一种检测人NRAS基因突变的引物、探针和试剂盒的制作方法

一种检测人nras基因突变的引物、探针和试剂盒
技术领域
1.本发明涉及一种检测人nras基因突变的引物、探针和试剂盒，属于分子生物学及生物技术领域。


背景技术：

2.ras基因是一种原癌基因，主要调控细胞生长、增殖和分化。ras蛋白位于细胞膜内侧，与三磷酸鸟苷(gtp)和二磷酸鸟苷(gdp)有很强的的亲和力，在细胞生长分化信号传递方面有重要作用。当ras基因发生突变时，ras蛋白结构随之发生改变，与gdp结合能力减弱，可不通过生长信号调节便与gtp结合自身活化，进而造成细胞不可控的进行增殖，导致癌症的发生。
3.大量研究表明，ras基因发生突变后，会导致egfr下游的信号通路活化异常，从而降低针对egfr靶向药物的疗效(如西妥昔单抗和帕尼单抗等)。明确ras基因的突变状态对于指导结直肠患者使用抗egfr靶向药物具有重要意义。
4.nras基因是ras原癌基因家族的成员，位于1号染色体短臂上(1p31)，负责编码并制造一种称为nras的蛋白，nras蛋白通过参与ras-raf-mek-erk通路，调控基因转录活动和细胞周期，与细胞增殖密切相关。
5.黑色素瘤发病率及致死率近几年来逐年提高，占全部肿瘤的3％左右，是皮肤癌症中最致命的类型之一。其中大约25％的黑色素瘤是由于nras基因的突变导致的，因此nras基因对于黑色素瘤的检测及治疗具有至关重要的作用。
6.目前对于基因突变的检测方法较多，如sanger测序法、焦磷酸测序法、高分辨率溶解曲线检测法(hrm)、荧光定量pcr法、数字pcr法等。现阶段较为常用的方法为sanger测序法和荧光定量pcr法，sanger测序法为基因突变检测等基因检测分析的金标准，对每一个碱基的读取具有极高的准确率，但同时也存在一些缺点，如灵敏度偏低、耗时较长；荧光定量pcr法也是一种常见的基因检测方法，但灵敏度依然存在一定的限制，由于nras基因突变检测较少且突变率偏低，因此需要一种较高灵敏度和准确度的检测方法。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明提供了检测人nras基因突变的引物、探针和试剂盒，通过简单操作将检测液相导入芯片中直接进行扩增，可同时检测多种nras基因突变：codon12突变型：g12d；codon13突变型：g13d；codon61突变型q61k和q61r，具有极高的灵敏度，检测限可达200copies/ml。
8.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
9.一种检测人nras基因突变的引物和探针，针对2号外显子上的codon12突变g12d的引物和探针的序列为：
10.正向引物nf1：5
′‑
tgctggtgtgaaatgactg-3
′
；
11.反向引物nr1：5
′‑
ctggattagctggattgtca-3
′
；
12.检测探针np1：5
′
荧光基团-aacaccatctgctc-3
′
猝灭基团；
13.封阻探针nb1：5
′‑
cgcttttcccaacaccacctgct-3
′
phosphorylation；
14.针对2号外显子上的codon13突变g13d的引物和探针的序列为：
15.正向引物nf2：5
′‑
ggtgtgaaatgactgagtaca-3
′
；
16.反向引物nr2：5
′‑
tggttctggattagctgga-3
′
；
17.检测探针np2：5
′
荧光基团-caac+a+t+cacctgct-3
′
猝灭基团；
18.封阻探针nb2：5
′‑
cgcttttcccaacaccacctgct-3
′
phosphorylation；
19.针对3号外显子上的codon61突变q61k的引物和探针的序列为：
20.正向引物nf3：5
′‑
aaacctgtttgttggacat-3
′
；
21.反向引物nr3：5
′‑
attggtctctcatggcact-3
′
；
22.检测探针np3：5
′
荧光基团-ctcttct+t+t+tccagc-3
′
猝灭基团；
23.封阻探针nb3：5
′‑
cttcttgtccagctgtatccagtatgt-3
′
phosphorylation；
24.针对3号外显子上的codon61突变q61r的引物和探针的序列为：
25.正向引物nf4：5
′
荧光基团-ctcttctcgtccag-3
′
猝灭基团；
26.反向引物nr4：5
′‑
attggtctctcatggcact-3
′
；
27.检测探针np4：5
′
荧光基团-ctcttct+t+t+tccagc-3
′
猝灭基团；
28.封阻探针nb4：5
′‑
cttcttgtccagctgtatccagtatgt-3
′
phosphorylation。
29.进一步，所述荧光基团为fam、hex、vic、rox或cy5；
30.所述猝灭基团为mgb或taqman探针(根据检测探针是否添加锁核酸修饰来决定)。
31.本发明还提供了一种检测人nras基因突变的试剂盒，其包含上述的引物和探针，还包括内参体系，所述内参体系引物和探针的序列为：
32.正向引物gf1：5
′‑
gctccctctttctttgcag-3
′
；
33.反向引物gr1：5
′‑
agtccttccacgataccaa-3
′
；
34.内参探针gp1：5
′
荧光基团-tcctgcaccaccaactgcttag-3
′
猝灭基团。
35.gapdh或g3pdh是甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)的英文缩写，是糖酵解反应中的一个酶，广泛分布于各种组织中的细胞，其编码基因位于第12号染色体12p13.31，是一种持家基因，由于其高度保守性及稳定的持续表达能力，因此常常用作检测试剂盒中的内参来监控检测反应中可能出现的问题。
36.上述检测探针的核苷酸序列的5
′
端用荧光基团进行标记，3
′
端用猝灭基团进行标记，部分探针使用锁核酸修饰，锁核酸修饰探针可提高探针tm值(每个锁核酸约提高2～5℃)，进而提高与对应模板之间结合的特异性；封阻探针同样可降低突变探针序列与野生型模板之间的非特异性结合，其中封阻探针序列的3
′
端使用磷酸化修饰，以防封阻探针与野生型模板结合后继续进行扩增。
37.进一步，所述荧光基团为fam、hex、vic、rox或cy5；
38.所述猝灭基团为mgb、bhq1或bhq2(根据检测探针是否添加锁核酸修饰来决定)。
39.进一步，所述试剂盒还包括10
×
dpcr buffer、dpcr酶、微流控芯片、油相a和油相b。
40.进一步，所述10
×
dpcr buffer包括mg
2+
、dntp；
41.所述dpcr酶包括taq酶和udg酶；
42.所述微流控芯片中的微腔室用于承载pcr反应体系进行pcr扩增反应；
43.油相a和油相b按照3：1的体积比混合后，通过50℃的加热后凝固，用于封闭微流控芯片中的微腔室。
44.进一步，所述dntp包括datp、dgtp、dctp和dutp；
45.本发明的有益效果在于：本发明所提供的人nras基因突变检测试剂盒通过数字pcr平台，将pcr反应置于微流控芯片中，通过将所检测模板更多的均匀分布于微流控芯片中，极大地有效的提高了检测的灵敏度。
附图说明
46.图1为本发明实施例2 codon12突变型g12d线性及灵敏度结果图；
47.图2为本发明实施例2 codon12突变型g12d检测结果图；
48.图3为本发明实施例2 codon13突变型g13d线性及灵敏度结果图；
49.图4为本发明实施例2 codon13突变型g13d检测结果图；
50.图5为本发明实施例2 codon61突变型q61k线性及灵敏度结果图；
51.图6为本发明实施例2 codon61突变型q61k检测结果图；
52.图7为本发明实施例2 codon61突变型q61r线性及灵敏度结果图；
53.图8为本发明实施例2 codon61突变型q61r检测结果图。
具体实施方式
54.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
55.以下实施例中的定量及线性实验，均设置平行的三次重复测试，结果取平均值。
56.实施例1
57.检测人nras基因突变的引物和探针，针对2号外显子上的codon12突变g12d的引物和探针的序列为：
58.正向引物nf1：5
′‑
tgctggtgtgaaatgactg-3
′
；
59.反向引物nr1：5
′‑
ctggattagctggattgtca-3
′
；
60.检测探针np1：5
′
荧光基团-aacaccatctgctc-3
′
猝灭基团；
61.封阻探针nb1：5
′‑
cgcttttcccaacaccacctgct-3
′
phosphorylation；
62.针对2号外显子上的codon13突变g13d的引物和探针的序列为：
63.正向引物nf2：5
′‑
ggtgtgaaatgactgagtaca-3
′
；
64.反向引物nr2：5
′‑
tggttctggattagctgga-3
′
；
65.检测探针np2：5
′
荧光基团-caac+a+t+cacctgct-3
′
猝灭基团；
66.封阻探针nb2：5
′‑
cgcttttcccaacaccacctgct-3
′
phosphorylation；
67.针对3号外显子上的codon61突变q61k的引物和探针的序列为：
68.正向引物nf3：5
′‑
aaacctgtttgttggacat-3
′
；
69.反向引物nr3：5
′‑
attggtctctcatggcact-3
′
；
70.检测探针np3：5
′
荧光基团-ctcttct+t+t+tccagc-3
′
猝灭基团；
71.封阻探针nb3：5
′‑
cttcttgtccagctgtatccagtatgt-3
′
phosphorylation；
72.针对3号外显子上的codon61突变q61r的引物和探针的序列为：
73.正向引物nf4：5
′
荧光基团-ctcttctcgtccag-3
′
猝灭基团；
74.反向引物nr4：5
′‑
attggtctctcatggcact-3
′
；
75.检测探针np4：5
′
荧光基团-ctcttct+t+t+tccagc-3
′
猝灭基团；
76.封阻探针nb4：5
′‑
cttcttgtccagctgtatccagtatgt-3
′
phosphorylation。
77.检测人nras基因突变的试剂盒，包含上述的引物和探针，还包括内参体系，内参体系引物和探针的序列为：
78.正向引物gf1：5
′‑
gctccctctttctttgcag-3
′
；
79.反向引物gr1：5
′‑
agtccttccacgataccaa-3
′
；
80.内参探针gp1：5
′
荧光基团-tcctgcaccaccaactgcttag-3
′
猝灭基团。
81.试剂盒还包括10
×
dpcr buffer、dpcr酶、微流控芯片、油相a和油相b。
82.其中，荧光基团为fam、hex、vic、rox或cy5；
83.猝灭基团为mgb、bhq1或bhq2(根据检测探针是否添加锁核酸修饰来决定)；
84.10
×
dpcr buffer包括mg
2+
、dntp(datp、dgtp、dctp和dutp)；
85.dpcr酶包括taq酶和udg酶；
86.微流控芯片中的微腔室用于承载pcr反应体系进行pcr扩增反应；
87.油相a和油相b按照3：1的体积比混合后，通过50℃的加热后凝固，用于封闭微流控芯片中的微腔室。
88.本发明试剂盒所检测位点突变信息如下表1。
89.表1试剂盒所检测位点突变信息
90.突变位点碱基变化cosmic idg12dc.35g＞acosm564g13dc.38g＞acosm573q61kc.181c＞acosm580q61rc.182a＞gcosm584
91.实施例2
92.人nras基因突变的检测方法，利用本发明实施例1提供的检测试剂盒配合一种微流控芯片进行，包括以下步骤：
93.按表2所示配置反应液：
94.表2
95.组分30μl5
×
dpcr buffer6μldpcr酶3μl引物探针混合液6μl待测样本15μl
96.具体的，其中待测样本为模拟临床样本，是对应各个突变位点的线性化质粒与正常人基因组混合模板；
97.具体的，其中各个突变位点的检测片段如下：
98.g12d：
[0099][0100]
g13d：
[0101][0102]
q61k：
[0103][0104]
q61r：
[0105][0106]
具体的，其中内参的检测片段如下：
[0107][0108]
具体的，混合模板按照一定的浓度进行梯度稀释，分别为：原倍、1∶2、1∶10、1∶20、1∶100、1∶1000；
[0109]
具体的pcr扩增程序如下：
[0110]
50℃ 10min 1个循环；95℃ 10min 1个循环；98℃ 20s，60℃ 30s 45个循环；其中50℃ 10min为udg酶作用时间；
[0111]
将上述pcr反应后的微控流芯片进行荧光信号采集后分析。
[0112]
样本检测结果判断与分析
[0113]
codon12突变型g12d：
[0114]
梯度稀释从左到右分别为：原倍、1∶2、1∶10、1∶20、1∶100、1∶1000，如表3，线性及灵敏度如图1，结果如图2。
[0115]
表3
[0116]
[0117][0118]
codon13突变型g13d：
[0119]
梯度稀释从左到右分别为：原倍、1∶2、1∶10、1∶20、1∶100、1∶1000，如表4，线性及灵敏度如图3，结果如图4。
[0120]
表4
[0121]
突变型模板浓度阳性点数模板浓度原倍45468.3721∶224435.9091∶10405.7841∶20172.4971∶10050.7011∶100010.140
[0122]
codon61突变型q61k：
[0123]
梯度稀释从左到右分别为：原倍、1∶2、1∶10、1∶20、1∶100、1∶100，如表5，线性及灵敏度如图5，结果如图6。
[0124]
表5
[0125]
突变型模板浓度阳性点数模板浓度原倍36256.4111∶221533.3531∶10477.9491∶20202.9181∶10040.5611∶100000
[0126]
codon61突变型q61r：
[0127]
梯度稀释从左到右分别为：原倍、1∶2、1∶10、1∶20、1∶100、1∶1000，如表6，线性及灵敏度如图7，结果如图8。
[0128]
表6
[0129][0130]