 intein)和高剂量治疗组(1
×
10
10
gc aav8 intein)。病毒给药后一个月和六个月，分别通过erg检测不同刺激强度下各治疗组、未治疗组、野生型小鼠b波振幅。结果显示，在病毒给药后一个月，低剂量治疗组、中剂量治疗组、高剂量治疗组、未治疗组、野生型小鼠b波波幅均未出现统计学差异(图6a)；在病毒给药后六个月，治疗组小鼠b波波幅均高于未治疗组，且其中低剂量治疗组、中剂量治疗组与未治疗组的统计学差异最为显著(图6b，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001)，表明aav8 intein治疗后可以显著改善stgdi疾病小鼠的眼睛视网膜电生理功能。
trans-splicing expands adeno-associated virus transfer capacity in the retina.science translational medicine 2019,11(492):eaav4523.
[0073]
6.novikova o,topilina n,belfort m:enigmatic distribution,evolution,and function of inteins.j biol chem 2014,289(21):14490-14497.
[0074]
7.mills kv,johnson ma,perler fb:protein splicing:how inteins escape from precursor proteins.j biol chem 2014,289(21):14498-14505.
[0075]
8.lock m,alvira m,vandenberghe lh,samanta a,toelen j,debyser z,wilson jm:rapid,simple,and versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale.human gene therapy 2010,21(10):1259-1271.