一种去除脐带血细胞中细菌的方法与流程

1.本发明涉及一种脐带血细胞抢救方法，具体为一种去除脐带血细胞中细菌的方法，属于细胞生物技术领域。


背景技术：

2.脐带血是胎儿娩出、脐带结扎并断离后残留在胎盘和脐带中的血液，脐带血中富含各类细胞，可用于重建人体造血和免疫系统，治疗血液系统、免疫系统、遗传代谢性及先天性疾病，是人类一种非常重要的生物遗传资源。由于新生儿出生时脐带及胎盘通过产道，据统计，脐带血采集后进行微生物培养，染菌率顺产达到7-8%、剖宫产约1%，平均约4%。被污染的脐带血中，以厌氧菌为主，菌群主要集中在肠杆菌科、葡萄球菌、拟杆菌属和真杆菌属，是肠道、生殖道的正常菌群。既往对污染的脐带血而言，按照医疗废弃物进行处理是其最终结局，从遗传资源的角度来讲，是一种生物资源的浪费。
3.根据目前所统计脐带血染菌数据，约4%新生儿父母无法给新生儿保存新生儿细胞用于健康保障。能否合理使用抗菌抗生素，通过细胞洗涤方法，将再次检测无微生物新生儿的细胞进行保存。从某种角度来看，这是一件值得去探索的工作。头孢他啶通过抑制转肽酶在细菌细胞壁中合成中转肽作用，使其无法合成细胞壁，导致细菌溶菌死亡；已证实对革兰氏阴性、革兰氏阳性、厌氧菌有效。甲硝唑用于治疗肠道和肠外阿米巴病，目前还广泛用于厌氧菌感染的治疗。
4.细胞中常见的生物污染类型有细菌污染、支原体污染、真菌污染、病毒污染。对于脐带血来讲，提取的造血干细胞用于治疗免疫细胞疾病和血液系统疾病，质量要求上必须是无细菌、无病毒，无支原体、无真菌的；所以对于感染有病毒、支原体、真菌的脐带血表标本，根据血站及造血干细胞移植相关规范要求直接屏蔽，尤其是病毒感染的；而支原体和真菌不作为本发明的关注点；但是对于细菌污染的脐带血，如果能通过一定的手段进行去除细菌，无论是作为造血干细胞的移植物还是分离出白细胞进行定向培养成自然杀伤性细胞、car-t细胞等，都是不可多得一种生物资源。


技术实现要素：

5.本发明的目的就在于为了解决上述至少一个技术问题而提供一种去除脐带血细胞中细菌的方法。
6.本发明通过以下技术方案来实现上述目的：一种去除脐带血细胞中细菌的方法，包括以下步骤步骤一、脐带血造血干细胞复融：提选已污染的脐带血造血干细胞，在37℃恒温水浴锅中快速复苏，75%酒精进行表面消毒，放至超净工作台进行后续处理；步骤二、洗涤离心：将血液转移至离心管中，加入生理盐水至血液中，对脐带血造血干细胞进行洗涤；通过离心作用，去除红细胞（红细胞经冻存再复苏后已破碎），上清抽取血培养；
步骤三、获取单个核细胞：步骤二中离心后，血液分两层，上层为红色澄清液体，下层为单个核细胞；步骤四、二次洗涤：步骤三中获得的单个核细胞，加入含有一定浓度头孢他啶和甲硝唑的磷酸盐缓冲液，洗涤单个核细胞；离心后，分两层，上层透明液体，下层为单个核细胞，上清抽取血培养；步骤五、细胞与抗生素共培养：根据抗生素添加浓度设定分组，添加培养基置于co2培养箱中每天观察细菌的去除情况及细胞的生长情况；步骤六、鉴定：每天取样进行营养琼脂培养、革兰氏染色进行，用于细菌去除鉴定；流式细胞仪检测细胞周期，用于细胞鉴定。
7.作为本发明再进一步的方案：所述步骤一中，脐带血复苏要求血液全部复融。
8.作为本发明再进一步的方案：所述步骤二中，使用0.9%生理盐水对血液进行稀释，生理盐水的量为血液体积的1/3，离心1800prm/10min，除去血液中已经溶血的红细胞。
9.作为本发明再进一步的方案：所述步骤四中，二次洗涤细胞使用磷酸盐缓冲液，添加抗生素浓度100mg/l头孢他啶和50mg/l甲硝唑，混匀室温静止30min；离心2000rpm/5min，弃去上清。
10.作为本发明再进一步的方案：所述步骤五中，依据抗生物浓度进行分四组，另设阴性对照组、阳性对照组；分别加入gt-561培养基，每天在倒置显微镜下观察细胞的生长状态及细菌除去情况。
11.作为本发明再进一步的方案：所述步骤六中，每日取样进行革兰氏染色、营养琼脂平板检测细菌去除情况；抽取各组细胞进行细胞周期的检测，碘化丙啶（pi）标记分析细胞，流式细胞仪进行细胞周期分析。
12.本发明的有益效果是：本发明经过稀释、洗涤，二次洗涤中加入抗生素的常规用量进行预处理；在除菌处理中，设定四组抗生素浓度与细胞进行共培养。洗涤离心血培养抽样结果表明，细菌的浓度随着多次洗涤逐步降低；鉴定结果表明，四组抗生素浓度最佳的组合：厌氧菌感染的脐带血50mg/l头孢他啶和100mg/l甲硝唑，作用时间7天；需氧菌感染的脐带血100mg/l头孢他啶和12.5mg/l甲硝唑，作用时间10天。
附图说明
13.图1为本发明结构示意图。
具体实施方式
14.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
15.实施例一如图1所示，一种去除脐带血细胞中细菌的方法，包括以下步骤步骤一、脐带血造血干细胞复融：提选已污染的脐带血造血干细胞，在37℃恒温水浴锅中快速复苏，75%酒精进行表面消毒，放至超净工作台进行后续处理；
步骤二、洗涤离心：将血液转移至离心管中，加入生理盐水至血液中，对脐带血造血干细胞进行洗涤；通过离心作用，去除红细胞（红细胞经冻存再复苏后已破碎），上清抽取血培养；步骤三、获取单个核细胞：步骤二中离心后，血液分两层，上层为红色澄清液体，下层为单个核细胞；步骤四、二次洗涤：步骤三中获得的单个核细胞，加入含有一定浓度头孢他啶和甲硝唑的磷酸盐缓冲液，洗涤单个核细胞；离心后，分两层，上层透明液体，下层为单个核细胞，上清抽取血培养；步骤五、细胞与抗生素共培养：根据抗生素添加浓度设定分组，添加培养基置于co2培养箱中每天观察细菌的去除情况及细胞的生长情况；步骤六、鉴定：每天取样进行营养琼脂培养、革兰氏染色进行，用于细菌去除鉴定；流式细胞仪检测细胞周期，用于细胞鉴定。
16.在本发明实施例中，所述步骤一中，脐带血复苏要求血液全部复融。
17.在本发明实施例中，所述步骤二中，使用0.9%生理盐水对血液进行稀释，生理盐水的量为血液体积的1/3，离心1800prm/10min，除去血液中已经溶血的红细胞。
18.在本发明实施例中，所述步骤四中，二次洗涤细胞使用磷酸盐缓冲液，添加抗生素浓度100mg/l头孢他啶和50mg/l甲硝唑，混匀室温静止30min；离心2000rpm/5min，弃去上清。
19.实施例二如图1所示，一种去除脐带血细胞中细菌的方法，包括以下步骤步骤一、脐带血造血干细胞复融：提选已污染的脐带血造血干细胞，在37℃恒温水浴锅中快速复苏，75%酒精进行表面消毒，放至超净工作台进行后续处理；步骤二、洗涤离心：将血液转移至离心管中，加入生理盐水至血液中，对脐带血造血干细胞进行洗涤；通过离心作用，去除红细胞（红细胞经冻存再复苏后已破碎），上清抽取血培养；步骤三、获取单个核细胞：步骤二中离心后，血液分两层，上层为红色澄清液体，下层为单个核细胞；步骤四、二次洗涤：步骤三中获得的单个核细胞，加入含有一定浓度头孢他啶和甲硝唑的磷酸盐缓冲液，洗涤单个核细胞；离心后，分两层，上层透明液体，下层为单个核细胞，上清抽取血培养；步骤五、细胞与抗生素共培养：根据抗生素添加浓度设定分组，添加培养基置于co2培养箱中每天观察细菌的去除情况及细胞的生长情况；步骤六、鉴定：每天取样进行营养琼脂培养、革兰氏染色进行，用于细菌去除鉴定；流式细胞仪检测细胞周期，用于细胞鉴定。
20.在本发明实施例中，所述步骤五中，依据抗生物浓度进行分四组，另设阴性对照组、阳性对照组；分别加入gt-561培养基，每天在倒置显微镜下观察细胞的生长状态及细菌除去情况。
21.在本发明实施例中，所述步骤六中，每日取样进行革兰氏染色、营养琼脂平板检测细菌去除情况；抽取各组细胞进行细胞周期的检测，碘化丙啶（pi）标记分析细胞，流式细胞
仪进行细胞周期分析。
22.工作原理：通过头孢他啶和甲硝唑两种抗菌抗生素，通过多次洗涤、离心、共培养的方法，利用血培养、革兰氏染色、细胞周期的检测，重新获得无细菌的脐带血造血干细胞或冻存或诱导成免疫细胞。
23.对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
24.此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。