技术特征：
1.基于crispr/cas12a耦联环介导恒温扩增的快速检测pca3基因的试剂盒，其特征在于按以下步骤进行：pca3基因的环介导恒温扩增检测作为引物；对应pca3基因引物扩增产物的crrna；该试剂盒包括用于显示pca3核酸阳性扩增结果的报告子，以及上述特异扩增pca3基因部分片段的lamp引物以及对应pca3基因lamp扩增序列的一段crrna序列。2.根据权利要求1所述的基于crispr/cas12a耦联环介导恒温扩增的快速检测pca3基因的试剂盒，其特征在于：(一)、lamp引物设计与筛选：从ncbi下载pca3的基因序列(gene id 50652)，pca3基因包含4个外显子，根据相关文献报道及参考国外fda批准的progensa pca3产品，与前列腺癌高度相关的pca3位点在exon3与exon4之间，选取跨第3和第4内含子的部分序列基因即19270-19452和19681-20040位序列，提交至https：//primerexplorer.jp/e/网站进行lamp引物设计，共设计了3对引物；跨第3第4内含子的序列(划线部分为扩增序列)：5
’‑‑
gtgagaaataagaaaggctgctgactttaccatctgaggccacacatctgctgaaatggagataattaacatcactagaaacagcaagatgacaatataatgtctaagtagtgacatgtttttgcacatttccagcccctttaaatatccacacacacaggaagcacaaaaggaagcacagagatccctgggagaaatgcccggccgccatcttgggtcatcgatgagcctcgccctgtgcctggtcccgcttgtgagggaaggacattagaaaatgaattgatgtgttccttaaaggatgggcaggaaaacagatcctgttgtggatatttatttgaacgggattacagatttgaaatgaagtcacaaagtgagcattaccaatgagaggaaaacagacgagaaaatcttgatggcttcacaagacatgcaacaaacaaaatggaatactg tgatgacatgaggcagccaagctggggaggagataaccacggggcagagggtcaggattctggccctgctgcctaaactgtgcgttcataa
‑‑3’
所述的引物如下：第一组：f3：5
′‑
atccacacacacaggaag-3
′
b3：5
′‑
tgctcactttgtgacttca-3
′
fip：5
′‑
ctcatcgatgacccaagatggccacaaaaggaagcacagag-3
′
bip：5
’‑
gtgagggaaggacattagaaaatgatcaaataaatatccacaacaggatc-3
′
lf：5
′‑
cgggcatttctcccagggat-3
′
lb：5
′‑
ttccttaaaggatgggcagga-3
′
第二组：f3：5
′‑
agcaagatgacaatataatgtct-3
′
b3：5
′‑
catcctttaaggaacacatcaa-3
′
fip：5
′‑
tctgtgcttccttttgtgcttcacatgtttttgcacatttcca-3
′
bip：5
′‑
cgccatcttgggtcatcgatttctaatgtccttccctcac
′
lf：5
′‑
tgtgtgtggatatttaaaggggc-3
′
lb：5
′‑
tgtgcctggtcccgctt-3
′
第三组：
f3：5
′‑
gctcaagaggttcaaaatcc-3’b3：5
’‑
tgaggcgtaatcagtcatc-3
′
fip：5
′‑
tgctgttcagtgcaatcagtaatatactcattatcttctctttctttcac-3
′
bip：5
′‑
tccccaatgtagccatgcaacttctggcttcagcagtc-3
′
lf：5
′‑
agggagaggagcaggga-3
′
lb：5
’‑
ccagtggctccttgtggt-3’(二)、crrna的设计：将每组引物的扩增序列提交至https：//www.benchling.com/crispr/网站进行crrna序列的设计；针对上述几组引物扩增的序列分别设计了crrna，如下：第一组：uaauuucuacuaaguguagauaaaucuguaaucccguucaa第二组：uaauuucuacuaaguguagauaaaugaagucacaaagugag第三组：uaauuucuacuaaguguagauucccagggaucucugugcuu(三)、lamp引物以及crrna的筛选步骤：lamp引物以及crrna的筛选步骤为：1)使用各组引物分别去扩增带目标序列基因的质粒dna，选取扩增效率高扩增效果好的引物对进行下一步筛选，进行筛选的三条引物的扩增效率都较好；2)将扩增体系与crispr切割体系联合，观察每组引物扩增的产物是否能够在对应的crrna的引导下激活cas12a蛋白，使其发挥出其侧切活性切割体系中存在的所有单链dna；剔除的两组引物和对应的两条crrna是由于引物的扩增产物和对应的crrna与cas12a结合后无法很好的区分出阴阳性样品；引物经过筛选之后最优引物以及crrna见表1，引物和crrna在序列中的分布；表1用于lamp扩增pca3基因的序列以及crrna的序列表1用于lamp扩增pca3基因的序列以及crrna的序列(四)、试剂盒的组成：1)、引物混合试剂：1.6μm pca3-fip和pca3-bip、0.2μm pca3-f3和pca3-b3、0.4μm pca3-lf和pca3-lb；2)、lamp-crispr试剂：1
×
thermopol buffer、1.4mm dntps、6mm mg
2+
、0.16u bst大片段dna聚合酶、200nm cas12a、600nm crrna、2.5μm reporter、1
×
nebuffer 2.1；3)、阳性质控品：
200ng/μl前列腺癌阳性细胞lncap基因组dna，经亚硫酸盐转化及纯化回收，即得到阳性质控品；4)、阴性质控品：分装的超纯水。3.根据权利要求2所述的基于crispr/cas12a耦联环介导恒温扩增的快速检测pca3基因的试剂盒，前列腺癌相关基因pca3基因的lamp检测方法，其特征在于按以下步骤进行：采用lamp将前列腺癌特征基因pca3信号进行放大，利用cas12a和crrna组装的复合物识别lamp特异产物上的特征序列以激活cas12a的附属切割活性，从而对修饰了荧光基团和淬灭基团的单链dna进行切割，使其断开，释放出荧光，实现对pca3基因的特异性，可视化检测。4.根据权利要求3所述的基于crispr/cas12a耦联环介导恒温扩增的快速检测pca3基因的试剂盒，前列腺癌相关基因pca3基因的lamp检测方法，其特征在于按以下步骤进行：将合成的带有pca3基因的质粒作为模板，构建lamp体系：20μl lamp反应体系中包含2μl模板质粒、1.6μm pca3-fip和pca3-bip、0.2μm pca3-f3和pca3-b3、0.4μm pca3-lf和pca3-lb、syto 94μm、1
×
thermopol buffer、1.4mm dntps、6mm mg
2+
、1u bst大片段dna聚合酶；在实时荧光pcr仪上63℃孵育40分钟，每分钟读取一次荧光值；并且将扩增的产物用3％的琼脂糖凝胶电泳进行跑胶；当体系中含有pca3质粒时，有明显的扩增曲线，在胶图中能观察到明显的条带；体系中不含有pca3质粒时，无扩增曲线，胶图中也观察不到条带。5.根据权利要求3或4所述的基于crispr/cas12a耦联环介导恒温扩增的快速检测pca3基因的试剂盒，前列腺癌相关基因pca3基因的lamp检测方法，对lamp检测体系优化其特征在于：1)、酶用量的优化：在lamp扩增反应中，聚合酶的用量对扩增效果的影响至关重要；参考文献，体系试验了两种参与反应的酶的用量，0.16u/reaction，以及1u/reaction，1u/reaction的实验组的实时荧光扩增曲线的扩增效率提高了，到达平台期的时间缩短了；2)、扩增温度：在lamp扩增反应中，温度对扩增效率和最终的扩增结果的影响比较关键的；本实验参考相关文献，设定了lamp反应常用的温度63℃、65℃和67℃；结果，最终筛选确定的pca3的lamp引物组在65℃下扩增效率最好，扩增曲线的ct值最小，到达平台期所需的时间最短。6.根据权利要求3所述的基于crispr/cas12a耦联环介导恒温扩增的快速检测pca3基因的试剂盒，pca3基因的lamp扩增产物激活crispr/cas12a侧切活性的操作方法，其特征在于按以下步骤进行：将合成的带有pca3基因的质粒作为模板，构建lamp体系：20μl lamp反应体系中包含2μl模板质粒、1.6μm pca3-fip和pca3-bip、0.2μm pca3-f3和pca3-b3、0.4μm pca3-lf和pca3-lb、1
×
thermopolbuffer、1.4mm dntps、6mm mg
2+
、1u bst大片段dna聚合酶，加在管底；接着加入50μl的石蜡油进行液封；crispr/cas12a体系包含200nm cas12a、600nm crrna、2.5μm reporter、1
×
nebuffer 2.1缓冲液，加在管盖上；先在金属浴上63℃加热40
b3、0.4μm pca3-lf和pca3-lb、1
×
thermopol buffer、1.4mm dntps、6mm mg
2+
、1u bst大片段dna聚合酶，加在管底；接着加入50μl的石蜡油进行液封，crispr/cas12a体系包含200nm cas12a、600nm crrna、2.5μm reporter、1
×
nebuffer 2.1缓冲液，加在管盖上；先在金属浴上63℃加热40分钟，然后用离心机瞬时离心将管盖的crispr/cas12a试剂离心到管底，继续在金属浴上37℃孵育15分钟，然后在紫外灯下观察结果；加入vcap细胞系cdna和加入lncap细胞系cdna的样品发出了和阳性对照组一样明显的荧光，加入其余细胞系的样品组与阴性对照一样没有观察到明显的荧光；表明该检测方法具有良好的特异性。
技术总结
本发明是一种试剂盒，特别涉及基于CRISPR/Cas12a耦联环介导恒温扩增的快速检测PCA3基因的试剂盒。在基于前列腺癌相关基因的基础上，联合环介导恒温扩增(LAMP)和CRISPR体系构建检测PCA3基因的平台，具体为利用LAMP特异扩增PCA3基因产生的扩增产物在crRNA的引导下激活Cas12a的附属切割活性使同时标记了FAM荧光基团和淬灭基团的单链DNA解离释放出可以明显的荧光信号从而实现前列腺相关基因PCA3检测的方法。检测的方法。检测的方法。
技术研发人员：王军红 王英
受保护的技术使用者：杭州昱鼎生物科技有限公司
技术研发日：2022.08.01
技术公布日：2023/1/23