基于CRISPR/Cas12a耦联环介导恒温扩增的快速检测PCA3基因的试剂盒的制作方法

基于crispr/cas12a耦联环介导恒温扩增的快速检测pca3基因的试剂盒
技术领域
1.本发明是一种试剂盒，特别涉及基于crispr/cas12a耦联环介导恒温扩增的快速检测pca3基因的试剂盒。


背景技术：

2.前列腺癌(prostate cancer，pca)是一种严重威胁男性健康的恶性肿瘤，近10年来我国前列腺癌的发病率、病死率呈大幅上升趋势，已成为影响我国男性健康的重要疾病之一。
3.目前，临床上最常用的pca初步诊断方法是直肠指诊(digital-rectal examination，dre)联合血清前列腺特异抗原(prostate specific antigen，psa)检测，诊断的金标准为前列腺病理穿刺活检，然而是否行前列腺病理穿刺活检，则很大程度上取决于dre和血清psa的检测结果。dre检查会让患者感觉不适，且检查结果的判断主要依赖于医生的自身经验，具有相当的主观性。
4.血清前列腺特异性抗原(psa)是临床最常用的前列腺癌诊断标记物。血清psa检测虽应用广泛，但仍存在以下缺陷：(1)psa是前列腺组织特异性标志物，不具有前列腺癌组织特异性。并非所有pca患者血清psa均升高，而血清psa升高也并不能均诊断为pca，如前列腺炎、良性前列腺增生、急性尿潴留及相关前列腺检查等均可引起血清psa升高；(2)血清psa的高低与pca恶性程度无关，很多低psa性pca被诊断即证实了这一点；(3)如降低诊断pca的血清psa阈值则明显增加了临床前列腺穿刺活检率，导致pca阴性诊断率上升至70％～80％，带来更多不必要的前列腺穿刺活检，大大增加了患者的身体痛苦以及精神和经济负担。
5.dd3(differential display code 3，dd3)又名pca3(prostate cancer 3，pca3)，是一种具有pca组织特异性的非编码mrna，用rt-pcr方法研究发现pca3在正常前列腺组织中表达较低，而在前列腺癌组织极高表达，表明pca3具有很高的前列腺组织特异性。应用定量rt-pcr也发现前列腺癌区域pca3的表达水平是邻近良性组织的6～1500倍。
6.现有技术中已经有通过分子手段检测前列腺癌的相关基因的试剂盒，这些试剂盒大都依赖于聚合酶链式反应(pcr)，pcr反应的进行又依赖于温度的升降，需要配备昂贵的控温仪器使用，比如pcr仪等，其使用受到场地等的限制，一般只在医院或者是检测中心使用，与普通百姓的日常生活并不贴近。
7.因此，希望能够提供一个能随时随地，操作简单，结果读出方便的家庭式检测前列腺癌的试剂盒。
8.环介导等温扩增(lamp)不需要模板的热变性，在等温条件下就可以扩增，有水浴锅或金属浴就可以操作，不需要昂贵的仪器设备，且结果可视。具有省时、易操作、低成本的特性。常规用于lamp检测的方法主要包括实时荧光采集和凝胶电泳，前者需要精密的荧光采集装置，后者操作时间长，两者在现场检测领域都受到一定的限制。可视化检测法具有操
作方便、结果直观等优点，在现场检测领域具有巨大的优势。lamp体系中各成分(如焦磷酸根离子、镁离子、氢离子等)在反应前后发生较大幅度变化，常被用于判断lamp反应进程的可视化方法，例如hnb法、钙黄绿素法、浊度法、ph染料法等。此类方法无法排除非特异性扩增的核酸链延伸所产生的干扰，进而影响检测准确性。
9.crispr(clustered regularly interspced short palindromic repeats)是一种存在于几乎所有古生菌和多数细菌中的抵御病毒入侵的一种获得性免疫方式，可用来对抗入侵的病毒及外源dna。crispr/cas12a是一种dna酶，在crrna的引导下依赖pam序列特异性识别靶标，形成三体复合物，同时cas12a的侧切活性被激活，无差别的剪切体系中存在的所有单链dna。根据这种特性，crispr/cas12a已被成功应用于开发快速、低成本且高灵敏的核酸检测工具上，在核酸分子诊断领域具有重要的应用潜力。但由于crispr/cas12a的检测能力有限，其灵敏度只能达到pm级别，对大多数核酸的检测方法，检出限达到am数量级才具有实际应用价值，将恒温扩增技术与crispr/cas技术联用，能够很好的解决这个问题。


技术实现要素：

10.本发明主要是解决现有技术中存在的不足，提供一种便携式检测前列腺癌相关基因，能够摆脱对精密仪器的依赖，不受场所限制，真正做到在家也能自己动手检测，结果读出方便，可以贴近普通百姓生活，提高前列腺癌的早期检出率，提高患者的生存率以及生存质量。其设计巧妙，使用方便，适于大规模推广应用。
11.本发明的上述技术问题主要是通过下述技术方案得以解决的：
12.基于crispr/cas12a耦联环介导恒温扩增的快速检测pca3基因的试剂盒，按以下步骤进行：
13.pca3基因的环介导恒温扩增检测作为引物；
14.对应pca3基因引物扩增产物的crrna；
15.该试剂盒包括用于显示pca3核酸阳性扩增结果的报告子，以及上述特异扩增pca3基因部分片段的lamp引物以及对应pca3基因lamp扩增序列的一段crrna序列。
16.作为优选，按以下步骤进行：
17.(一)、lamp引物设计与筛选：
18.从ncbi下载pca3的基因序列(gene id 50652)，pca3基因包含4个外显子，根据相关文献报道及参考国外fda批准的progensa pca3产品，与前列腺癌高度相关的pca3位点在exon3与exon4之间，选取跨第3和第4内含子的部分序列基因即19270-19452和19681-20040位序列，提交至https：//primerexplorer.jp/e/网站进行lamp引物设计，共设计了3对引物；
19.跨第3第4内含子的序列(划线部分为扩增序列)：
[0020]5’‑‑
gtgagaaataagaaaggctgctgactttaccatctgaggccacacatctgctgaaatggagataattaacatcactagaaacagcaagatgacaatataatgtctaagtagtgacatgtttttgcacatttccagcccctttaaatatccacacacacaggaagcacaaaaggaagcacagagatccctgggagaaatgcccggccgccatcttgggtcatcgatgagcctcgccctgtgcctggtcccgcttgtgagggaaggacattagaaaatgaattgatgtgttccttaaaggatgggcaggaaaacagatcctgttgtggatatttatttgaacgggattacagatttgaaatgaagtcacaaagtgagcattaccaatgagaggaaaacagacgagaaaatcttgatggcttcacaagacatgcaacaaacaaaatg
gaatactgtgatgacatgaggcagccaagctggggaggagataaccacggggcagagggtcaggattctggccctgctgcctaaactgtgcgttcataa
‑‑3’
[0021]
所述的引物如下：
[0022]
第一组：
[0023]
f3：5
’‑
atccacacacacaggaag-3’[0024]
b3：5
’‑
tgctcactttgtgacttca-3’[0025]
fip：5
’‑
ctcatcgatgacccaagatggccacaaaaggaagcacagag-3’[0026]
bip：5
’‑
gtgagggaaggacattagaaaatgatcaaataaatatccacaacaggatc-3’[0027]
lf：5
’‑
cgggcatttctcccagggat-3’[0028]
lb：5
’‑
ttccttaaaggatgggcagga-3’[0029]
第二组：
[0030]
f3：5
’‑
agcaagatgacaatataatgtct-3’[0031]
b3：5
’‑
catcctttaaggaacacatcaa-3’[0032]
fip：5
’‑
tctgtgcttccttttgtgcttcacatgtttttgcacatttcca-3’[0033]
bip：5
’‑
cgccatcttgggtcatcgatttctaatgtccttccctcac’[0034]
lf：5
’‑
tgtgtgtggatatttaaaggggc-3’[0035]
lb：5
’‑
tgtgcctggtcccgctt-3’[0036]
第三组：
[0037]
f3：5
’‑
gctcaagaggttcaaaatcc-3’[0038]
b3：5
’‑
tgaggcgtaatcagtcatc-3’[0039]
fip：5
’‑
tgctgttcagtgcaatcagtaatatactcattatcttctctttctttcac-3’[0040]
bip：5
’‑
tccccaatgtagccatgcaacttctggcttcagcagtc-3’[0041]
lf：5
’‑
agggagaggagcaggga-3’[0042]
lb：5
’‑
ccagtggctccttgtggt-3’[0043]
(二)、crrna的设计：
[0044]
将每组引物的扩增序列提交至https://www.benchling.com/crispr/网站进行crrna序列的设计；
[0045]
针对上述几组引物扩增的序列分别设计了crrna，如下：
[0046]
第一组：uaauuucuacuaaguguagauaaaucuguaaucccguucaa
[0047]
第二组：uaauuucuacuaaguguagauaaaugaagucacaaagugag
[0048]
第三组：uaauuucuacuaaguguagauucccagggaucucugugcuu
[0049]
(三)、lamp引物以及crrna的筛选步骤：
[0050]
lamp引物以及crrna的筛选步骤为：1)使用各组引物分别去扩增带目标序列基因的质粒dna，选取扩增效率高扩增效果好的引物对进行下一步筛选，如图1、图2和图3所示进行筛选的三条引物的扩增效率都较好；2)将扩增体系与crispr切割体系联合，观察每组引物扩增的产物是否能够在对应的crrna的引导下激活cas12a蛋白，使其发挥出其侧切活性切割体系中存在的所有单链dna；剔除的两组引物和对应的两条crrna是由于引物的扩增产物和对应的crrna与cas12a结合后无法很好的区分出阴阳性样品；引物经过筛选之后最优引物以及crrna见表1，引物和crrna在序列中的分布如图4；
[0051]
表1用于lamp扩增pca3基因的序列以及crrna的序列
[0052]
引物名称序列(5
’‑3’
)pca3-f3agcaagatgacaatataatgtctpca3-b3catcctttaaggaacacatcaapca3
‑‑
fiptctgtgcttccttttgtgcttcacatgtttttgcacatttccapca3
‑‑
bipcgccatcttgggtcatcgatttctaatgtccttccctcacpca3-lftgtgtgtggatatttaaaggggcpca3-lbtgtgcctggtcccgcttcrrnauaauuucuacuaaguguagauucccagggaucucugugcuu
[0053]
(四)、试剂盒的组成：
[0054]
1)、引物混合试剂：
[0055]
1.6μm pca3-fip和pca3-bip、0.2μm pca3-f3和pca3-b3、0.4μm pca3-lf和pca3-lb；
[0056]
2)、lamp-crispr试剂：
[0057]1×
thermopol buffer、1.4mm dntps、6mm mg
2+
、0.16u bst大片段dna聚合酶、200nm cas12a、600nm crrna、2.5μm reporter、1
×
nebuffer 2.1；
[0058]
3)、阳性质控品：
[0059]
200ng/μl前列腺癌阳性细胞lncap基因组dna，经亚硫酸盐转化及纯化回收，即得到阳性质控品；
[0060]
4)、阴性质控品：
[0061]
分装的超纯水。
[0062]
基于crispr/cas12a耦联环介导恒温扩增的快速检测pca3基因的试剂盒，前列腺癌相关基因pca3基因的lamp检测方法，按以下步骤进行：
[0063]
采用lamp将前列腺癌特征基因pca3信号进行放大，利用cas12a和crrna组装的复合物识别lamp特异产物上的特征序列以激活cas12a的附属切割活性，从而对修饰了荧光基团和淬灭基团的单链dna进行切割，使其断开，释放出荧光，实现对pca3基因的特异性，可视化检测。
[0064]
基于crispr/cas12a耦联环介导恒温扩增的快速检测pca3基因的试剂盒，前列腺癌相关基因pca3基因的lamp检测方法，按以下步骤进行：
[0065]
将合成的带有pca3基因的质粒作为模板，构建lamp体系：20μl lamp反应体系中包含2μl模板质粒、1.6μm pca3-fip和pca3-bip、0.2μm pca3-f3和pca3-b3、0.4μm pca3-lf和pca3-lb、syto 9 4μm、1
×
thermopol buffer、1.4mm dntps、6mm mg
2+
、1u bst大片段dna聚合酶；
[0066]
在实时荧光pcr仪上63℃孵育40分钟，每分钟读取一次荧光值；并且将扩增的产物用3％的琼脂糖凝胶电泳进行跑胶；结果如图5和6所示，当体系中含有pca3质粒时，有明显的扩增曲线，在胶图中能观察到明显的条带；体系中不含有pca3质粒时，无扩增曲线，胶图中也观察不到条带。
[0067]
基于crispr/cas12a耦联环介导恒温扩增的快速检测pca3基因的试剂盒，前列腺癌相关基因pca3基因的lamp检测方法，对lamp检测体系优化
[0068]
1)、酶用量的优化：
[0069]
在lamp扩增反应中，聚合酶的用量对扩增效果的影响至关重要；参考文献，体系试验了两种参与反应的酶的用量，0.16u/reaction，以及1u/reaction，实验结果如图7和图8所示1u/reaction的实验组的实时荧光扩增曲线的扩增效率提高了，到达平台期的时间缩短了；
[0070]
2)、扩增温度：
[0071]
在lamp扩增反应中，温度对扩增效率和最终的扩增结果的影响比较关键的；本实验参考相关文献，设定了lamp反应常用的温度63℃、65℃和67℃；结果如图9、图10和图11所示，最终筛选确定的pca3的lamp引物组在65℃下扩增效率最好，扩增曲线的ct值最小，到达平台期所需的时间最短。
[0072]
基于crispr/cas12a耦联环介导恒温扩增的快速检测pca3基因的试剂盒，pca3基因的lamp扩增产物激活crispr/cas12a侧切活性的操作方法，按以下步骤进行：
[0073]
将合成的带有pca3基因的质粒作为模板，构建lamp体系：20μl lamp反应体系中包含2μl模板质粒、1.6μm pca3-fip和pca3-bip、0.2μm pca3-f3和pca3-b3、0.4μm pca3-lf和pca3-lb、1
×
thermopol buffer、1.4mm dntps、6mm mg
2+
、1u bst大片段dna聚合酶，加在管底；
[0074]
接着加入50μl的石蜡油进行液封；crispr/cas12a体系包含200nm cas12a、600nm crrna、2.5μm reporter、1
×
nebuffer 2.1缓冲液，加在管盖上；先在金属浴上63℃加热40分钟，然后用离心机瞬时离心将管盖的crispr/cas12a试剂离心到管底，继续在金属浴上37℃孵育15分钟，然后在紫外灯下观察结果；
[0075]
当体系中存在pca3质粒时，cas12a的侧切活性被激活，切割单链reporter，在紫外灯的照射下发出明显的荧光信号，当体系中不存在有pca3质粒时，cas12a的侧切活性无法被激活，reporter的结构保持完整，在紫外灯下无法观察到荧光信号。
[0076]
基于crispr/cas12a耦联环介导恒温扩增的快速检测pca3基因的试剂盒，pca3基因的lamp扩增耦联crispr荧光可视化法的操作方法，按以下步骤进行：
[0077]
将合成的带有pca3基因的质粒作为模板，构建lamp体系：20μl lamp反应体系中包含2μl模板质粒、1.6μm pca3-fip和pca3-bip、0.2μm pca3-f3和pca3-b3、0.4μm pca3-lf和pca3-lb、1
×
thermopol buffer、1.4mm dntps、6mm mg
2+
、1u bst大片段dna聚合酶，加在管底；
[0078]
接着加入50μl的石蜡油进行液封；crispr/cas12a体系包含200nm cas12a、600nm crrna、2.5μm reporter、1
×
nebuffer 2.1缓冲液，加在管盖上；先在金属浴上63℃加热40分钟，然后用离心机瞬时离心将管盖的crispr/cas12a试剂离心到管底，继续在金属浴上37℃孵育15分钟，然后在紫外灯下观察结果；结果如图13所示，当体系中存在pca3质粒时，cas12a的侧切活性被激活，切割单链reporter，在紫外灯的照射下发出明显的荧光信号，当体系中不存在有pca3质粒时，cas12a的侧切活性无法被激活，reporter的结构保持完整，在紫外灯下无法观察到荧光信号；
[0079]
基于crispr/cas12a耦联环介导恒温扩增的快速检测pca3基因的试剂盒，灵敏度测试方法，按以下步骤进行：
[0080]
将合成的带有pca3基因的质粒用depc水进行十倍梯度稀释，使其浓度为103，102，
101，100拷贝/μl(copies/μl)；
[0081]
将所述梯度稀释的带有pca3基因的质粒作为模板，构建lamp体系：20μl lamp反应体系中包含2μl模板质粒、1.6μm pca3-fip和pca3-bip、0.2μm pca3-f3和pca3-b3、0.4μm pca3-lf和pca3-lb、1
×
thermopol buffer、1.4mm dntps、6mm mg
2+
、1u bst大片段dna聚合酶，加在管底；
[0082]
接着加入50μl的石蜡油进行液封。crispr/cas12a体系包含200nm cas12a、600nm crrna、2.5μm reporter、1
×
nebuffer 2.1缓冲液，加在管盖上；先在金属浴上63℃加热40分钟，然后用离心机瞬时离心将管盖的crispr/cas12a试剂离心到管底，继续在金属浴上37℃孵育15分钟，然后在紫外灯下观察结果；结果如图14所示，当质粒浓度为102copies/μl或更高时，样本在紫外灯下发出明显的荧光，当质粒浓度为101copies/μl和100copies/μl时，样本无明显荧光。
[0083]
基于crispr/cas12a耦联环介导恒温扩增的快速检测pca3基因的试剂盒，特异性测试方法，按以下步骤进行：
[0084]
提取前列腺癌细胞系vcap，lncap的rna反转录得到cdna，以及提取前列腺增生细胞系bph-1，膀胱癌细胞系t24，宫颈癌细胞系hela，以及淋巴母细胞系的rna反转录得到cdna，用合成的带前列腺相关基因pca3序列的质粒作为阳性对照。
[0085]
以上述六种细胞系的cdna为模板，分别以pca3的引物进行扩增，扩增体系为：20μl lamp反应体系中包含2μl模板质粒、1.6μm pca3-fip和pca3-bip、0.2μm pca3-f3和pca3-b3、0.4μm pca3-lf和pca3-lb、1
×
thermopol buffer、1.4mm dntps、6mm mg
2+
、1u bst大片段dna聚合酶，加在管底。
[0086]
接着加入50μl的石蜡油进行液封。crispr/cas12a体系包含200nm cas12a、600nm crrna、2.5μm reporter、1
×
nebuffer 2.1缓冲液，加在管盖上。先在金属浴上63℃加热40分钟，然后用离心机瞬时离心将管盖的crispr/cas12a试剂离心到管底，继续在金属浴上37℃孵育15分钟，然后在紫外灯下观察结果。结果如图15所示，加入vcap细胞系cdna和加入lncap细胞系cdna的样品发出了和阳性对照组一样明显的荧光，加入其余细胞系的样品组与阴性对照一样没有观察到明显的荧光。表明该检测方法具有良好的特异性。
[0087]
本发明提供一种便携式检测前列腺癌相关基因，能够摆脱对精密仪器的依赖，不受场所限制，真正做到在家也能自己动手检测，结果读出方便，可以贴近普通百姓生活，提高前列腺癌的早期检出率，提高患者的生存率以及生存质量。其设计巧妙，使用方便，适于大规模推广应用。
[0088]
为达到以上目的，本发明包含一种扩增识别器能够扩增响应的核酸并且进行识别，解决现有检测前列腺癌试剂盒使用受到场所限制，不日常的缺点。本发明的目的之一是提供一种pca3基因的环介导恒温扩增检测的引物。该检测引物包括可用于特异性扩增pca3基因部分片段的lamp引物。
[0089]
所述特异扩增pca3基因部分片段的lamp引物为pca3-fip，pca3-bip，pca3-f3，pca3-b3，pca3-lf以及pca3-lb。
[0090]
本发明的目的之二是提供一种根据碱基配对原则和pam序列(tttn)设计的对应pca3基因lamp扩增靶标序列的一段crrna。
[0091]
所述对应pca3基因lamp扩增序列的一段crrna的序列为：uaauuucuacuaaguguaga
uucccagggaucucugugcuu。
[0092]
本发明的目的之三是提供一种pca3逆转录环介导恒温扩增联合crispr的一管式的检测方法。
[0093]
本发明的目的之四是提供了一种基于尿液为样本，检测前列腺癌风险的crispr-lamp的试剂盒。该试剂盒包括用于显示pca3核酸阳性扩增结果的报告子，以及上述特异扩增pca3基因部分片段的lamp引物以及对应pca3基因lamp扩增序列的一段crrna序列。按照结果中荧光信号的有无来判断脱落到尿液的细胞中是否大量表达pca3基因。本试剂盒灵敏度高，特异性好，而且可视化仅凭裸眼就可读出结果，判读更加准确、客观，操作简单，重复性好，具有良好的应用前景。
[0094]
本发明属于快速检测领域，在基于前列腺癌相关基因的基础上，联合环介导恒温扩增(lamp)和crispr体系构建检测pca3基因的平台，具体为利用lamp特异扩增pca3基因产生的扩增产物在crrna的引导下激活cas12a的附属切割活性使同时标记了fam荧光基团和淬灭基团的单链dna解离释放出可以明显的荧光信号从而实现前列腺相关基因pca3检测的方法。
[0095]
优点：
[0096]
1.无需依赖昂贵大型的仪器，一个普通恒温水浴锅即可实现检测过程。结果仅凭裸眼即可读出，适用于家庭自测使用。
[0097]
2.准确度高，可以提高前列腺癌的早期检出率，提高患者的生存率以及生存质量，其使用方便，适于大规模推广应用。
附图说明
[0098]
图1为本发明中第一组pca3引物实时荧光pcr扩增曲线图；
[0099]
图2为本发明中第二组pca3引物实时荧光pcr扩增曲线图；
[0100]
图3为本发明中第三组pca3引物实时荧光pcr扩增曲线图；
[0101]
图4为本发明中基于pca3基因序列设计的lamp引物在扩增片段上的相对位置，以及crrna序列的位置图；
[0102]
图5为本发明中pca3引物lamp扩增含有pca3基因质粒的实时荧光pcr扩增曲线图；p表示体系中含有模板，n表示没有加入模板的对照；
[0103]
图6为本发明中pca3引物lamp扩增含有pca3基因质粒的产物的琼脂糖凝胶电泳图；m表示dl 500dna marker，p表示体系中含有模板，n表示没有加入模板的对照；
[0104]
图7为本发明中bst dna聚合酶优化前pca3引物lamp扩增的实时荧光pcr扩增曲线图；
[0105]
图8为本发明中bst dna聚合酶优化后pca3引物lamp扩增的实时荧光pcr扩增曲线图；
[0106]
图9为本发明中63℃温度下pca3的lamp引物扩增不同浓度质粒的实时荧光pcr曲线图；
[0107]
图10为本发明中65℃温度下pca3的lamp引物扩增不同浓度质粒的实时荧光pcr曲线图；
[0108]
图11为本发明中67℃温度下pca3的lamp引物扩增不同浓度质粒的实时荧光pcr曲
线图；
[0109]
图12为本发明中pca3基因的lamp产物激活crispr/cas12a侧切活性后切割reporter的实时荧光曲线图；p表示体系中含有模板，n表示没有加入模板的对照；数字1，2，3表示三组平行；
[0110]
图13为本发明中lamp耦联crispr一管式荧光法检测含有pca3基因质粒的荧光结果图，positive表示体系中含有模板，negative表示未加入模板的对照。；
[0111]
图14为本发明中lamp耦联crispr一管式荧光法的灵敏度，negative表示未加入模板的对照；
[0112]
图15为本发明中lamp耦联crispr一管式荧光法的特异性，所选用于验证特异性的细胞系有前列腺癌细胞系vcap和lncap，前列腺增生细胞系bph-1，膀胱癌细胞系t24，宫颈癌细胞系hela，以及淋巴母细胞系；positive表示体系中含有质粒模板，negative表示未加入模板的对照。
具体实施方式
[0113]
下面通过实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。
[0114]
实施例1：基于crispr/cas12a耦联环介导恒温扩增的快速检测pca3基因的试剂盒，按以下步骤进行：
[0115]
pca3基因的环介导恒温扩增检测作为引物；
[0116]
对应pca3基因引物扩增产物的crrna；
[0117]
该试剂盒包括用于显示pca3核酸阳性扩增结果的报告子，以及上述特异扩增pca3基因部分片段的lamp引物以及对应pca3基因lamp扩增序列的一段crrna序列。
[0118]
按以下步骤进行：
[0119]
(一)、lamp引物设计与筛选：
[0120]
从ncbi下载pca3的基因序列(gene id 50652)，pca3基因包含4个外显子，根据相关文献报道及参考国外fda批准的progensa pca3产品，与前列腺癌高度相关的pca3位点在exon3与exon4之间，选取跨第3和第4内含子的部分序列基因即19270-19452和19681-20040位序列，提交至https：//primerexplorer.jp/e/网站进行lamp引物设计，共设计了3对引物；
[0121]
跨第3第4内含子的序列(划线部分为扩增序列)：
[0122]5′‑‑
gtgagaaataagaaaggctgctgactttaccatctgaggccacacatctgctgaaatggagataattaacatcactagaaacagcaagatgacaatataatgtctaagtagtgacatgtttttgcacatttccagcccctttaaatatccacacacacaggaagcacaaaaggaagcacagagatccctgggagaaatgcccggccgccatcttgggtcatcgatgagcctcgccctgtgcctggtcccgcttgtgagggaaggacattagaaaatgaattgatgtgttccttaaaggatgggcaggaaaacagatcctgttgtggatatttatttgaacgggattacagatttgaaatgaagtcacaaagtgagcattaccaatgagaggaaaacagacgagaaaatcttgatggcttcacaagacatgcaacaaacaaaatggaatactgtgatgacatgaggcagccaagctggggaggagataaccacggggcagagggtcaggattctggccctgctgcctaaactgtgcgttcataa
‑‑3’
[0123]
所述的引物如下：
[0124]
第一组：
[0125]
f3：5
’‑
atccacacacacaggaag-3
′
[0126]
b3：5
′‑
tgctcactttgtgacttca-3’[0127]
fip：5
’‑
ctcatcgatgacccaagatggccacaaaaggaagcacagag-3’[0128]
bip：5
’‑
gtgagggaaggacattagaaaatgatcaaataaatatccacaacaggatc-3
′
[0129]
lf：5
′‑
cgggcatttctcccagggat-3
′
[0130]
lb：5
′‑
ttccttaaaggatgggcagga-3’[0131]
第二组：
[0132]
f3：5
′‑
agcaagatgacaatataatgtct-3
′
[0133]
b3：5
′‑
catcctttaaggaacacatcaa-3
′
[0134]
fip：5
′‑
tctgtgcttccttttgtgcttcacatgtttttgcacatttcca-3
′
[0135]
bip：5
′‑
cgccatcttgggtcatcgatttctaatgtccttccctcac
′
[0136]
lf：5
′‑
tgtgtgtggatatttaaaggggc-3’[0137]
lb：5
′‑
tgtgcctggtcccgctt-3
′
[0138]
第三组：
[0139]
f3：5
′‑
gctcaagaggttcaaaatcc-3’[0140]
b3：5
’‑
tgaggcgtaatcagtcatc-3’[0141]
fip：5
’‑
tgctgttcagtgcaatcagtaatatactcattatcttctctttctttcac-3’[0142]
bip：5
’‑
tccccaatgtagccatgcaacttctggcttcagcagtc-3’[0143]
lf：5
’‑
agggagaggagcaggga-3’[0144]
lb：5
’‑
ccagtggctccttgtggt-3’[0145]
(二)、crrna的设计：
[0146]
将每组引物的扩增序列提交至https：//www.benchling.com/crispr/网站进行crrna序列的设计；
[0147]
针对上述几组引物扩增的序列分别设计了crrna，如下：
[0148]
第一组：uaauuucuacuaaguguagauaaaucuguaaucccguucaa
[0149]
第二组：uaauuucuacuaaguguagauaaaugaagucacaaagugag
[0150]
第三组：uaauuucuacuaaguguagauucccagggaucucugugcuu
[0151]
(三)、lamp引物以及crrna的筛选步骤：
[0152]
lamp引物以及crrna的筛选步骤为：1)使用各组引物分别去扩增带目标序列基因的质粒dna，选取扩增效率高扩增效果好的引物对进行下一步筛选，进行筛选的三条引物的扩增效率都较好；2)将扩增体系与crispr切割体系联合，观察每组引物扩增的产物是否能够在对应的crrna的引导下激活cas12a蛋白，使其发挥出其侧切活性切割体系中存在的所有单链dna；剔除的两组引物和对应的两条crrna是由于引物的扩增产物和对应的crrna与cas12a结合后无法很好的区分出阴阳性样品；引物经过筛选之后最优引物以及crrna见表1，引物和crrna在序列中的分布；
[0153]
表1用于lamp扩增pca3基因的序列以及crrna的序列
[0154][0155][0156]
(四)、试剂盒的组成：
[0157]
1)、引物混合试剂：
[0158]
1.6μm pca3-fip和pca3-bip、0.2μm pca3-f3和pca3-b3、0.4μm pca3-lf和pca3-lb；
[0159]
2)、lamp-crispr试剂：
[0160]1×
thermopol buffer、1.4mm dntps、6mm mg
2+
、0.16u bst大片段dna聚合酶、200nm cas12a、600nm crrna、2.5μm reporter、1
×
nebuffer 2.1；
[0161]
3)、阳性质控品：
[0162]
200ng/μl前列腺癌阳性细胞lncap基因组dna，经亚硫酸盐转化及纯化回收，即得到阳性质控品；
[0163]
4)、阴性质控品：
[0164]
分装的超纯水。
[0165]
基于crispr/cas12a耦联环介导恒温扩增的快速检测pca3基因的试剂盒，前列腺癌相关基因pca3基因的lamp检测方法，按以下步骤进行：
[0166]
采用lamp将前列腺癌特征基因pca3信号进行放大，利用cas12a和crrna组装的复合物识别lamp特异产物上的特征序列以激活cas12a的附属切割活性，从而对修饰了荧光基团和淬灭基团的单链dna进行切割，使其断开，释放出荧光，实现对pca3基因的特异性，可视化检测。
[0167]
基于crispr/cas12a耦联环介导恒温扩增的快速检测pca3基因的试剂盒，前列腺癌相关基因pca3基因的lamp检测方法，按以下步骤进行：
[0168]
将合成的带有pca3基因的质粒作为模板，构建lamp体系：20μl lamp反应体系中包含2μl模板质粒、1.6μm pca3-fip和pca3-bip、0.2μm pca3-f3和pca3-b3、0.4μm pca3-lf和pca3-lb、syto 9 4μm、1
×
thermopol buffer、1.4mm dntps、6mm mg
2+
、1u bst大片段dna聚合酶；
[0169]
在实时荧光pcr仪上63℃孵育40分钟，每分钟读取一次荧光值；并且将扩增的产物用3％的琼脂糖凝胶电泳进行跑胶；当体系中含有pca3质粒时，有明显的扩增曲线，在胶图中能观察到明显的条带；体系中不含有pca3质粒时，无扩增曲线，胶图中也观察不到条带。
[0170]
基于crispr/cas12a耦联环介导恒温扩增的快速检测pca3基因的试剂盒，前列腺癌相关基因pca3基因的lamp检测方法，对lamp检测体系优化：
[0171]
1)、酶用量的优化：
[0172]
在lamp扩增反应中，聚合酶的用量对扩增效果的影响至关重要；参考文献，体系试验了两种参与反应的酶的用量，0.16u/reaction，以及1u/reaction，1u/reaction的实验组的实时荧光扩增曲线的扩增效率提高了，到达平台期的时间缩短了；
[0173]
2)、扩增温度：
[0174]
在lamp扩增反应中，温度对扩增效率和最终的扩增结果的影响比较关键的；本实验参考相关文献，设定了lamp反应常用的温度63℃、65℃和67℃；结果，最终筛选确定的pca3的lamp引物组在65℃下扩增效率最好，扩增曲线的ct值最小，到达平台期所需的时间最短。
[0175]
基于crispr/cas12a耦联环介导恒温扩增的快速检测pca3基因的试剂盒，pca3基因的lamp扩增产物激活crispr/cas12a侧切活性的操作方法，按以下步骤进行：
[0176]
将合成的带有pca3基因的质粒作为模板，构建lamp体系：20μl lamp反应体系中包含2μl模板质粒、1.6μm pca3-fip和pca3-bip、0.2μm pca3-f3和pca3-b3、0.4μm pca3-lf和pca3-lb、1
×
thermopol buffer、1.4mm dntps、6mm mg
2+
、1u bst大片段dna聚合酶，加在管底；
[0177]
接着加入50μl的石蜡油进行液封；crispr/cas12a体系包含200nm cas12a、600nm crrna、2.5μm reporter、1
×
nebuffer 2.1缓冲液，加在管盖上；先在金属浴上63℃加热40分钟，然后用离心机瞬时离心将管盖的crispr/cas12a试剂离心到管底，继续在金属浴上37℃孵育15分钟，然后在紫外灯下观察结果；
[0178]
当体系中存在pca3质粒时，cas12a的侧切活性被激活，切割单链reporter，在紫外灯的照射下发出明显的荧光信号，当体系中不存在有pca3质粒时，cas12a的侧切活性无法被激活，reporter的结构保持完整，在紫外灯下无法观察到荧光信号。
[0179]
基于crispr/cas12a耦联环介导恒温扩增的快速检测pca3基因的试剂盒，pca3基因的lamp扩增耦联crispr荧光可视化法的操作方法，按以下步骤进行：
[0180]
将合成的带有pca3基因的质粒作为模板，构建lamp体系：20μl lamp反应体系中包含2μl模板质粒、1.6μm pca3-fip和pca3-bip、0.2μm pca3-f3和pca3-b3、0.4μm pca3-lf和pca3-lb、1
×
thermopol buffer、1.4mm dntps、6mm mg
2+
、1u bst大片段dna聚合酶，加在管底；
[0181]
接着加入50μl的石蜡油进行液封；crispr/cas12a体系包含200nm cas12a、600nm crrna、2.5μm reporter、1
×
nebuffer 2.1缓冲液，加在管盖上；先在金属浴上63℃加热40分钟，然后用离心机瞬时离心将管盖的crispr/cas12a试剂离心到管底，继续在金属浴上37℃孵育15分钟，然后在紫外灯下观察结果；当体系中存在pca3质粒时，cas12a的侧切活性被激活，切割单链reporter，在紫外灯的照射下发出明显的荧光信号，当体系中不存在有pca3质粒时，cas12a的侧切活性无法被激活，reporter的结构保持完整，在紫外灯下无法观察到荧光信号；
[0182]
基于crispr/cas12a耦联环介导恒温扩增的快速检测pca3基因的试剂盒，灵敏度测试方法，按以下步骤进行：
[0183]
将合成的带有pca3基因的质粒用depc水进行十倍梯度稀释，使其浓度为103，102，101，100拷贝/μl(copies/μl)；
[0184]
将所述梯度稀释的带有pca3基因的质粒作为模板，构建lamp体系：20μl lamp反应体系中包含2μl模板质粒、1.6μm pca3-fip和pca3-bip、0.2μm pca3-f3和pca3-b3、0.4μm pca3-lf和pca3-lb、1
×
thermopol buffer、1.4mm dntps、6mm mg
2+
、1u bst大片段dna聚合酶，加在管底；
[0185]
接着加入50μl的石蜡油进行液封。crispr/cas12a体系包含200nm cas12a、600nm crrna、2.5μm reporter、1
×
nebuffer 2.1缓冲液，加在管盖上；先在金属浴上63℃加热40分钟，然后用离心机瞬时离心将管盖的crispr/cas12a试剂离心到管底，继续在金属浴上37℃孵育15分钟，然后在紫外灯下观察结果；当质粒浓度为102copies/μl或更高时，样本在紫外灯下发出明显的荧光，当质粒浓度为101copies/μl和100copies/μl时，样本无明显荧光。
[0186]
基于crispr/cas12a耦联环介导恒温扩增的快速检测pca3基因的试剂盒，特异性测试方法，按以下步骤进行：
[0187]
提取前列腺癌细胞系vcap，lncap的rna反转录得到cdna，以及提取前列腺增生细胞系bph-1，膀胱癌细胞系t24，宫颈癌细胞系hela，以及淋巴母细胞系的rna反转录得到cdna，用合成的带前列腺相关基因pca3序列的质粒作为阳性对照。
[0188]
以上述六种细胞系的cdna为模板，分别以pca3的引物进行扩增，扩增体系为：20μl lamp反应体系中包含2μl模板质粒、1.6μm pca3-fip和pca3-bip、0.2μm pca3-f3和pca3-b3、0.4μm pca3-lf和pca3-lb、1
×
thermopol buffer、1.4mm dntps、6mm mg
2+
、1u bst大片段dna聚合酶，加在管底。
[0189]
接着加入50μl的石蜡油进行液封。crispr/cas12a体系包含200nm cas12a、600nm crrna、2.5μm reporter、1
×
nebuffer 2.1缓冲液，加在管盖上。先在金属浴上63℃加热40分钟，然后用离心机瞬时离心将管盖的crispr/cas12a试剂离心到管底，继续在金属浴上37℃孵育15分钟，然后在紫外灯下观察结果。加入vcap细胞系cdna和加入lncap细胞系cdna的样品发出了和阳性对照组一样明显的荧光，加入其余细胞系的样品组与阴性对照一样没有观察到明显的荧光。表明该检测方法具有良好的特异性。
[0190]
对20例确诊为前列腺癌人群的尿液样本利用实施例6的方法进行检测，将模板由质粒改为从尿液样本中提取的rna反转录得到的cdna。根据最终的显色情况，将样本划分为前列腺癌阳性组及阴性组。将基于crispr-cas12a耦联lamp检测pca3基因的方法检测得到的样本结果与样本临床病理进行比较，有如下结果：
[0191]
表2：样本试验临床信息与检测结果汇总表
[0192][0193][0194]
从表中可以看出，该试剂盒的准确度为95％。