一种BPES综合征致病基因FOXL2突变位点的应用及其诊断试剂的制作方法

一种bpes综合征致病基因foxl2突变位点的应用及其诊断试剂
技术领域
1.本发明属于基因诊断技术领域，具体涉及一种bpes综合征致病基因foxl2突变位点的应用及其诊断试剂。


背景技术：

2.睑裂狭小-上睑下垂-倒向型内眦赘皮综合征(blepharophimosis-ptosis-epicanthusinversus syndrome，bpes)，又称先天小睑裂综合征(congenital blepharophimosis syndrome)或komoto’综合征，是一种常染色体显性遗传性疾病。发病率为1/5000，发病占上睑下垂的3.5％，男女比为2:1。bpes综合征是常常为家族性发病，外显率100％。
3.bpes综合症临床主要表现为双侧完全性重度上睑下垂，倒向性内眦赘皮，睑裂长度一般《20mm(正常长25～30mm，宽7～12mm)，内眦间距明显增宽，鼻梁扁平，低位耳等。有些合并存在小眼球、眼球震颤、眼睑内外翻、斜视等，如果形成对瞳孔过多遮盖，可以影响视觉发育，表现视力低常。患病女性均有原发或继发闭经，或是有月经不规则，不孕不育等。bpes共分为两型：ⅰ型和ⅱ型。i型为普通型，常通过患病男性传递，bpes女性患者除有眼睑异常表型外，还伴有卵巢衰竭；ii型，患病男女均可遗传给后代，bpes患者仅有眼睑缺损表型。两型的主要区别主要是ⅰ型受累女性同时伴有不孕症。迄今为止，临床上尚未找到可靠有效的方法来治疗bpesⅰ型患者的不孕症，仅可以通过重建手术来矫正bpes患者的上睑下垂，以改善其面貌。
4.forkhead boxl2(foxl2，mim 605597)基因突变会导致bpes综合征。研究表明，foxl2基因是bpes最常见的、首位致病候选基因，在bpesⅰ型和ⅱ型患者中均发现有foxl2基因突变的存在。foxl2基因是定位于染色体3q23的单一外显子基因，基因长2.7kb，包含一个特有的101个氨基酸的forkhead dna结构域(位置在第54-148残基区域)和一个与此分离但功能尚未阐明的多聚丙氨酸肽段。foxl2基因是一个在维持卵泡发育、卵巢正常功能中发挥重要作用的常染色体基因，主要在中小卵泡期的颗粒细胞中表达，通过抑制下游靶基因cyp11a1、cyp1941、ccnd2等启动子的转录活性，从而在卵泡颗粒细胞的增殖、分化、卵巢类固醇激素的生成过程中发挥重要作用。基因突变可影响foxl2蛋白对下游调控基因cyp19a1和ccnd2启动子的转录抑制，进而导致颗粒细胞功能及类固醇激素生成的异常，最终导致不孕症的发生。
5.因此，基因突变是导致疾病发生发展的重要遗传基础，基因诊断是确诊bpes综合征的重要遗传学标准。临床上需要针对不同突变建立相应的检测技术并用于明确病因和疾病诊断。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种bpes综合征致病基因foxl2突变位点的应
用及其诊断试剂，将bpes综合征患者和正常人群区分开。
7.本发明提供了一种bpes综合征致病基因foxl2突变位点foxl2:nm_023067.3:exon1:c.316_321dupcacaac:p.his106_asn107dup在制备bpes综合征诊断试剂或制备预防和/或治疗bpes综合征靶点药物中的应用。
8.本发明提供了一种用于bpes综合征基因诊断的试剂，所述试剂是扩增foxl2突变位点foxl2:nm_023067.3:exon1:c.316_321dupcacaac:p.his106_asn107dup的引物，包括核苷酸序列如seq id no:1所示的foxl2-f和核苷酸序列如seq id no:2所示的foxl2-r。
9.优选的，所述试剂包括测序引物，所述测序引物包括核苷酸序列如seq id no:3所示的foxl2-seqf和seq id no:4所示的foxl2-seqr。
10.优选的，所述试剂还包括pcr扩增试剂。
11.本发明提供了所述的试剂在制备bpes综合征诊断试剂盒中的应用。
12.优选的，利用所述诊断试剂盒检测样本中基因突变位点的基因型来诊断个体是否患有bpes综合征，所述基因突变位点为foxl2:nm_023067.3:exon1:c.316_321dupcacaac:p.his 106_asn107dup，检测结果为“c.316_321dupcacaac杂合子”，则判断foxl2基因存在突变，个体患有bpes综合征；若位点没有突变，则判断foxl2基因为野生型，个体是正常人。
13.优选的，所述样本为血液。
14.本发明提供了一种bpes综合征诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括权利要求2～4所述的试剂。
15.本发明提供了一种bpes综合征致病基因foxl2突变位点foxl2:nm_023067.3:exon1:c.316_321dupcacaac:p.his106_asn107dup在制备bpes综合征诊断试剂或制备预防和/或治疗bpes综合征靶点药物中的应用。本发明通过外显子组测序技术首次确切foxl2:nm_023067.3:exon1:c.316_321dupcacaac:p.his106_asn107dup位点突变可以导致bpes综合征发病。因此，以所述foxl2突变位点为分子标志物诊断bpes综合征。一方面，通过检测受试者是否携带有上述突变，用于遗传学上bpes综合征的筛查或诊断，以指导治疗。特别地，本发明所提供的诊断试剂盒可用于快速、有效地预测或诊断bpes综合征。另一方面，本发明为bpes综合征的发病机制研究奠定了重要基础，为bpes综合征患者的治疗提供全新的理论依据。第三方面，本发明可以为治疗bpes综合征提供可能的药物靶点。
附图说明
16.图1为bpes综合征家1号系遗传图谱；其中，
□
表示男性正常个体，
○
表示正常女性，
■
表示男性患者，
●
表示女性患者，
↗
表示先证者。
17.图2显示利用sanger测序检测1号家系foxl2:nm_023067.3:exon1:c.316_321dupcacaac:p.his106_asn107dup位点基因型的结果图，1号家系中先证者及先证者父亲、先证者小弟弟为患者(测序图中箭头所指为突变发生位置)。
18.图3显示bpes综合征2号家系遗传图谱；其中，
□
表示男性正常个体，
○
表示正常女性，
□
表示男性正常个体，表示可疑已死亡男性个体，表示已死亡女性个体，
●
表示女性患者，
↗
表示先证者；
19.图4显示利用sanger测序检测2号家系foxl2:nm_023067.3:exon1:c.316_321dupcacaac:p.his106_asn107dup位点基因型的结果图，2号家系中先证者为患者，先证
者丈夫和先证者妹妹为野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置)。
具体实施方式
20.本发明提供了一种bpes综合征致病基因foxl2突变位点foxl2:nm_023067.3:exon1:c.316_321dupcacaac:p.his106_asn107dup在制备bpes综合征诊断试剂或制备预防和/或治疗bpes综合征靶点药物中的应用。
21.在本发明中，致病基因foxl2的突变体核心核苷酸序列如seq id no:6(atccgccacaaccacaacctcagcc，加粗部分为突变位点重复序列)所示。bpes综合征致病基因foxl2突变位点foxl2:nm_023067.3:exon1:c.316_321dupcacaac:p.his106_asn107dup表示foxl2基因编码的蛋白中第106组氨酸和107位天冬酰胺发生重复，致病蛋白foxl2的突变体核心氨基酸序列如seq id no:7(irhnhnls)所示。
22.本发明提供了一种用于bpes综合征基因诊断的试剂，所述试剂是扩增foxl2突变位点foxl2:nm_023067.3:exon1:c.316_321dupcacaac:p.his106_asn107dup的引物，包括核苷酸序列如seq id no:1(cggtcgcacagtcaaggag)所示的foxl2-f和核苷酸序列如seq id no:2(atctggcaggaggcataggg)所示的foxl2-r。
23.在本发明中，所述试剂优选包括测序引物，所述测序引物优选包括核苷酸序列如seq id no:3(gctcacgctgtccggcatct)所示的foxl2-seqf和seq id no:4(aggcatagggcatgggtgagg)所示的foxl2-seqr。所述试剂优选还包括pcr扩增试剂。所述pcr扩增试剂包括但不限于dntp、pcr缓冲液、镁离子和tap聚合酶。
24.本发明提供了所述的试剂在制备bpes综合征诊断试剂盒中的应用。
25.在本发明中，所述诊断方法优选利用所述诊断试剂盒检测样本中基因突变位点的基因型来诊断个体是否患有bpes综合征，所述基因突变位点为foxl2:nm_023067.3:exon1:c.316_321dupcacaac:p.his106_asn107dup，检测结果为“c.316_321dupcacaac杂合子”，则判断foxl2基因存在突变，个体患有bpes综合征；若位点没有突变，则判断foxl2基因为野生型，个体是正常人。所述样本优选为血液。所述诊断试剂盒检测样本中基因突变位点的基因型的方法优选提取样本的基因组dna，利用扩增引物进行pcr扩增，pcr产物经过dna测序，根据测序结果看.316_321区间的是否存在cacaac重复，若存在重复且呈杂合，说明基因型为“c.316_321dupcacaac杂合子”，若不存在重复，说明基因突变位点未突变，属于野生型，判断为正常。
26.本发明提供了一种bpes综合征诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括所述的试剂。
27.在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学和分子生物学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内的广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
28.文中术语“诊断”包括疾病风险的预测、疾病发病与否的诊断、还包括对疾病预后的评估。
29.文中术语“突变”是指野生型的多核苷酸序列发生改变，成为变异体，变异体可以是天然发生的或非天然发生的。
30.在本发明中，“引物”指用于在pcr反应中扩增靶标核酸的多核苷酸片段，其通常为
寡核苷酸，例如含有至少5个碱基，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或者更多个碱基的多核苷酸片段。引物不必与待扩增的目的基因或其互补链完全互补，只要其能够特异性扩增目的基因。如本文中所使用的，
31.术语“特异性扩增”是指引物能够通过pcr反应扩增目的基因，而不扩增其他基因。例如，特异性扩增foxl2基因是指，在pcr反应中引物只扩增foxl2基因，而不扩增其他基因。
32.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york：cold spring harbor laboratorypress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
33.下面结合实施例对本发明提供的一种bpes综合征致病基因foxl2突变位点的应用及其诊断试剂进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
34.实施例1
35.发明人发现了一个bpes综合征家系(简称foxl2家系)，该foxl2家系部分成员的临床信息见表1。图1显示了foxl2家系图谱，其中，
□
表示男性正常个体，
○
表示正常女性，
■
表示男性患者，
●
表示女性患者，
↗
表示先证者。
36.1.诊断标准：
37.可参照《人类单基因遗传疾病》2010版：
38.1)临床特征：
39.小睑裂综合征是一种先天性的发育异常，在眼部的主要表现是四联征：
40.第一、倒向型内眦赘皮：内眦赘皮是以下眼睑内眦赘皮为主。
41.第二、上睑下垂：上眼皮遮盖黑眼珠的成分比较多。
42.第三、睑裂比较小：眼睛看起来比较小。
43.第四、鞍鼻：鼻子像马鞍一样平，两个眼内眦间距比较宽。
44.小睑裂综合征ⅰ型在女性可表现为卵巢早衰，不孕症。
45.2)遗传学特征
46.bpes综合征为常染色体显性遗传性疾病，最常由foxl2基因突变所致。
47.表1 bpes综合征家系成员的临床信息
48.[0049][0050]
如图1所示，编号采用ⅰ(第一代)、ⅱ(第二代)。
[0051]
家系人员ⅰ1(父亲)、ⅰ2(母亲)、ⅱ2(先证者)、ⅱ3(妹妹)和ⅱ5(弟弟)外周血dna用于测序分析。
[0052]
实施例2
[0053]
外显子测序
[0054]
1.仪器设备如表2所示。
[0055]
表2仪器设备一览表
[0056][0057]
2.试剂耗材
[0058]
人类全外显子测序试剂盒(agilent)、dna 1000试剂盒(agilent)、96孔板(axygen)、不同型号枪头(axygen)、200μl离心管(eppendorf)、1.5ml离心管(eppendorf)、毛细管电泳缓冲液(thermo)、测序标准物(thermo)、无水乙醇(thermo)、bigdye terminatorv3.1(thermo)、外周血gdna提取试剂盒(tiangen)、琼脂糖(tiangen)、eb染液(amresco)。
[0059]
3.试剂配方
[0060]5×
tbe电泳液贮存液按照表3配制。
[0061]
表3 5
×
tbe电泳液配方
[0062]
试剂体积/重量tris5.4g硼酸750mgedta(ph 8.0,0.5mol/l)2mlddh2o90ml
[0063]
用ddh2o将最终体积调整为100ml。
[0064]
0.5
×
tbe电泳液工作液，用ddh2o稀释10倍即可。
[0065]
10
×
红细胞裂解液按照表4配制。
[0066]
表4 10
×
红细胞裂解液配方
[0067]
试剂体积/重量nh4cl82.9gkhco310gedta0.37g加dh2o至1000ml
[0068]
高压灭菌，4℃保存。
[0069]1×
细胞核裂解液按照表5配制。
[0070]
表5 1
×
细胞核裂解液配方
[0071]
试剂体积/重量2m tris-hcl,ph8.20.5ml4m nacl10ml2mm edta0.4ml
[0072]
4.实验步骤
[0073]
签署知情同意书后，采集家系中ⅰ1(父亲)、ⅰ2(母亲)、ⅱ2(先证者)、ⅱ3(妹妹)和ⅱ5(弟弟)等成员的外周血3-5ml。
[0074]
4.1样本dna提取
[0075]
1)如为肝素抗凝外周血样本，则将外周血3-5ml装入15ml离心管中，加2～3倍体积的1
×
红细胞裂解液，混匀，冰上静置30分钟，直至溶液变透明。
[0076]
2)4℃，3000转/分钟离心10分钟，小心去上清液。沉淀中加1ml 1
×
细胞核裂解液，混匀，再加2ml 1
×
细胞核裂解液和150μl 20％sds，摇匀，至出现粘稠透明状。加10μl 20mg/ml蛋白酶k，摇匀。37℃消化6小时以上或过夜。
[0077]
3)加等体积饱和酚，轻摇混匀，室温3000转/分钟离心10分钟。
[0078]
4)小心移上清至另一离心管，加等体积酚/氯仿(1:1v/v)混匀，室温3000转/分钟离心10分钟。
[0079]
5)小心移上清，若上清不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次。
[0080]
6)将上清移入另一离心管中，加二倍体积无水乙醇，摇匀，见白色絮状dna。用火焰灭菌的玻璃钩针将dna钩出，70％乙醇洗二次，室温干燥5分钟，再将dna溶于200μl 1
×
te
中，转鼓溶解过夜。紫外测od值。
[0081]
7)te溶解的dna，在4℃下可保存一年，如要求长期保存，则需加2倍体积无水乙醇置-70℃保存。
[0082]
4.2外显子测序
[0083]
1)取2μg dna，机械打断，使片段大小在200bp左右，切胶回收150-250bp片段；
[0084]
2)dna片段做末端修复和3’末端加a；
[0085]
3)连接测序接头，对连接产物进行纯化，再行pcr扩增，扩增产物纯化；
[0086]
4)agilent试剂盒探针加入纯化后的扩增产物进行杂交捕获，杂交产物经洗脱回收后做pcr扩增，再行最终产物回收，取小样行琼脂糖凝胶电泳进行质控分析；
[0087]
5)nextseq500测序仪测序和数据分析。
[0088]
4.3结果
[0089]
最终得到1个具有致病意义的基因突变foxl2:nm_023067.3:exon1:c.316_321dupcacaac:p.his106_asn107dup，造成第106组氨酸和107位天冬酰胺重复。在家系患者个体中foxl2:nm_023067.3:exon1:c.316_321dupcacaac:p.his106_asn107dup位点的基因型是“c.316_321dupcacaac杂合子”突变，在foxl2家系正常个体中基因型是无突变的野生型。
[0090]
实施例3
[0091]
sanger测序验证
[0092]
对于外显子组测序结果进一步利用sanger测序法，对foxl2:nm_023067.3:exon1:c.316_321dupcacaac:p.his106_asn107dup位点进行验证。分别对实施例1中的ⅰ1、ⅰ2、ⅱ2、ⅱ3和ⅱ5等家系人员和100名家系外正常人进行foxl2:nm_023067.3:exon1:c.316_321dupcacaac:p.his106asn107dup位点基因型检测。
[0093]
具体方法步骤如下：
[0094]
1、dna提取
[0095]
按照实施例1的方法提基因组dna。
[0096]
2、候选引物设计、验证及优选
[0097]
2.1引物设计参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3。，引物序列由上海生工生物技术公司合成。
[0098]
2.2针对c.316_321dupcacaac位点分别设计18对候选引物(见表6)，并利用pcr实验来验证和评价各对候选引物的优劣情况
[0099]
表6各对候选引物基本情况和验证实验结果一览表
[0100]
[0101]
[0102]
[0103][0104]
注：正常pcr扩增结果电泳后只有一条特异性条带，若出现引物二聚体条带、非特异产物条带均是引物异常反应的结果；目标引物尽可能避免这类情况。
[0105]
另外参考如下原则来综合评价和选择最优引物对：
[0106]
①
引物长度为15-30nt，常用为20nt左右；
[0107]
②
g+c含量以40-60％为宜，g+c太少扩增效果不佳，g+c过多易出现非特异条带。atgc最好随机分布；
[0108]
③
避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照；
[0109]
④
引物内部不应出现互补序列；
[0110]
⑤
两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3`端的互补重叠；
[0111]
⑥
引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70％，引物3`末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增；
[0112]
2.3候选引物pcr验证反应
[0113]
按照表7中的反应体系进行pcr并保持反应体系在冰上；每对引物设置8个反应测试管(表7中序号1至8)。
[0114]
表7引物检测pcr反应体系
[0115]
[0116][0117]
反应条件：将上述测试反应管放入pcr仪，执行以下反应程序：
[0118]
第一步：95℃，5分钟；
[0119]
第二步：30个循环(95℃，30秒
→
tm，30秒
→
72℃，60秒)；(根据表6中各引物tm值设置pcr扩增参数，如为双引物则取tm平均值)。
[0120]
第三步：72℃，7分钟；
[0121]
第四步：4℃直至取样时。
[0122]
2.4候选引物pcr结果进行琼脂糖凝胶电泳检测，以评估引物反应的有效性、特异
性：
[0123]
1)用胶带将洗净干燥的凝胶成样器两端封好，置于一水平台面上，在成样器的一端约1cm处放置梳子。
[0124]
2)称量2g琼脂粉末于一锥形瓶中，加入100ml 0.5
×
tbe电泳缓冲液，摇匀后置微波炉或电炉上(加石棉网)加热，沸腾后取出摇匀，再加热，直至凝胶完全熔解，取出室温冷却。
[0125]
3)待凝胶冷却至50℃左右，倒入封好的凝胶成样器，使厚度在5mm左右。
[0126]
4)凝胶凝固拆除胶带，将凝胶与成样器一起放入电泳槽中。
[0127]
5)加入电泳缓冲液，使液面高于胶面1-2mm，向上拔出梳子；用微量移液器将样品和dna大小标准品分别与载样液混匀后，加入各加样孔内，由于载样液中蔗糖比重较大，dna沉入孔底。
[0128]
6)盖上电泳槽，接通电源，调至适当电压，开始电泳。根据载样液中溴酚蓝的指示，判断样品的大概位置，决定是否终止电泳。
[0129]
7)切断电源，取出凝胶，放入0.5g/ml的eb水溶液中染色10-15分钟。
[0130]
8)将凝胶放到透射式紫外照射仪下观察结果，波长254nm，并用加红色滤色片的相机照相或用凝胶扫描系统记录电泳结果。
[0131]
2.5结果评价：
[0132]
1)如果7号管仅出现一条明亮清晰目的条带，无其它条带，则判断该对引物和发应体系有效性好和特异性强；
[0133]
2)如果7号管没有出现目的条带，则判断该对引物和反应体系无效；
[0134]
3)如果7号管出现目的条带外的引物引物二聚体带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体带，则判断该对引物和反应体系有效性差；
[0135]
4)如果7号管出现目的条带外的非特异性带，并在5、6号部分管中也同样出现非特异性带，则判断该对引物和反应体系特异性差；
[0136]
5)如果7号管出现目的条带外的引物二聚体和非特异性带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体和非特异性带，则判断该对引物和反应体系有效性和特异性差。
[0137]
2.6根据表6验证测试后统计的结果，选择其中最优一对(表6中1号对)作为突变家系检测用引物，针对foxl2:nm_023067.3:exon1:c.316_321dupcacaac:p.his106_asn107dup位点的引物序列如下所示：
[0138]5’‑
cggtcgcacagtcaaggag-3’(seq id no：1)
[0139]5’‑
ccatctggcaggaggcatag-3’(seq id no：2)
[0140]
3、1号家系人员和100名家系外人员突变位点pcr扩增
[0141]
按照表8中的反应体系进行pcr并保持反应体系在冰上。
[0142]
表8突变位点pcr反应体系
[0143]
试剂体积10
×
pcr缓冲液2.0μl10mmol/l dntps0.4μl100ng/μl foxl2-f0.5μl
100ng/μl foxl2-r0.5μl100ng/μl外周血抽提dna1.0μl5u/μl taq酶0.2μlddh2o15.4μl
[0144]
反应条件：将反应体系放入pcr仪，执行以下反应程序：
[0145]
第一步：95℃，5分钟；
[0146]
第二步：30个循环(95℃，30秒
→
60℃，30秒
→
72℃，60秒)；
[0147]
第三步：72℃，7分钟；
[0148]
第四步：4℃直至取样时。
[0149]
4、琼脂糖凝胶电泳检测
[0150]
参照上述2.4步骤。
[0151]
5、pcr产物酶解法纯化：5μl pcr产物中分别加入0.5μl核酸外切酶i(exo i)，1μl碱性磷酸酶(aip)，37℃消化15分钟，85℃使酶失活15分钟。
[0152]
6、bigdye反应
[0153]
bigdye反应体系见表9。
[0154]
表9 bigdye反应体系
[0155]
试剂用量pcr产物纯化后dna2.0μl3.2pmol/μl测序引物1.0μlbigdye0.5μl5
×
bigdye测序缓冲液2.0μlddh2o4.5μl
[0156]
测序pcr循环条件：
[0157]
第一步：96℃，1分钟；
[0158]
第二步：33个循环(96℃，30秒
→
55℃，15秒
→
60℃，4分钟)；
[0159]
第三步：4℃直至取样时。
[0160]
7、bigdye反应产物纯化：
[0161]
1)每管加入1μl 125mm edta(ph8.0)，加到管底，再加入1μl 3mol/l naac(ph5.2)；
[0162]
2)加入70μl 70％酒精，震荡混匀4次，室温放置15分钟；
[0163]
3)3000g，4℃离心30分钟；马上倒置96孔板，185g离心1分钟；
[0164]
4)室温放置5分钟，让残余的酒精在室温挥发干，加入10μl hi-di甲酰胺溶解dna，96℃变性4分钟，迅速置冰上4分钟，上机测序。
[0165]
8、测序
[0166]
将纯化后的bigdye反应产物进行dna测序，测序引物则在上述pcr优选引物的基础上设计巢式引物(第二组引物是在第一组引物扩增得到的产物序列范围内设计的)作为测序引物，引物序列如下所示：
[0167]5’‑
gctcacgctgtccggcatct-3’(seq id no：3)
[0168]5’‑
aggcatagggcatgggtgagg-3’(seq id no：4)。
[0169]
9、结果分析
[0170]
图2的sanger测序结果显示，家系3名患者foxl2:nm_023067.3:exon1:c.316_321dupcacaac:p.his106_asn107dup位点基因型是“c.316_321dupcacaac杂合子”。图2测序图中箭头所指位置显示a、c、e层bpes综合征患者foxl2:nm_023067.3:exon1:c.316_321dupcacaac:p.his106_asn107dup位点基因型是“c.316_321dupcacaac杂合子”突变。
[0171]
实施例4
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foxl2基因c.316_321dupcacaac突变诊断试剂盒及应用
[0173]
1、试剂盒组成：
[0174]
1)扩增引物：如实施例3所示
[0175]
2)缓冲液
[0176]
3)taq酶
[0177]
4)dntps
[0178]
5)foxl2:c.316_321dupcacaac阳性突变参考品dna，该参考品为一段双链dna，具体序列如下所示：
[0179][0180]
(seq id no:5)，其中加粗碱基分别表示pcr扩增用上下游引物位置；下划线碱基表示突变位点；双下划线碱基表示上下游测序引物。
[0181]
6)测序引物：如实施例3所示。
[0182]
2、使用方法：
[0183]
应用于2号家系进行基因突变检测。
[0184]
表10 bpes综合征2号家系成员的临床信息
[0185][0186]
如图3所示，编号采用ⅰ(第一代)、ⅱ(第二代)。
[0187]
家系人员ⅱ1(先证者丈夫)、ⅱ2(先证者)、ⅱ3(先证者妹妹)外周血dna用于试剂盒检测分析。
[0188]
1)基因组dna提取：提取样本基因组dna。
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2)先采用上述pcr扩增引物、taq酶、缓冲液、dntps、样本基因组dna等进行pcr扩增反应；
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3)对pcr扩增产物进行纯化；
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4)采用上述测序引物对纯化的pcr产物进行bigdye反应；
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5)对biydye反应产物纯化；
[0193]
6)对biydye反应产物测序，测序序列与正常序列相比较。
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图4显示利用试剂盒检测2号家系foxl2:nm_023067.3:exon1:c.316_321dupcacaac:p.his106_asn107dup位点基因型的结果图，2号家系中先证者该位点的基因型为c.316_321dupcacaac杂合子，先证者丈夫和先证者妹妹为野生型；检测结果确认先证者为bpes综合征患者。
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由以上实施例结果可以看出，本发明发现了新的foxl2基因突变，且确认了新突变体与bpes综合征的发病密切相关，所述致病突变体可用于bpes综合征的分子诊断及与相关疾病的鉴别诊断。
[0196]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。