四环二倍半萜类化合物及其合成基因簇

本发明涉及基因工程领域，尤其是涉及四环二倍半萜类化合物及其合成基因簇。

背景技术：

1、真菌天然产物是药物开发的重要来源，大量基因组的解密揭示真菌含有大量潜在的新颖生物合成基因簇“暗物质”。萜类化合物是所有异戊二烯聚合物及其衍生物的总称，丰富的结构类型及广泛的生物活性决定了其在天然药物研究中的重要地位。其中二萜和二倍半萜是真菌中结构类型最丰富多样和最重要的次级代谢产物，广泛应用于制药、香料、树脂和其他精细化学品。随着ncbi中释放基因组数据库的不断增加，研究者发现真菌基因组中蕴含着大量萜类生物合成基因簇，这就意味着以萜类合酶基因组挖掘为导向，通过代谢工程和合成生物学策略，在微生物体内重构代谢途径，不仅能够获得更多新结构、高活性的化合物，还能发现不同种类化合物的生物合成途径，这为新药研发提供崭新的途径。

2、mangicols是一类具有多种潜在药用价值的四环二倍半萜类化合物，如mangicolsa和b表现出显著的抗炎活性，并对多种癌细胞系具有良好的细胞毒活性。自2000年首次报道，迄今为止仅发现了13个mangicols类化合物。因此mangicols类化合物具有较好的开发及研究前景。通过对其生物合成基因簇进行异源表达，可有效避免传统天然产物研究中的盲目性，高效挖掘更多具有生物活性的mangicols类化合物。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供四环二倍半萜类化合物及其合成基因簇。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

3、本发明首先提供一类四环二倍半萜类化合物，mangicol h至mangicol p的结构式分别如下所示：

4、

5、本发明进一步提供四环二倍半萜类化合物mangicol h至mangicol p的生物合成基因簇fomd，含有6个基因，分别为编码二倍半萜合酶foms的基因fomde或其功能等同体，编码细胞色素p450酶fomda、fomdc、fomdd的基因fomda，fomdc，fomdd或其功能等同体，编码醛酮还原酶fomdb的基因fomdb或其功能等同体，编码水解酶fomdf的基因fomdf或其功能等同体，其中，所述fomda的核苷酸序列如seq id no.1所示，fomdb的核苷酸序列如seq id no.2所示，fomdc的核苷酸序列如seq id no.3所示，fomdd的核苷酸序列如seq id no.4所示，fomdf的核苷酸序列如seq id no.5所示，fomde的核苷酸序列如seq id no.6所示；

6、或者，6个基因的核苷酸序列是分别与编码蛋白fomda、fomdb、fomdc、fomdd、fomdf和foms的氨基酸序列一致性高于80％所对应的dna编码序列。

7、本发明进一步提供四环二倍半萜类化合物mangicols h至mangicols p的生物合成基因簇fomd在制备萜类化合物中的应用。

8、在本发明的一个实施方式中，提供四环二倍半萜类化合物mangicol h至mangicolp的生物合成基因簇fomd在合成四环二倍半萜类化合物mangicol h至mangicol p中的应用。

9、本发明进一步提供表达四环二倍半萜类化合物mangicol h至mangicol p的生物合成基因簇fomd的载体，为含有基因fomda、fomdb、fomdc、fomdd、fomdf和fomde的真核或原核表达载体。

10、本发明进一步提供所述四环二倍半萜类化合物的制备方法，通过米曲霉aspergillus oryzae nsar1中异源表达的方法表达尖孢镰刀菌14005(fusariumoxysporum 14005)中四环二倍半萜类化合物mangicol h至mangicol p的生物合成基因簇fomd中的基因来获得四环二倍半萜类化合物mangicol h至mangicol p。

11、其中，米曲霉aspergillus oryzae nsar1、尖孢镰刀菌14005(fusariumoxysporum 14005)均为本领域技术人员已知的生物材料。

12、在本发明的一个实施方式中，所述四环二倍半萜类化合物的制备方法包括以下步骤：

13、(1)以fusarium oxysporum 14005的基因组为模板，分别以引物fomde-f/fomde-r，fomda-f/fomda-r，fomdc-f/fomdc-r，fomdd-f/fomdd-r，fomdb-f/fomdb-r和fomdf-f/fomdf-r对二萜合酶的基因fomde，细胞色素p450酶基因fomda，fomdc，fomdd，醛酮还原酶基因fomdb，水解酶基因fomdf，进行pcr扩增，得到基因fomde，fomda，fomdc，fomdd，fomdb和fomdf的pcr产物；然后以米曲霉aspergillus oryzae nsar1表达载体puara4为载体构建fomde，fomda和fomdc的共表达载体puara4-fomdace；以米曲霉aspergillus oryzae nsar1表达载体pusa4为载体构建fomdd，fomdb和fomdf的共表达载体pusa4-fomdbdf；

14、(2)在peg溶剂的介导下，将共表达载体puara4-fomdace和pusa4-fomdbdf共同转化至易于表达萜类合酶基因的高产宿主米曲霉a.oryzae nsar1(niad-，sc-，δargb，adea-)的原生质体中，获得能产生四环二倍半萜类化合物mangicol h至mangicol p的米曲霉转化子ao-fomdabcdef；

15、(3)将米曲霉转化子ao-fomdabcdef的菌丝体接种并培养，生成四环二倍半萜类化合物mangicol h至mangicol p。

16、在本发明的一个实施方式中，所述引物fomde-f/fomde-r，fomda-f/fomda-r，fomdc-f/fomdc-r，fomdd-f/fomdd-r，fomdb-f/fomdb-r和fomdf-f/fomdf-r的核苷酸序列分别是：

17、fomda-f：

18、aagctccgaattcgagctcgatggagtacagtgagcttagcctag

19、fomda-r：

20、gagctactacagatccccggtcaacagttcagcgtagataagtcc

21、fomdb-f：ttcgaatcgatttgagctagatgtctcagaaaggccccca

22、fomdb-r：

23、atcgggtacgaggccgctagctatgcttcaaatactgacccaaag

24、fomdc-f：agctccggaattcgagctcgatggcacactacgacttcaa

25、fomdc-r：

26、agctactacagatccccggctagttagaaaatgactcaaacatgg

27、fomdd-f：ccccacagcaagctccgttaatggacttcacttatcgctactctt

28、fomdd-r：gtgcatatgatttaaatttactattccacacgcagcatctcaaga

29、fomde-f：ttcgaatcgatttgagctagatgggcaatttcaggttagataatg

30、fomde-r：gtcactagtgcggccgctagctacttgatggtgactcgaa

31、fomdf-f:ccccacagcaagctccgttaatgaagttactcgctctgtc

32、fomdf-r:gtgcatatgatttaaatttatcacgcctggcacagagctc。

33、在本发明的一个实施方式中，步骤(3)中，将米曲霉转化子ao-fomdabcdef的菌丝体接种并培养的方法为：将米曲霉转化子ao-fomdabcdef的菌丝体接种于含0.1％腺嘌呤的mpy培养基中，于30℃，220rpm培养2天作为种子液，按照80g大米，120ml去离子水中加入5ml种子液的比例，接种于添加0.1％腺嘌呤的大米固体培养基中，30℃，静置培养18天。

34、在本发明的一个实施方式中，步骤(3)中，将米曲霉转化子ao-fomdabcdef的菌丝体接种并培养后，将ao-fomdabcdef的固体发酵物加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，蒸干后获得浸膏；浸膏用石油醚萃取获得极性小的组分，石油醚萃取液蒸干后进行正相分离，以石油醚和乙酸乙酯为流动相进行洗脱并富集目标组分fr.5和fr.7；fr.5进行凝胶柱分离，最终用反相cholester色谱柱，乙腈/0.1％甲酸水体积比80:20为流动相洗脱获得mangicolk；fr.7进行凝胶柱分离获得三个馏分fr.7.1-fr.7.3.fr.7.2用ace c18-pfp色谱柱进行半制备，以乙腈/0.1％甲酸水体积比75:25为流动相洗脱获得mangicol o和馏分fr.7.2.1；馏分fr.7.2.1进一步用手型柱chiralpak ia，以正己烷/乙醇体积比95：5为流动相获得mangicols h和i，fr.7.3用phenomenex色谱柱进行半制备，以乙腈/0.1％甲酸水体积比80:20为流动相洗脱获得mangicol l，mangicoln和mangicol p以及馏分fr.7.3.1；馏分fr.7.3.1进一步用手型柱chiralpak ia，以正己烷/乙醇体积比94：6为流动相获得mangicol j和mangicol m。

35、与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

36、本发明提供了一类四环二倍半萜类化合物及其制备方法与应用。研发过程中发明人通过基因组挖掘的策略从尖孢镰刀菌14005(fusarium oxysporum 14005)中发现了新颖的mangicols h-p生物合成基因簇。通过异源表达的方式，实现了mangicols h-p生物合成基因簇中的基因在米曲霉中的表达。最终，分离纯化获得了9个全新的四环二倍半萜类化合物，即四环二倍半萜类化合物mangicol h至mangicol p。

37、本发明的创新点主要体现在利用基因工程的方法，构建产生新四环二倍半萜类化合物mangicol h至mangicol p的自给自足工程菌。整个操作过程简单，工艺成熟，成本低廉，整个过程不含有害杂质，无毒，对环境非常友好。获得的产物mangicols h-p为二倍半萜化合物的生物合成提供了新的资源，为该类化合物种类的获得提供了一种选择，为丰富天然产物化合物库、发现新抗生素提供了宝贵的先导化合物资源。