一种新型抗菌肽Dermaseptin-PP的研究方法

一种新型抗菌肽dermaseptin-pp的研究方法
技术领域
1.本发明涉及生物制药技术领域，具体是涉及一种新型抗菌肽dermaseptin-pp的研究方法。


背景技术：

2.癌症是对人类健康最具威胁的重大疾病之一，其中肺癌是世界上引起死亡最多的癌症之一，发病率和死亡率常均居恶性肿瘤前列。非小细胞肺癌在所有肺癌中占比约85％，且大多数患者确诊时多处于晚期阶段。目前，化疗是临床上最常用的肺癌治疗方法之一。然而，化疗药物常具有缺乏肿瘤靶向性，药物利用率低，副作用大，易引起肿瘤耐药等问题，导致临床疗效欠佳。
3.抗菌肽是天然来源的药物，越来越多研究表明许多amp具有较强的体内外抗肿瘤活性。相比传统化疗药而言，抗菌肽在抗肿瘤方面的优势显著。抗菌肽是一类由10-100个氨基酸组成的短肽类，具有正电性及两亲性。目前，已发现抗菌肽数据库(apd)中超过250 条抗菌肽均具有抗肿瘤作用。抗菌肽的抗肿瘤作用机制可分为两大类：一是选择性膜破坏机制，与其杀菌作用类似，抗菌肽通过静电吸引直接与肿瘤细胞接触，形成穿膜孔洞或破坏直接细胞膜的完整性，使肿瘤细胞死亡；另一类为非膜破坏机制，包括有：破坏肿瘤细胞骨架使其结构紊乱，抑制肿瘤dna合成，抑制肿瘤血管生成，调节免疫，诱导肿瘤细胞凋亡或坏死等，近年来，阳离子抗菌肽逐渐被证实能通过特异性的破膜作用机制发挥强抗肿瘤作用，这使其成为了最具研究前景的新型抗肿瘤药物之一。此外，许多研究发现阳离子抗菌肽可以通过破坏肿瘤细胞膜从而提高化疗药物的细胞摄取量，甚至在一定程度上逆转肿瘤细胞的化疗耐药性，进而增强化疗药效，逐渐展露其与化疗药物协同抗肿瘤的广阔应用前景。dermaseptin-pp肽是作者前期从南美树蛙(phyllomedusa palliata)皮肤分泌物中首次发现并鉴定出的一条属于dermaseptin家族的阳离子抗菌肽，带4个正电荷。已有多篇研究发现dermaseptin家族抗菌肽能通过破坏肿瘤细胞膜发挥强抗肿瘤活性。基于此，本研究旨在深入探究dermaseptin-pp肽的抗肿瘤活性及作用机制，探究其对紫杉醇等常用化疗药物的增效作用，并结合制剂手段实现dermaseptin-pp与紫杉醇联用进行肺癌治疗。
4.本发明公开了一种新型抗菌肽dermaseptin-pp的研究方法，属于生物制药技术领域，其技术要点是：dermaseptin家族抗菌肽由于通常具有正电性及两亲性，可以选择性的与富含阴离子成分的肿瘤细胞膜通过静电作用而结合，进而插入细胞膜使产生孔洞，造成肿瘤细胞内容物的外泄，从而快速且高效地杀伤肿瘤细胞。此种独特的破膜机制作用迅速，且不易使肿瘤细胞产生耐药性，因此，dermaseptin家族抗菌肽作为新型抗肿瘤药物具有较好的应用前景，dermaseptin-pp与dermaseptin-3的序列相似性高于90％，属于 dermaseptin家族抗菌肽。dermaseptin-pp具有强广谱的抗肿瘤活性，其主要机制为破坏肿瘤细胞膜，低浓度肽的破膜作用可提高多种化疗药物的抗肿瘤作用。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的不足，本发明实施例的目的在于提供一种新型抗菌肽 dermaseptin-pp的研究方法，以解决上述背景技术中的问题。
6.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
7.一种新型抗菌肽dermaseptin-pp的研究方法，包括步骤如下：
8.步骤一：dermaseptin-pp的分离鉴定，采用电刺激法(5v,50hz,4ms)获取phyllomedusa palliata青蛙的皮肤分泌物，冷冻干燥，采用mrna direct
tm
试剂盒 (biotech，uk)提取皮肤分泌物冻干粉中的poly-a mrna，根据bd smart
tm
race cdna amplification kit试剂盒的操作说明，将提取的mrna逆转录合成第一链cdna，然后对cdna进行3'-race pcr进行扩增，获得全长的pre-pro-dermaseptin-pp基因，接着，通过琼脂糖凝胶电泳分析race pcr产物，并采用cycle pure kit试剂盒(omega bio-tek,usa)对pcr产物进行纯化，接着将目的基因与-t easy vector表达载体连接重组，导入jm109高效感受态大肠杆菌中进行扩增，通过蓝白筛选挑选阳性转化子，采用pcr扩增目的基因，进行测序，将碱基序列翻译为氨基酸序列；
9.步骤二：dermaseptin-pp的体内外抗肿瘤活性及机制研究，研究发现阳离子抗菌肽dermaseptin-pp具有广谱且高效的体外抗肿瘤活性，其中对h157细胞作用最强，证实其主要作用机制为破坏肿瘤细胞膜和诱导肿瘤细胞凋亡，dermaseptin-pp独特的细胞膜作用机制不易诱导肿瘤细胞产生耐药性，具有较大的抗肿瘤发展潜力，首先采用mtt实验考察了dermaseptin-pp对h157，mcf-7，pc-3和u251mg的细胞毒性，发现dermaseptin-pp 能显著抑制四种细胞的增殖，且具有浓度依赖性，表现出了广谱抗肿瘤活性；
10.步骤三：dermaseptin-pp和化疗药物协同抗肺癌活性及其细胞膜活性机制研究，以h157 和a549两种肺癌细胞为模型，考察四种广谱化疗药物(ptx/dtx/ddp/dox)单用和与低浓度dermaseptin-pp联用的细胞毒性，mtt实验结果表明：与低浓度dermaseptin-pp 联用后，四种化疗药对两种细胞的增殖抑制率均有显著提高，ic
50
值均显著降低，药物联用指数ci值提示dermaseptin-pp与四种化疗药均为协同效果。
11.作为本发明进一步的方案，所述dermaseptin-pp的体内外抗肿瘤活性及机制研究包括如下步骤：
12.步骤一：细胞复苏及培养，从液氮罐中取出冻存的细胞，在37℃恒温水浴锅中快速升温融化，然后于离心机中离心(8000rpm
×
3min)，喷洒酒精后，于安全柜内弃去上清液，加入1ml完全培养基(含10％fbs和1％双抗)，混悬细胞，然后将细胞悬液转移至中号培养皿内，补加9ml完全培养基，混合均匀后，放入5％co2，37℃细胞培养箱内培养；
13.步骤二：mtt细胞毒性实验，mtt细胞毒性实验包括细胞接种及给药以及呈色及比色两个程序，呈色及比色是将给药24h的细胞从培养箱中取出，每孔加入mtt溶液(5 mg/ml)10μl，避光培养4h，将含有mtt的培养基轻轻吸出弃掉，加入dmso溶液100 μl，水平摇床上振荡10min，充分溶解紫色结晶；
14.在酶标仪490nm波长下测定各孔吸光度值(optical density，od)，记录实验结果，药物对细胞抑制率计算公式如下：
15.100，每个浓度设置3个重复，样品置于37℃孵育2h，900
×
g离心3min，取100μl 上清液于新的96孔盘中，除去气泡，在酶标仪450nm波长下测定各孔吸光度值，记录实验结果，溶血率计算公式如下：
37.溶血率(％)＝(od
给药组-od
阴性组
)/(od
阳性组-od
阴性组
)
×
100
ꢀꢀ
(公式3)。
38.作为本发明进一步的方案，所述荷h157肺癌皮下瘤裸鼠模型的建立包括：
39.实验动物饲养，spf级balb/c雄性裸鼠，放置于25℃，12h光暗交替的环境中饲养，由专门饲养员提供食物和水，实验小鼠可以自主觅食与饮水；
40.荷瘤动物模型建立，将生长状态良好的h157细胞培养到对数生长期，用0.25％胰蛋白酶-0.02％edta消化液消化完全，利用血球计数板对细胞进行计数，用pbs缓冲液洗涤细胞2次并重悬细胞使成为细胞密度为1
×
108个/ml的细胞悬液，balb/c-裸鼠(18g-20g)，通过腋下皮下接种h157细胞悬液，接种量为100μl/只，(含有1
×
107个细胞)，接种 h157细胞的小鼠继续培养14天后备用(平均肿瘤体积约为200-250mm3)。
41.作为本发明进一步的方案，所述dermaseptin-pp肽抗肺癌体内药效评价包括：
42.分组及给药，将荷瘤小鼠随机分成5组，每组5只；
43.体重与瘤体积，自第一天给药起，每两天记录一次各组小鼠的体重和肿瘤体积，通过数字游标卡尺测量肿瘤的长度(l)和宽度(w)，根据下式计算肿瘤体积：
44.肿瘤体积(mm3)＝(l
×
w2)/2
ꢀꢀ
(公式4)；
45.抑瘤率及脾脏指数，末次给药的24h后，即第11天，解剖各组小鼠，剥离出皮下肿瘤组织，并解剖出肝和肺，脾，用生理盐水洗涤器官直至器官表面没有浮血，用滤纸吸干各器官多余的水分，然后于天平上记录各组肿瘤和脾脏重量，同时拍照记录，结束后肝，肿瘤和脾脏转移至4％多聚甲醛中固定，肺则先浸泡于pbs中直至漂浮到液面上，然后转移至4％多聚甲醛中固定过夜，根据以下公式计算肿瘤抑制率(tumor inhibition rate,tir) 及脾脏指数：
46.抑瘤率(tir)＝(1-给药组瘤重/pbs组平均瘤重)
×
100％
ꢀꢀ
(公式5)
47.脾脏指数＝脾脏质量/体重量
ꢀꢀ
(公式6)。
48.作为本发明进一步的方案，所述细胞凋亡通路分析及生物安全性评价采用he染色分析各器官的病理情况及肿瘤转移情况，评价dermaseptin-pp肽的生物安全性，采用tunel 染色和免疫组化染色综合分析dermaseptin-pp作用后肿瘤组织中凋亡相关蛋白的表达情况，分析dermaseptin-pp肽的作用机制。
49.为更清楚地阐述本发明的结构特征和功效，下面结合附图与具体实施例来对本发明进行详细说明。
附图说明
50.图1.dermaseptin-pp前体的开放阅读框序列及相应的氨基酸序列。
51.图2.dermaseptin-pp在10mm醋酸铵水溶液和50％2,2,2-三氟乙醇(tfe)-10mmnh4ac水溶液中的圆二色谱图。
52.图3mtt实验检测经dermaseptin-pp处理后不同肿瘤细胞的存活率。
53.图4不同浓度dermaseptin-pp处理后细胞的ldh释放率。
54.图5激光共聚焦显微镜观察h157细胞形态变化。
55.图6流式细胞仪检测dermaseptin-pp对h157细胞凋亡的影响。
56.图7dermaseptin-pp对家兔红细胞的的溶血作用。
57.图8dermaseptin-pp的体内抗肺癌药效。
58.图9dermaseptin-pp诱导h157细胞的凋亡通路分析。
59.图10各给药组小鼠的脾脏指数与正常小鼠组相比。
60.图11dermaseptin-pp的生物安全性评价(a)实验期间各组小鼠体重变化情况；(b) 不同给药组离体肿瘤，肺及肝脏组织的he染色图片。
61.图12紫杉醇脂质体的粒径分布图。
62.图13sem显微图片(a)空白凝胶；(b)载药凝胶。
63.图14凝胶的外观和相转变过程(a)空白凝胶；(b)der/ptxl@gel。
64.图15der/ptxl@gel载药凝胶的温度依赖性流变行为。
65.图16空白凝胶和载药凝胶处理h157细胞24h后的增殖抑制率结果。
66.图17显微镜下h157多细胞3d瘤球的图片。
67.图18凝胶在h1573d微瘤球内的浸润深度。
68.图19dermaseptin-pp-s-s-dope的合成路线图。
69.图20(a)dope-pdp；(b)der-s-s-dope的质谱图。
70.图21(a)pl和(b)der-s-s-pl的粒径分布图。
71.图22(a)pl和(b)der-s-s-pl的透射电镜图。
72.图23der-s-s-pl在4℃和室温下的存放稳定性。
73.图24der-s-s-pl在48h内的血清稳定性。
74.图25der-s-s-pl在24h内的累计释放曲线。
75.图26pl和der-s-s-pl对家兔红细胞的溶血率结果。
76.图27der-s-s-dope材料在含或不含gsh的培养基中的细胞增殖抑制率结果。
77.图28lip和der-s-s-l在(a)正常培养基或(b)外加10mm gsh的培养基中对h157 细胞的增殖抑制率结果。
78.图29pl和der-s-s-pl在(a)正常培养基或(b)外加10mm gsh的培养基中对 h157细胞的增殖抑制率结果。
79.图30激光共聚焦考察h157细胞在含或不含gsh的培养基中对der-s-s-irl和irl 的定性摄取情况。
80.图31流式细胞仪分析h157细胞在含或不含gsh的培养基中与制剂共孵育(a)2h 或(b)4h后的定量摄取情况。
具体实施方式
81.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
82.以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
83.在一个实施例中，一种新型抗菌肽dermaseptin-pp的研究方法，步骤如下：
84.步骤一：dermaseptin-pp的分离鉴定，采用电刺激法(5v,50hz,4ms)获取
phyllomedusa palliata青蛙的皮肤分泌物，冷冻干燥，采用mrna direct
tm
试剂盒 (biotech，uk)提取皮肤分泌物冻干粉中的poly-a mrna，根据bd smart
tm
race cdna amplification kit试剂盒的操作说明，将提取的mrna逆转录合成第一链cdna，然后对cdna进行3'-race pcr进行扩增，获得全长的pre-pro-dermaseptin-pp基因，接着，通过琼脂糖凝胶电泳分析race pcr产物，并采用cycle pure kit试剂盒(omega bio-tek,usa)对pcr产物进行纯化，接着将目的基因与-t easy vector表达载体连接重组，导入jm109高效感受态大肠杆菌中进行扩增，通过蓝白筛选挑选阳性转化子，采用pcr扩增目的基因，进行测序，将碱基序列翻译为氨基酸序列；
85.步骤二：dermaseptin-pp的体内外抗肿瘤活性及机制研究，研究发现阳离子抗菌肽dermaseptin-pp具有广谱且高效的体外抗肿瘤活性，其中对h157细胞作用最强，证实其主要作用机制为破坏肿瘤细胞膜和诱导肿瘤细胞凋亡，dermaseptin-pp独特的细胞膜作用机制不易诱导肿瘤细胞产生耐药性，具有较大的抗肿瘤发展潜力，首先采用mtt实验考察了dermaseptin-pp对h157，mcf-7，pc-3和u251mg的细胞毒性，发现dermaseptin-pp 能显著抑制四种细胞的增殖，且具有浓度依赖性，表现出了广谱抗肿瘤活性；
86.步骤三：dermaseptin-pp和化疗药物协同抗肺癌活性及其细胞膜活性机制研究，以h157 和a549两种肺癌细胞为模型，考察四种广谱化疗药物(ptx/dtx/ddp/dox)单用和与低浓度dermaseptin-pp联用的细胞毒性，mtt实验结果表明：与低浓度dermaseptin-pp 联用后，四种化疗药对两种细胞的增殖抑制率均有显著提高，ic
50
值均显著降低，药物联用指数ci值提示dermaseptin-pp与四种化疗药均为协同效果。
87.进一步的，所述dermaseptin-pp的体内外抗肿瘤活性及机制研究包括如下步骤：
88.步骤一：细胞复苏及培养，从液氮罐中取出冻存的细胞，在37℃恒温水浴锅中快速升温融化，然后于离心机中离心(8000rpm
×
3min)，喷洒酒精后，于安全柜内弃去上清液，加入1ml完全培养基(含10％fbs和1％双抗)，混悬细胞，然后将细胞悬液转移至中号培养皿内，补加9ml完全培养基，混合均匀后，放入5％co2，37℃细胞培养箱内培养；
89.步骤二：mtt细胞毒性实验，mtt细胞毒性实验包括细胞接种及给药以及呈色及比色两个程序，呈色及比色是将给药24h的细胞从培养箱中取出，每孔加入mtt溶液(5 mg/ml)10μl，避光培养4h，将含有mtt的培养基轻轻吸出弃掉，加入dmso溶液100 μl，水平摇床上振荡10min，充分溶解紫色结晶；
90.在酶标仪490nm波长下测定各孔吸光度值(optical density，od)，记录实验结果，药物对细胞抑制率计算公式如下：
[0091][0092]
步骤三：ldh释放实验，ldh释放实验包括细胞接种及给药以及酶标仪检测两个程序，酶标仪检测通过取各组上清液50μl于新的96孔盘中，每个浓度设置5个复孔，加入 50μl反应液，室温反应30min，最后加入50μl反应终止液，除气泡；
[0093]
在酶标仪490nm波长下测定各孔的od值，记录实验结果，乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，ldh)释放率计算公式如下：
[0094]
ldh释放率(％)＝(od
实验组-od
对照组
)/(od
阳性组-od
对照组
)
×
100
ꢀꢀ
(公式2)
[0095]
步骤四：激光共聚焦显微镜观察dermaseptin-pp对h157细胞膜的影响；
[0096]
步骤五：dermaseptin-pp肽对h157细胞凋亡的影响，dermaseptin-pp肽对h157细胞凋亡的影响包括细胞接种及给药以及式细胞仪检测h157细胞凋亡率两个程序；
[0097]
步骤六：统计学分析，每个实验均重复三次，以graphpad prism 6.0软件进行统计学分析，数据以平均值(mean)
±
标准差(sd)表示，组间两两比较采用t检验(two-tailed student’s tests)，多组间差异比较采用anova方差分析，p《0.05表示差异有统计学意义；
[0098]
步骤七：得出研究结果，研究结果包括dermaseptin-pp的体外抗肿瘤活性、ldh释放评价dermaseptin-pp对h157细胞膜完整性影响、激光共聚焦显微镜观察dermaseptin-pp 对h157细胞膜破坏作用以及dermaseptin-pp诱导h157细胞凋亡。
[0099]
进一步的，所述激光共聚焦显微镜观察dermaseptin-pp对h157细胞膜的影响包括：
[0100]
酶标仪检测，将处于对数生长期的h157肿瘤细胞用0.25％胰蛋白酶-0.02％edta消化液消化下来，用培养基混悬得单细胞悬液后，利用血球计数板对细胞进行计数，按照细胞密度1
×
105个/ml，将细胞接种于共聚焦培养皿中，每皿2ml，置于5％co2，37℃细胞培养箱中过夜培养至细胞单层覆盖率80％；
[0101]
分组及给药，同浓度dermaseptin-pp(浓度范围为10-9-10-4
m)处理h157细胞24h 以及高浓度dermaseptin-pp(浓度为10-4
m)处理h157细胞不同时间(30min，1h，2h， 4h，8h，16h和24h)后对h157细胞膜的破坏情况，实验分为dermaseptin-pp给药组和空白组，将细胞从培养箱中取出，弃去原培养基，空白组加入1ml新鲜培养基，其他皿细胞加入1ml含不同浓度dermaseptin-pp的培养基(浓度范围为10-9-10-4
m)，继续于培养箱中孵育一定时间；
[0102]
染色，对细胞膜和细胞核进行染色后，利用激光共聚焦成像系统观察给药后的h157 细胞形态，直观的观察dermaseptin-pp肽对肿瘤细胞细胞膜的影响，取出给药结束的共聚焦培养皿，弃去含药培养基，pbs
×
1ml冲洗2次，加入100μl dil染液(1︰50稀释)， 37℃孵育20min，弃去dil染液，pbs
×
1ml冲洗2次，加入4％多聚甲醛500μl，4℃固定20min。pbs
×
1ml冲洗2次，加入100μl dapi工作液(1︰100稀释)，室温染色 10min，pbs
×
1ml冲洗2次，将细胞保存在1ml hanks平衡盐溶液(hanks balanced saltsolution,hbss)中，使用激光共聚焦显微镜观察染色后细胞膜与细胞核，进行拍照记录， dil染色液可将细胞膜染成红色，dapi染色液可将细胞核染成蓝色。
[0103]
进一步的，所述dermaseptin-pp和化疗药物协同抗肺癌活性及其细胞膜活性机制研究包括如下步骤：
[0104]
步骤一：溶血实验；
[0105]
步骤二：荷h157肺癌皮下瘤裸鼠模型的建立；
[0106]
步骤三：dermaseptin-pp肽抗肺癌体内药效评价；
[0107]
步骤四：细胞凋亡通路分析及生物安全性评价；以及
[0108]
步骤五：得出研究结果。
[0109]
进一步的，所述溶血实验包括：
[0110]
红细胞的制备，家兔腹主动脉取血于肝素抗凝管中，取2ml血于50ml离心管中，置于离心机离心(930g
×
5min)，弃上清，用pbs清洗红细胞至上清无明显粉红色，最后加50ml pbs混匀红细胞；
[0111]
分组及样品制备，实验分为：阴性对照组，阳性对照组和dermaseptin-pp给药组。
将 dermaseptin-pp用pbs溶液(ph 7.4)稀释成320，160，80，40，20，10，4，2，0.2μg/ml 的溶液；
[0112]
加样，取不同浓度样品100μl于1.5ml离心管中，加入2.1.1中制备好的红细胞悬液 100μl；阴性对照组为生理盐水100μl加入100μl红细胞悬，阳性对照组为2％的triton x-100，每个浓度设置3个重复，样品置于37℃孵育2h，900
×
g离心3min，取100μl 上清液于新的96孔盘中，除去气泡，在酶标仪450nm波长下测定各孔吸光度值，记录实验结果，溶血率计算公式如下：
[0113]
溶血率(％)＝(od
给药组-od
阴性组
)/(od
阳性组-od
阴性组
)
×
100
ꢀꢀ
(公式3)。
[0114]
进一步的，所述荷h157肺癌皮下瘤裸鼠模型的建立包括：
[0115]
实验动物饲养，spf级balb/c雄性裸鼠，放置于25℃，12h光暗交替的环境中饲养，由专门饲养员提供食物和水，实验小鼠可以自主觅食与饮水；
[0116]
荷瘤动物模型建立，将生长状态良好的h157细胞培养到对数生长期，用0.25％胰蛋白酶-0.02％edta消化液消化完全，利用血球计数板对细胞进行计数，用pbs缓冲液洗涤细胞2次并重悬细胞使成为细胞密度为1
×
108个/ml的细胞悬液，balb/c-裸鼠(18g-20g)，通过腋下皮下接种h157细胞悬液，接种量为100μl/只，(含有1
×
107个细胞)，接种 h157细胞的小鼠继续培养14天后备用(平均肿瘤体积约为200-250mm3)。
[0117]
进一步的，所述dermaseptin-pp肽抗肺癌体内药效评价包括：
[0118]
分组及给药，将荷瘤小鼠随机分成5组，每组5只：包括低、中、高浓度dermaseptin-pp 肽组，模型组和阳性对照组，同时，设置空白对照组，即为正常无瘤小鼠，低、中、高浓度dermaseptin-pp肽组(浓度为4，6，8mm)，连续10天瘤内注射20μl含有相应浓度肽的pbs溶液；模型组小鼠连续10天瘤内注射20μl无菌pbs；阳性对照组为临床常用抗肺癌化疗药物顺铂(ddp)，连续5天腹腔注射200μl浓度为0.7mm的ddp溶液，全部结束给药后正常喂养至第10天；空白对照组不做处理；
[0119]
体重与瘤体积，自第一天给药起，每两天记录一次各组小鼠的体重和肿瘤体积，通过数字游标卡尺测量肿瘤的长度(l)和宽度(w)，根据下式计算肿瘤体积：
[0120]
肿瘤体积(mm3)＝(l
×
w2)/2
ꢀꢀ
(公式4)；
[0121]
抑瘤率及脾脏指数，末次给药的24h后，即第11天，解剖各组小鼠，剥离出皮下肿瘤组织，并解剖出肝和肺，脾，用生理盐水洗涤器官直至器官表面没有浮血，用滤纸吸干各器官多余的水分，然后于天平上记录各组肿瘤和脾脏重量，同时拍照记录，结束后肝，肿瘤和脾脏转移至4％多聚甲醛中固定，肺则先浸泡于pbs中直至漂浮到液面上，然后转移至4％多聚甲醛中固定过夜，根据以下公式计算肿瘤抑制率(tumor inhibition rate,tir) 及脾脏指数：
[0122]
抑瘤率(tir)＝(1-给药组瘤重/pbs组平均瘤重)
×
100％
ꢀꢀ
(公式5)
[0123]
脾脏指数＝脾脏质量/体重量
ꢀꢀ
(公式6)。
[0124]
进一步的，所述细胞凋亡通路分析及生物安全性评价采用he染色分析各器官的病理情况及肿瘤转移情况，评价dermaseptin-pp肽的生物安全性，采用tunel染色和免疫组化染色综合分析dermaseptin-pp作用后肿瘤组织中凋亡相关蛋白的表达情况，分析 dermaseptin-pp肽的作用机制。
[0125]
在本实施例中，本项目从南美树蛙(phyllomedusa palliata)的皮肤分泌物中首
次发现并鉴定出的一条可归类于dermaseptin家族的阳离子抗菌肽dermaseptin-pp。经研究，我们发现了dermaseptin-pp的广谱抗肿瘤活性和破膜机制，揭示了dermaseptin-pp作为新型抗肿瘤药物的潜力。在dermaseptin-pp与常用化疗药的协同抗肺癌作用研究中发现， dermaseptin-pp对肺癌表现出显著的抑制作用。
[0126]
其中，dermaseptin-pp对紫杉醇药物抗肺癌活性的提升作用最显著，低浓度 dermaseptin-pp与紫杉醇在h157和a549两种肺癌细胞上均表现出强协同抗肺癌活性。为避免dermaseptin-pp肽的体循环溶血毒性，首先采用瘤内原位给药的方式初步评价 dermaseptin-pp和紫杉醇联用的体内抗肺癌药效。然而，瘤内注射的给药方式仅适用于皮肤癌，乳腺癌和黑色素瘤等浅表性肿瘤。对于肺癌，肝癌和胃癌等深部肿瘤，临床上则常采用全身性化疗的方式进行治疗，其中以静脉注射最为常用。因此，如何实现dermseptin-pp 肽与紫杉醇药物的静脉注射给药是推动两药联用抗肺癌治疗的关键点。然而， dermaseptin-pp的溶血毒性使其在静脉给药时存在一定的溶血风险，前期研究发现，在100 μm的较高浓度时，dermaseptin-pp的溶血率达90.43％。如何在避免dermseptin-pp溶血毒性的同时，最大程度上发挥其破膜活性，并将其与紫杉醇药物共同递送至肿瘤部位，是亟待解决的关键技术问题。纳米制剂在延长药物血液循环时间、改变药物的给药途径、提高药物靶向性，控制药物的释放等方面具有显著优势。其中，脂质体是较为常用的抗癌药物载体，具有制备方法简单，表面易于修饰，生物相容性好，可延长药物血液循环时间、可控制药物的释放等优点，并能通过肿瘤的高通透性和滞留效应(enhanced permeability andretention effect,epr)被动靶向至积肿瘤部位，在提高药效及降低毒性方面具有无可比拟的独特优势。目前，国内已上市了注射用紫杉醇脂质体、多柔比星脂质体和注射用两性霉素 b脂质体等数种脂质体。因此，本发明以脂质体为纳米载体对两药进行负载，将 dermaseptin-pp作为穿膜靶头，以二硫键连接在dope材料上(der-s-s-dope)， der-s-s-dope作为磷脂材料直接修饰在负载紫杉醇药物的脂质体表面，该体系通过静脉给药后，dermaseptin-pp无法以游离形式存在，可保证其在血液循环中的安全性，降低溶血风险。由于大部分实体瘤组织细胞外基质致密，肿瘤组织间质压力较高导致很多化疗纳米药物不能有效渗透到肿瘤组织深部核心区域，致使深部肿瘤组织的药物浓度较低从而影响抗肿瘤药效。本项目将利用dermaseptin-pp的强破膜作用以期解决上述问题。当紫杉醇脂质体被动靶向到达肿瘤部位后，在肿瘤部位gsh的作用下，der-s-s-dope材料中二硫键断开，游离形式dermaseptin-pp可发挥其破膜活性，从而增强紫杉醇脂质体的肿瘤渗透性，增加肿瘤内部药物浓度，从而提升紫杉醇脂质体的体内抗肿瘤活性。
[0127]
dermaseptin家族抗菌肽的主要抗肿瘤机制为破坏肿瘤细胞膜，由于其通常具有正电性及两亲性，可以选择性的与富含阴离子成分的肿瘤细胞膜通过静电作用而结合，进而插入细胞膜使产生孔洞，造成肿瘤细胞内容物的外泄，从而快速且高效地杀伤肿瘤细胞。此种独特的破膜机制作用迅速，且不易使肿瘤细胞产生耐药性，因此，dermaseptin家族抗菌肽作为新型抗肿瘤药物具有较好的应用前景。本项目从南美树蛙(phyllomedusa palliata)的皮肤分泌物中首次发现并鉴定出的一条可归类于dermaseptin家族的阳离子抗菌肽 dermaseptin-pp其具有正电性及两亲性，dermaseptin-pp与dermaseptin家族抗菌肽 dermaseptin-3的序列相似性高于90％。以下是dermaseptin-pp分离鉴定的相关内容。
[0128]
图1为dermaseptin-pp前体的开放阅读框序列及相应的氨基酸序列，成熟
dermaseptin-pp肽的序列为alwkdmlkgigklagkaalgavktlv-nh2。后续可采用多肽固相合成仪合成抗菌肽dermaseptin-pp，采用maldi-tof质谱验证其分子量，并采用高效液相进行纯化。
[0129]
图2为dermaseptin-pp的圆二色性谱图，结果表明在50％tfe-10mmol/lnh4ac溶液 (膜模拟疏水环境)中，208nm和222nm处有明显的双负峰，193nm处有一正峰，为典型的α-螺旋结构特征，计算得到的α-螺旋度为88％。然而，dermaseptinpp在10 mmol/lnh4ac溶液(模拟水环境)中几乎没有显示出α-螺旋结构的特征峰，表明 dermaseptin-pp在模拟细胞膜环境下可展现出两亲性α-螺旋结构，从而发挥破膜作用，表现出较强的抗菌和抗肿瘤作用。
[0130]
经研究，我们发现了dermaseptin-pp的广谱抗肿瘤活性和破膜机制。除了主要的破膜作用，抗菌肽诱导肿瘤细胞凋亡也被认为是其类发挥抗肿瘤活性的机制之一。研究发现阳离子抗菌肽dermaseptin-pp具有广谱且高效的体外抗肿瘤活性，其中对h157细胞作用最强，证实其主要作用机制为破坏肿瘤细胞膜和诱导肿瘤细胞凋亡。dermaseptin-pp独特的细胞膜作用机制不易诱导肿瘤细胞产生耐药性，具有较大的抗肿瘤发展潜力，以下将进一步说明dermaseptin-pp抗肿瘤活性及机制研究的相关内容。
[0131]
2、dermaseptin-pp的体内外抗肿瘤活性及机制研究
[0132]
其中，dermaseptin-pp对h157肺癌细胞的毒性最强，ic
50
仅为1.55μm。溶血实验发现dermaseptin-pp致家兔红细胞50％溶血时的浓度为43μμ，远大于其对各肿瘤细胞的ic
50
值，提示虽然dermaseptin-pp有一定溶血毒性，但仍具有较大的抗肿瘤治疗窗。接着，探究了dermaseptin-pp对h157细胞膜的破坏作用和诱导h157细胞凋亡的作用。ldh释放实验结合激光共聚焦观察发现：dermaseptin-pp可以浓度依赖性和时间依赖性地破坏h157 细胞膜。流式细胞仪分析细胞凋亡发现：dermaseptin-pp可以诱导h157细胞凋亡，且具有浓度依赖性。最后，考察了dermaseptin-pp瘤内给药后的抗肺癌药效并对离体瘤组织进行tunel和免疫组化染色分析其促凋亡通路。结果表明dermaseptin-pp具有剂量依赖性的体内抗肺癌药效，但高剂量组的抑瘤率仅为60.53％，仍不够理想。dermaseptin-pp是通过内源性线粒体和外源性死亡受体途径诱导细胞凋亡。实验内容如下：
[0133]
2.1细胞复苏及培养
[0134]
利用显微镜观察和确认细胞的生长状况，待细胞长满后可以对细胞进行传代或者冻存。h157和pc-3细胞培养于1640完全培养基，mcf-7和u251mg细胞培养于dmem 完全培养基，hmec-1细胞培养于mcdb-131完全培养基。
[0135]
2.2mtt细胞毒性实验
[0136]
2.2.1细胞接种及给药
[0137]
采用mtt细胞毒性实验考察不同浓度的dermaseptin-pp肽对h157，pc-3，mcf-7 和u251mg四种细胞的生长抑制作用。将处于对数生长期的肿瘤细胞用0.25％胰蛋白酶
ꢀ‑
0.02％edta消化液消化下来，用培养基混悬得单细胞悬液后，利用血球计数板对细胞进行计数。按照细胞密度5
×
103个/孔/100μl接种到96孔板中，同时为了避免水分蒸发影响细胞生长，在96孔板最外圈每孔加入100μl无菌pbs溶液(ph 7.4)，置于5％co2，37℃细胞培养箱中过夜培养至细胞单层覆盖率约80％。
[0138]
弃去原培养基，加入含药培养基。具体分为三组：生长对照组(加入新鲜完全培养基)、溶剂对照组(加入1％pbs)和系列浓度的dermaseptin-pp组(浓度范围为10-9-10-4
m)，
每孔给药体积为100μl，给药后继续在培养箱中孵育24h。
[0139]
2.2.2呈色及比色
[0140]
2.3ldh释放实验
[0141]
2.3.1细胞接种及给药
[0142]
将处于对数生长期的细胞用0.25％胰蛋白酶-0.02％edta消化液消化下来，用培养基混悬得单细胞悬液后，利用血球计数板对细胞进行计数。按照细胞密度5
×
103个/孔/100μl 接种到96孔板中，同时为了避免水分蒸发影响细胞生长，在96孔板最外圈每孔加入100μl 无菌pbs溶液(ph 7.4)，置于5％co2，37℃细胞培养箱中过夜培养至细胞单层覆盖率约80％。
[0143]
弃去原培养基，加入含药培养基。给药组为系列浓度dermaseptin-pp(浓度范围为 10-9-10-4
m)，阴性对照组为1％pbs，每孔给药体积为100μl，给药后继续在细胞培养箱中培养24h。阳性对照组则是在100μl培养基中加入10μl裂解液，并在培养箱中培养 30min以达到相对较多的ldh释放。
[0144]
2.3.2酶标仪检测
[0145]
2.4激光共聚焦显微镜观察dermaseptin-pp对h157细胞膜的影响
[0146]
2.4.1酶标仪检测
[0147]
2.4.2分组及给药
[0148]
2.4.3染色
[0149]
2.5dermaseptin-pp肽对h157细胞凋亡的影响
[0150]
2.5.1细胞接种及给药
[0151]
将处于对数生长期的h157细胞用0.25％胰蛋白酶-0.02％edta消化液消化下来，用培养基混悬得单细胞悬液后，利用血球计数板对细胞进行计数。调整细胞密度为1.5
×
105个 /ml，将细胞接种于6孔板中，每孔2ml，置于5％co2，37℃细胞培养箱中过夜培养至细胞单层覆盖率约80％。
[0152]
将细胞从培养箱中取出，弃去原培养基，空白组加入1ml新鲜培养基，给药组加入1 ml含不同浓度dermaseptin-pp的培养基(浓度范围为10-9-10-4
m)，每个浓度设置三个复孔，给药后继续在细胞培养箱中培养24h。
[0153]
2.5.2流式细胞仪检测h157细胞凋亡率
[0154]
将给药24h的细胞从培养箱中取出，根据annexin v-fitc/propidium iodide凋亡试剂盒的操作流程，收集培养基中死亡细胞，pbs洗细胞2次，然后加入500μl不含edta 的胰酶(0.25％)消化细胞，加入1ml完全培养基终止消化，将各组消化好的细胞与对应的死细胞合并于15ml离心管中，置于离心机中离心(1000rpm
×
5min)，弃上清液，加入1ml pbs洗涤一遍，离心，弃上清，加入200μl pbs重悬细胞。最后，依次加入5μl annexin
ⅴ‑
fitc，室温避光反应5min，再加入5μl pi，室温避光反应10min，于流式细胞仪进样检测，计算细胞凋亡率。
[0155]
2.6统计学分析
[0156]
每个实验均重复三次，以graphpad prism 6.0软件进行统计学分析，数据以平均值(mean)
±
标准差(sd)表示，组间两两比较采用t检验(two-tailed student’s tests)，多组间差异比较采用anova方差分析，p《0.05表示差异有统计学意义。
[0157]
2.7研究结果
[0158]
2.7.1dermaseptin-pp的体外抗肿瘤活性
[0159]
为了评价dermaseptin-pp在细胞水平的抗肿瘤活性，我们采用mtt实验以大浓度梯度初步考察了不同浓度dermaseptin-pp(10-9-10-4
m)对h157，mcf-7，pc-3和u251mg 细胞的增殖抑制作用。由图3a-d的细胞存活率结果可知，dermaseptin-pp具有广谱抗肿瘤活性，高浓度时(10-5-10-4
m)可显著抑制h157，mcf-7，u251mg和pc-3肿瘤细胞的增殖，相对应的ic
50
值分别为1.55、2.92、2.47和4.15μm。其中，dermaseptin-pp对 h157肺癌细胞的抑制作用最为明显，在10-6
m浓度下就已经有一定的细胞毒性，因此后续实验选取h157肺癌细胞作为细胞模型，进一步研究dermaseptin-pp肽的体内抗肺癌活性及相关机制。
[0160]
2.7.2ldh释放评价dermaseptin-pp对h157细胞膜完整性影响
[0161]
采用ldh释放实验检测dermaseptin-pp对正常hmec-1细胞和h157肺癌细胞膜完整性的影响。当细胞受损，细胞膜通透性增加时，ldh会被释放到培养基中。ldh释放结果表明，在hmec-1细胞中的ldh释放率较低，在10-4
m浓度dermaseptin-pp作用下仅有少于10％的ldh释放(图4a)。然而，在h157肺癌细胞中，经10-4
m浓度dermaseptin-pp 作用后，检测到约80％的ldh释放(图4b)。结果提示，相比于正常细胞，dermaseptin-pp 可选择性破坏肿瘤细胞膜完整性，原因可能是dermaseptin-pp带正电性，更容易与富有阴离子成分的肿瘤细胞膜产生作用。这种肿瘤选择性作用也从侧面表明了dermaseptin-pp的安全性。
[0162]
2.7.3激光共聚焦显微镜观察dermaseptin-pp对h157细胞膜破坏作用
[0163]
由于dermaseptin-pp为阳离子活性肽，推测它可以与肿瘤细胞膜的阴离子磷脂产生静电吸引，进而作用于细胞膜产生破膜效果。在本实验中，h157肺癌细胞膜被dil染成红色，细胞核被dapi染成蓝色，利用激光共聚焦显微镜观察经不同浓度dermaseptin-pp作用不同时间后h157的细胞形态变化。
[0164]
由图5a的结果显示，经低浓度(10-9-10-6
m)dermaseptin-pp作用24h后，h157细胞膜和细胞核完整无破损，从10-5
m浓度开始，dermaseptin-pp开始对h157细胞膜产生破坏效果，而10-4
m浓度的破坏作用更明显。
[0165]
此外，我们进一步观察了经高浓度dermaseptin-pp(10-4
m)作用不同时间对h157细胞膜的破坏作用(图5b)。实验发现，从作用到8h开始，h157细胞膜开始出现破损，且随着作用时间进一步增加，h157细胞膜的破损情况越来越严重。上述结果表明 dermaseptin-pp可以剂量依赖及时间依赖性的破坏h157肿瘤细胞膜。
[0166]
2.7.4dermaseptin-pp诱导h157细胞凋亡
[0167]
除了破坏肿瘤细胞膜外，阳离子活性肽的抗肿瘤机制还可能是诱导肿瘤细胞凋亡。本实验中，将h157细胞与不同浓度dermaseptin-pp(10
–
7-10
–4m)共同孵育24h后，用annexinv/pi凋亡试剂盒进行染色，用流式细胞仪检测细胞凋亡。图6a中的四个象限：q1(annexinv-/pi
+
)代表机械性死亡细胞，q2(annexin v
+
/pi
+
)代表晚期凋亡细胞，q3(annexin v-/pi-) 代表正常活细胞，q4(annexin v
+
/pi-)代表早期凋亡细胞。由图6b的细胞凋亡率可知，从5
×
10-6
m浓度开始，dermaseptin-pp就可以显著诱导h157细胞凋亡，浓度升高至10-4
m 浓度时，dermaseptin-pp诱导h157细胞的凋亡率可达90％，说明dermaseptin-pp可以浓度依赖性地诱导h157细胞凋亡。
[0168]
虽然dermaseptin-pp单独抗肺癌的药效有限，但其独特的破膜作用及促凋亡作用提示了它具有成为化疗辅助用药的潜力。基于此，本项目展开对于dermaseptin-pp和化疗
药物协同抗肺癌活性及其细胞膜活性机制的研究。
[0169]
3.dermaseptin-pp和化疗药物协同抗肺癌活性及其细胞膜活性机制研究
[0170]
其中，dermaseptin-pp与紫杉醇的协同效果最强，说明dermaseptin-pp与紫杉醇具有协同抗肺癌的应用潜力。之前研究中已证实dermaseptin-pp可以破坏h157细胞膜，因此我们推测：dermaseptin-pp通过破坏细胞膜，提高紫杉醇的入胞药量，从而实现两药的协同药效。
[0171]
为此，我们进一步以a549细胞为模型，采用ldh释放和pi摄取实验并结合扫描电镜综合考察dermaseptin-pp对肿瘤细胞膜完整性的影响。结果表明：低浓度dermaseptin-pp 即可以提高a549细胞膜的通透性，高浓度dermaseptin-pp则使细胞膜出现孔洞。综上， dermaseptin-pp的破膜作用能够显著提高化疗药物抗肿瘤活性，提示其作为化疗辅助药物具有广阔的应用前景。其实验内容如下：
[0172]
3.1溶血实验
[0173]
3.1.1红细胞的制备
[0174]
3.1.2分组及样品制备
[0175]
3.1.3加样
[0176]
3.2荷h157肺癌皮下瘤裸鼠模型的建立
[0177]
3.2.1实验动物饲养
[0178]
3.2.2荷瘤动物模型建立
[0179]
3.3dermaseptin-pp肽抗肺癌体内药效评价
[0180]
3.3.1分组及给药
[0181]
3.3.2体重与瘤体积
[0182]
3.3.3抑瘤率及脾脏指数
[0183]
3.4细胞凋亡通路分析及生物安全性评价
[0184]
将多聚甲醛固定后的组织用蒸馏水洗涤干净后，依次经过80％乙醇、95％乙醇、无水乙醇及二甲苯进行脱水处理。接着，将脱水后的组织放入蜡杯浸蜡包埋。组织经充分包埋、冷却后切片。tunel染色：将石蜡切片，进行修复和破膜后取tunel试剂盒内适量试剂 1(tdt)和试剂2(dutp)按1︰9混合，进行染色，再用dapi复染细胞核切片于荧光显微镜下观察并采集图像。he染色：将切片置于90℃烘箱内烘0.5h脱蜡，分别经二甲苯及酒精洗脱蜡液，最后在蒸馏水中浸泡洗涤。脱蜡并洗涤后的切片经过he试剂盒染色后，在荧光显微镜下观察各组织病理情况及肿瘤转移情况。使用显微镜玻片扫描仪 (pannoramic midi,3dhistech)进行扫描，并用caseviewer软件进行分析，荧光结果使用image j进行定量统计。此外，通过免疫组化染色法检测多种凋亡蛋白的表达：石蜡切片脱蜡至水，抗原修复，肿瘤切片放入3％的双氧水溶液中阻断内源性过氧化物酶，血清封闭后，依次加入相应一抗和二抗染色，冲洗后进行dba显色，而后复染，封片。蛋白表达量半定量分析使用image j进行半定量分析，数值以平均光密度表示。
[0185]
3.5研究结果
[0186]
3.5.1dermaseptin-pp的溶血性
[0187]
采用哺乳动物家兔的红细胞评价dermaseptin-pp的溶血毒性。将不同浓度 dermaseptin-pp与红细胞共孵育后产生的溶血率结果如图7所示，随dermaseptin-pp浓度
的升高，产生的溶血率随之增大，当红细胞发生50％溶血时，dermaseptin-pp的浓度为43 μμ，远大于dermaseptin-pp对各肿瘤细胞的ic
50
值，这说明dermaseptin-pp虽然具有一定的溶血副作用，但其作为抗肿瘤应用时仍然具有较大的治疗窗。
[0188]
3.5.2dermaseptin-pp的体内抗h157肺癌活性
[0189]
为了评价dermaseptin-pp的体内抗肿瘤活性，建立了小鼠皮下肺癌模型。采取瘤内给药的方式，给予不同浓度dermasepti-pp的溶液，连续给药10天后的药效结果见下图。由图8a可见，在10天的给药周期中，相比于pbs组肿瘤的不断变大，低中浓度的 dermaseptin-pp组(4mm和6mm)以及阳性对照顺铂组小鼠肿瘤的生长被明显抑制。而高浓度dermaseptin-pp组(8mm)小鼠肿瘤则是几乎停止生长。从图8b-d也可看出，经 6mm和8mm的dermaseptin-pp治疗后，肿瘤甚至明显小于顺铂组，肿瘤抑制率达到 60.53％和46.57％，表明dermaseptin-pp具有较强的剂量依赖性的体内抗肿瘤活性。
[0190]
3.5.3dermaseptin-pp诱导h157肿瘤细胞凋亡及通路分析
[0191]
应用tunel染色技术对肿瘤组织切片进行染色检测dermaseptin-pp的凋亡诱导作用。核内可见黄绿色染色的细胞为凋亡细胞，正常细胞核则被dapi染为蓝色(图9a)。显微镜玻片扫描仪扫描染色后的肿瘤切片并用image j软件分析细胞凋亡阳性率。结果表明 (图9b)，与pbs模型组相比，经4mm、6mm、8mm剂量的dermaseptin和0.7mm 剂量的阳性药顺铂处理后，h157细胞凋亡率均显著增加，凋亡阳性率分别为21.21％、 25.64％、71.65％和28.83％。
[0192]
采用免疫组化法进一步探究dermaseptin-pp的诱导凋亡途径，分析了凋亡调控蛋白(apaf-1，caspase-9，caspase-3，cytochrome c，fas，fasl和fadd)的表达。图9j为免疫组化染色结果，黄色为凋亡阳性细胞。使用image j对免疫组化结果进行半定量分析 (图9c-i)，结果表明dermaseptinpp浓度依赖性地增加了线粒体通路中促凋亡蛋白 cytochrome c，apaf-1，caspase-9和caspase-3的表达，同时也增加了死亡受体凋亡通路中促凋亡蛋白fas，fasl和fadd的表达，说明dermaseptin-pp可以通过内源性线粒体通路及外源性死亡受体通路诱导h157细胞凋亡。
[0193]
3.5.4dermaseptin-pp对小鼠脾脏指数的影响
[0194]
脾是很重要中枢免疫器官、脾脏大小可以反应机体免疫水平的高低。脾指数的结果如图10所示，dermaseptin-pp治疗组小鼠脾脏指数与空白组小鼠相似，而顺铂组小鼠脾脏指数最低，反映出化疗药物对免疫系统的副作用，也说明dermaseptin-pp一定程度上可以保护或恢复机体免疫系统功能。其中，模型组小鼠脾脏指数是最高的，可能是由于病理性的代偿性增大。
[0195]
3.5.5dermaseptin-pp的生物安全性评价
[0196]
如图11a所示，各组小鼠的体重变化曲线表明dermaseptin-pp给药组小鼠体重有缓慢上升趋势，与空白无瘤组小鼠体重变化一致。然而阳性药顺铂治疗组小鼠体重严重下降，状态较差。此外，he染色结果表明，如图11b所示，pbs对照组肿瘤细胞排列紧密，胞核大，异型性明显，组织局部片状坏死，坏死肿瘤细胞胞核固缩深染，坏死灶周围大量中性粒细胞浸润。而经dermaseptin-pp治疗后，肿瘤组织中细胞排列相对疏松，细胞异型性和病理有丝分裂情况均有所减轻。同时，各治疗组的肺、肾组织切片中只观察到少量中性粒细胞的存在，无明显的肿瘤转移或其他异常。以上结果说明，阳性药具有一定系统副作用，但在给药
剂量下，dermaseptin-pp无明显的毒性，生物安全性良好。
[0197]
本项目首次证实了dermaseptin-pp肽作为新型抗肿瘤药物的可行性，明确了 dermaseptin-pp的破膜作用机制，并且验证了dermaseptin-pp介导的破膜作用使其具备成为新型化疗辅助用药的潜力，这为化疗药物的增效减毒提供了新思路。
[0198]
实施例1.dermaseptin-pp-紫杉醇脂质体温敏凝胶的制备
[0199]
1.1紫杉醇脂质体(ptxl)的制备及表征
[0200]
1.1.1紫杉醇脂质体(ptxl)的制备
[0201]
将处方量的spc、cho、dspe-mpeg
2000
(65︰25︰10，mol︰mol︰mol)及药物紫杉醇分别溶于二氯甲烷中，置100ml茄形瓶中，在37℃条件下减压旋转蒸发除去有机溶剂，直至形成脂质膜。加入1ml pbs缓冲液(ph 7.4)，涡旋水化，使脂质膜从瓶壁上完全脱落，探头超声5min(功率200w，工作时间5s，间歇时间5s，保护温度25℃)以形成均匀脂质体，即得紫杉醇脂质体(ptxl)。
[0202]
1.1.2ptxl的粒径和zeta电势测定
[0203]
用去离子水将ptxl稀释一定倍数后，各取1ml用激光粒度分析仪测定粒径及pdi 值。另各取1ml用激光粒度分析仪测定zeta电势值。
[0204]
1.1.3高效液相色谱法测定ptxl的包封率
[0205]
因紫杉醇难溶于水，故可采用低速离心法分离载药脂质体与未载入的游离紫杉醇药物，对紫杉醇包封率进行测定。取ptxl于离心管中，3000rpm离心10min，因游离ptx 不溶于水会沉淀，取上清100μl加入900μl甲醇，超声5min使脂质体完全破裂，采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,hplc)检测确定脂质体中ptx 的量。取离心前的ptxl溶液100μl置于离心管中，以5000rpm的转速离心5min，加入900μl甲醇，超声5min，进hplc进行检测确定体系中ptx的总量。
[0206]
色谱条件：色谱柱为inertsilr ods-3色谱柱(250
×
4.6mm,5μm)；柱温40℃；流动相为乙腈-水(60︰40,v︰v)；流速为1.0ml/min；进样量20μl；紫外检测波长为227 nm。包封率和载药量的计算公式如下：
[0207][0208][0209]
1.2dermaseptin-pp-紫杉醇脂质体温敏凝胶(der/ptxl@gel)的制备
[0210]
根据之前dermaseptin-pp与ptx联用的细胞实验结果，0.2μg/ml的dermaseptin-pp 与ptx联用时，对1μg/ml浓度ptx的细胞毒提升作用最佳。因此，采用ptx和 dermaseptin-pp的比例为5︰1制备载药温敏凝胶。以20％的泊洛沙姆407(f127)为凝胶材料，称取处方量的泊洛沙姆407和dermaseptin-pp粉末置于10ml西林瓶中，加入2.1 中制备得到的紫杉醇脂质体ptxl溶液，于冰浴条件下磁力搅拌使充分溶解即得 dermaseptin-pp-紫杉醇脂质体温敏凝胶(der/ptxl@gel)
[0211]
1.3der/ptxl@gel的扫描电镜观察
[0212]
将空白凝胶和载药凝胶(der/ptxl@gel)进行冻干，将样品粉末置于样品台的导电胶上，进行喷金，通过扫描电镜进行观察。
[0213]
1.4der/ptxl@gel的温度敏感性考察
[0214]
采用试管倒置法观察凝胶的相转变过程。具体操作如下：将der/ptxl@gel置于西林瓶中，浸入水浴中加热，起始温度较低，而后温度每升高1℃，保持2min，而后将西林瓶取出倒置180
°
，30s内不发生流动，视为凝胶，该温度为溶胶-凝胶转变温度(tgel)。将制备所得空白凝胶、载药凝胶(der/ptxl@gel)在不同温度下的状态进行拍照记录。
[0215]
1.5der/ptxl@gel的流变学性质考察
[0216]
采用流变仪，对载药凝胶der/ptxl@gel进行模量测试，将样品置于直径为40mm、间隙为1mm的平板之间，以2℃/分钟的速率进行加热，加热温度范围为15-45℃。测定储能模量g
′
和损耗模量g
″
随温度的变化关系，测试条件为频率1hz，应变1％，g
′
与g
″
曲线的交点温度即为凝胶的溶胶－凝胶转变温度。
[0217]
1.6cck-8细胞毒性实验
[0218]
采用cck-8细胞毒性实验考察载药凝胶体外抗h157肺癌细胞的活性。将h157细胞以每孔6
×
103个/100μl接种在96孔板中，孵育过夜，于5％co2，37℃细胞培养箱中培养过夜。然后将细胞与不同浓度的游离ptxl@gel，der/ptxl@gel和空白凝胶共同孵育 24h。弃去原培养液，每孔加入100μl含10％(v/v)cck-8的无血清培养基，避光孵育1 h后，使用酶标仪450nm波长下测定吸光度，每个浓度设置6个复孔。药物对细胞的抑制率按照以下公式计算：
[0219][0220]
1.7体外3d瘤球模型考察载药凝胶的肿瘤渗透性
[0221]
1.7.1载ir780染料的凝胶制备
[0222]
为便于观察，以ir780替代ptx药物，按照第四章2.2的同法制备载ir780染料的温敏凝胶，包括ir780脂质体凝胶(irl@gel)，dermaseptin-pp-ir780脂质体凝胶 (der/irl@gel)，考察der是否能够发挥破膜作用，提高肿瘤内部的荧光渗透。
[0223]
1.7.2h157多细胞肿瘤球的制备
[0224]
采用文献报道的液体覆盖法，用于培养h157多细胞肿瘤球(multicellular tumorspheroids,mcts)。首先称取0.5g琼脂糖，加入25ml去离子水，微波炉加热3min使琼脂糖完全溶解，得到浓度为2％的琼脂糖水溶液。然后趁热移取200μl滴加到24孔板底部，冷却后照紫外灭菌备用。取对数生长期的h157细胞，以2
×
103个/ml/孔的密度接种到上述2％琼脂糖包覆的24孔板中，持续培养5-7天，至细胞相互吸附成球状时，可进行肿瘤球的分布实验。
[0225]
1.7.3凝胶的肿瘤渗透性考察
[0226]
实验分为irl@gel和der/irl@gel。将凝胶200μl(含ir78040μg)加入24孔板的 transwell小室内，将小室放入含有h157肿瘤球的孔上，下室加入500μl完全培养基，与肿瘤球在37℃下共孵育4h，随后弃去原培养液，pbs洗3次，收集肿瘤球，置于激光共聚焦小皿中，保存在组织固定液中，于激光共聚焦显微镜下观察不同深度的荧光渗透情况。
[0227]
1.8研究结果
[0228]
1.8.1ptxl的粒径和电位
[0229]
采用马尔文记录仪考察ptxl的粒径和电位，粒径见图12结果显示，ptxl的粒径为 (149.0
±
0.21)nm，pdi为0.207
±
0.006，电位为(-1.0
±
0.31)mv，表明该脂质体分散均匀稳定。
[0230]
1.8.2ptxl的包封率和载药量
[0231]
根据1.1.3高效液相色谱法测定ptxl的包封率中的液相条件建立了紫杉醇药物的液相标准曲线，ptx的标准曲线为y＝7885x+374939，r2＝0.9993。根据标准曲线可计算ptx的浓度，通过低速离心法测得ptxl脂质体对ptx的包封率为86.1％，载药量为19.4％，表明ptxl具有较高的包封率，利于后续负载入凝胶载体中。
[0232]
1.8.3der/ptxl@gel的外观和形貌
[0233]
通过扫描电镜观察对冷冻干燥后的空白凝胶和载药凝胶的形貌进行观察。图13a为空白凝胶载体，呈三维网络结构，结构较为松散，表面较为光滑。图13b为载药凝胶，载药后，凝胶的网状结构更致密，三维网络结构更明显，且凝胶表面可观察到明显的紫杉醇脂质体的存在，证明凝胶能够成功负载药物。
[0234]
1.8.4der/ptxl@gel的温度敏感性
[0235]
用试管倒置法对直观的观察凝胶的温敏特性。从图14中我们可以看到，载药后未改变凝胶的温敏特性，der/ptxl@gel与空白凝胶的相变温度一致。在低温下，凝胶呈流动状态，当温度升至27℃时，凝胶即变为不能流动的胶体状态。
[0236]
1.8.5der/ptxl@gel的流变学性质
[0237]
进一步采用流变测试更准确的评价载药凝胶的温敏特性。储能模量(g
′
)与损耗模量 (g
″
)是衡量凝胶形成动力学的两个比较重要的指标。g'反映样品固体状的流变学行为，当样品处于溶液状态时，g
′
值低于g
″
，凝胶未发生溶胶-凝胶的转变。g'值随着温度的升高而持续增大，当g
′
＝g
″
时，凝胶开始发生溶胶-凝胶相变，此时的温度即为相转变温度。 g
″
大于g
′
时，样品则呈凝胶状态，内部形成网络状结构。图15显示了der/ptxl@gel载药凝胶的g
′
与g
″
随温度的变化曲线，与试管倒置实验结果一致，der/ptxl@gel的g
′
与g
″
的交点温度约为27℃，表明der/ptxl@gel具有温度敏感性，可用于瘤内给药后在体温条件下形成凝胶，延长药物滞留时间。
[0238]
1.8.6der/ptxl@gel的细胞毒性考察
[0239]
考察了空白凝胶，ptxl@gel和der/ptxl@gel对h157肺癌细胞的体外细胞毒性。结果如图16所示，所有给药浓度下，空白凝胶对h157细胞的生长抑制率均小于15％，说明空白凝胶对细胞的生长无影响。der/ptxl@gel和ptxl@gel均表现出了浓度依赖性的抗肿瘤活性，且der/ptxl@gel组在各给药浓度下的细胞抑制率均大于ptxl@gel组。值得注意的是在ptx浓度较低时，der/ptxl@gel与ptxl@gel组细胞抑制率的差距更大，当ptx浓度为0.01μg/ml时，der/ptxl@gel组细胞抑制率比ptxl@gel组高了约20％。以上结果说明，空白凝胶无明显细胞毒性，载药凝胶的细胞毒性来自于负载的药物，加入 dermaseptin-pp后可以显著提高ptxl@gel的抗肿瘤活性，且紫杉醇给药浓度越低时，加入dermaseptin-pp的增效作用越明显。
[0240]
1.8.7凝胶在3d瘤球中的渗透性
[0241]
如图17所示，培养7天后，h157多细胞肿瘤球构建成功。我们采用与实体肿瘤微环境接近的3d多细胞肿瘤球模型考察载药凝胶的肿瘤内部渗透能力。结果如图18所示，irl@gel和der/irl@gel与肿瘤球共孵育4h后，相比于irl@gel，负载了dermaseptin-pp 的共载药凝胶der/irl@gel显示出更强的肿瘤内部渗透能力，红色荧光信号明显较强。在同样的浸润深度时，der/irl@gel组有明显的红色信号出现在肿瘤中心，说明 dermaseptin-pp能够促进药物向肿瘤内部渗透。
[0242]
虽然载药凝胶具有较好的抗肿瘤疗效，但其瘤内给药的治疗方式存在着一定的局限性。临床上多见深部肿瘤且易出现转移，可用于静脉注射的全身化疗制剂更具有临床应用价值。因此，为了推进dermaseptin-pp与紫杉醇联用的临床应用，同时拓展dermaseptin-pp 的应用形式。本部分通过制剂学设计，充分发挥dermaseptin-pp的破膜活性的同时，更好的实现两药联用的静脉注射给药，进行dermaseptin-pp修饰的还原响应型紫杉醇脂质体的制备,内容如下：
[0243]
实施例2dermaseptin-pp修饰的还原响应型紫杉醇脂质体的制备、表征及体外细胞评价
[0244]
2.1dermaseptin-pp-s-s-dope的制备及质谱验证
[0245]
dermaseptin-pp-s-s-dope(简写为der-s-s-dope)的具体合成路线见图19。具体步骤如下：称取110mg的二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)溶解于2ml三氯甲烷中，称取50 mg的spdp溶解于1ml甲醇三氯甲烷1︰1混合溶剂中，将上述两种溶液在搅拌状态下混合均匀，并滴加50μl的三乙胺tea，室温下反应过夜。之后点板，在层析缸中展开，碘蒸汽显色，检验是否有产物生成。接着，使用制备薄层板进行提纯，展开剂为二氯甲烷︰甲醇(7︰1)，刮取目标产物条带，置于砂芯漏斗中，用展开剂冲洗，得到含有产物的有机溶液，进一步旋蒸，除去有机溶剂，真空干燥，得白色油状物，-20℃保存。称取279 mg dope-pdp以及400mg末端带巯基的der肽，二者溶解于5ml甲醇中，室温下搅拌反应过夜。将反应液加入20倍体积的冰乙醚溶液中，4℃静置30min，4℃下，5000rpm 离心5min，弃去上层的有机溶剂，下层沉淀真空干燥，得白色固体，即为产物 dope-s-s-der，-20℃保存待用。
[0246]
2.2肽修饰还原响应型紫杉醇脂质体(der-s-s-pl)的制备
[0247]
将处方量的spc、cho、dspe-mpeg2000，der-s-s-dope(总磷脂︰胆固醇＝75︰ 25)分别溶于二氯甲烷中，置100ml茄形瓶中，在37℃条件下减压旋转蒸发除去有机溶剂，直至形成脂质膜，真空干燥器中过夜除去剩余有机溶剂。加入ddp(500μg/ml)溶液涡旋水化，使脂质膜从瓶壁上完全脱落，探头超声3min(功率80w，工作时间5s，间歇时间5s，保护温度25℃)，最后分别过0.4μm、0.2μm、0.1μm聚碳酸酯膜以形成均匀脂质体，即得der修饰的载ddp还原响应型脂质体(der-s-s-pl)。
[0248]
同法制备未用肽修饰的ptx脂质体(pl)，以及不载ptx的der修饰空白脂质体 (der-s-s-l)。
[0249]
2.3粒径与zeta电势
[0250]
用去离子水将der-s-s-pl和pl稀释一定倍数后，各取1ml用激光粒度分析仪测定粒径及pdi值。另各取1ml用激光粒度分析仪测定zeta电势值。
[0251]
2.4包封率和载药量
[0252]
采用1.1.3高效液相色谱法同法检测der-s-s-pl的包封率和载药量。
[0253]
2.5透射电镜观察der-s-s-pl的外观
[0254]
利用透射电镜(transmission electron microscope,tem)观察pl和der-s-s-pl的形貌。将脂质体用纯净水稀释后，分别在碳支持膜上滴加10μl样品，室温条件下孵育2.5min，然后用滤纸从一侧轻轻吸走多余的液体，自然风干，然后在碳支持膜上滴加10μl 3％磷钨酸(ph＝5)溶液，室温放置0.5min后用滤纸吸走多余的溶液，自然风干。最后碳支持膜放置在场发射透射电子显微镜下观察不同脂质体的形态。通过电镜图片观察制剂的粒径
大小。
[0255]
2.6der-s-s-pl的存放稳定性
[0256]
将der-s-s-pl分别于4℃和室温下储存，分别于0h、1h、2h、4h、8h、12h、24h、 36h、48h取出适量，按照第四章2.1.3项下方法，采用低速离心法去除游离ptx，hplc 法测定上清脂质体中的ptx浓度，记为cn(n为不同时间点)。按照以下公式计算不同时间点ptx的泄漏率并以时间为横坐标，泄漏率为纵坐标，绘制稳定性曲线：
[0257]
泄漏率(％)＝(1-cn/c0)
×
100
ꢀꢀ
(公式11)
[0258]
2.7der-s-s-pl的血清稳定性
[0259]
取der-s-s-pl 100μl于2ml离心管中，加入900μl 50％的fbs混匀，置于4℃条件下静置。于不同时间点：0h、2h、6h、12h、24h，48h测定粒径，每个时间点平行设置三份样品。
[0260]
2.8der-s-s-pl中药物的体外释放行为
[0261]
取der-s-s-pl 100μl与900μl的释放介质(ph 7.4的pbs缓冲溶液)混匀，然后分取100μl混合溶液置于1.5ml ep管中，置于水浴摇床上，100rpm，37℃下恒温振摇，分别于1h、2h、4h、8h、12h、24h时取出，4000rpm离心10min，弃上清，沉淀加100 μl色谱级甲醇溶解，每个时间点平行设置三份样品。按照第四章2.1.3中的hplp条件进行检测，分析载药脂质体的体外释药特性。
[0262]
2.9溶血实验
[0263]
2.9.1红细胞的制备
[0264]
家兔腹主动脉取血于肝素抗凝管中，取2ml血于50ml离心管中，置于离心机离心 (930
×
g离心5min)，弃上清，用pbs清洗红细胞至上清无明显粉红色，最后加50mlpbs混匀红细胞。
[0265]
2.9.2分组及样品制备
[0266]
实验分为：阴性对照组，阳性对照组，pl组和der-s-s-pl。样品用生理盐水稀释成 ptx浓度为2000，1000，500，250，125μg/ml的溶液。
[0267]
2.9.3加样
[0268]
取不同浓度样品100μl于1.5ml离心管中，加入2.9.1中制备好的红细胞悬液100μl；阴性对照组为生理盐水100μl加入100μl红细胞悬，阳性对照组为2％的triton x-100，每个浓度设置3个重复，样品置于37℃孵育2h，900
×
g离心3min，取100μl上清液于新的96孔盘中，除去气泡。在酶标仪450nm波长下测定各孔吸光度值(od)，记录实验结果，溶血率按照公式3进行计算。
[0269]
2.10cck-8细胞毒性实验
[0270]
在本部分实验中，采用正常1640完全培养基和含有10mm gsh的1640完全培养基 (模拟肿瘤微环境的还原条件)配制药物，考察2.1中合成的der-s-s-dope材料的还原响应性，并考察der-s-s-dope材料修饰的载药脂质体der-s-s-pl在正常细胞培养条件及模拟肿瘤还原条件时对h157细胞的细胞毒性。
[0271]
具体操作如下：按照细胞密度5
×
103个/孔/100μl接种到96孔板中，置于5％co2， 37℃细胞培养箱中过夜培养至细胞单层覆盖率约80％。而后，分别用两种培养基配药，实验分为阴性对照组，空白对照组(孔中无细胞)以及各组给药组。将细胞从培养箱中取出，弃去原培养基，阴性对照(有细胞)和空白对照组(无细胞)加入新鲜培养基，给药组加入含不同
浓度药物的培养基，每孔给药体积为100μl，放入细胞培养箱继续培养24h，每个浓度6个复孔，实验重复三次。
[0272]
将给药24h的细胞从培养箱中取出，弃去原培养液，每孔加入100μl新培养基(含 10％(v/v)cck-8)，在培养箱中避光孵育1h。在酶标仪450nm波长下测定各孔吸光度值，记录实验结果，并根据公式10计算各给药组对h157细胞的增殖抑制率：
[0273]
2.11激光共聚焦观察der-s-s-pl的细胞定性摄取
[0274]
采用激光共聚焦显微镜研究h157细胞在正常1640完全培养基和含有10mm gsh，的1640完全培养基中对der-s-s-pl的摄取能力。为了更好的进行观察，以ir780染料代替药物，按照2.2中der-s-s-pl的制备工艺制备了der修饰和无der修饰的载ir780的还原敏感型脂质体，der-s-s-irl和irl。
[0275]
具体实验步骤如下：将2
×
105个h157细胞接种在20mm的共聚焦培养皿中，每皿2 ml，置于5％co2，37℃细胞培养箱中过夜培养。实验分为der-s-s-irl，irl(无der 修饰)和游离ir780组。将细胞从培养箱中取出，弃去原培养基，加入1ml含der-s-s-irl 或irl的培养基(ir780浓度为2μg/ml)，在37℃培养箱中孵育2h后，弃去原培养基， pbs
×
1ml冲洗3次，加入4％多聚甲醛500μl，4℃固定20min。用dapi标记细胞核，染色10min，pbs
×
1ml冲洗3次，将细胞保存在1ml hbss缓冲液中，使用激光共聚焦显微镜观察并拍照记录。
[0276]
2.12流式细胞仪研究der-s-s-pl的细胞定量摄取
[0277]
采用流式细胞仪研究h157细胞在正常1640完全培养基和含有10mm gsh的1640 完全培养基中对der-s-s-pl的细胞定量摄取情况，为方便流式细胞仪测定，以香豆素-6 染料(coumarin 6,c6)代替药物，按照2.2中der-s-s-pl的制备工艺制备了der修饰和无 der修饰的载香豆素-6的还原敏感型脂质体，der-s-s-c6l和c6l。
[0278]
具体实验步骤如下：将h157细胞以3
×
105个/ml的密度接种在6孔板中，于5％co2， 37℃细胞培养箱中培养24h。实验分为der-s-s-c6l和c6l组。将h157细胞与各组(c6 的浓度为2μg/ml)在培养箱中孵育2h后，弃去培养液，用pbs(ph 7.4)洗涤2次，用 0.25％胰蛋白酶-0.02％edta消化液消化并收集细胞，1000rpm离心5min，将细胞重悬于 200μl pbs(ph 7.4)中，使用流式细胞仪分析荧光强度，每个样品记录10000个细胞。每个时间点设置三个复孔。
[0279]
2.13.研究结果
[0280]
2.13.1质谱验证der-s-s-dope成功合成
[0281]
采用两步合成反应制备der-s-s-dope。中间产物dope-pdp的质谱结果如图20a所示，负离子模式下，可见明显的[m-h]-的峰，证明dope-pdp被成功合成。终产物 der-s-s-dope的质谱结果见图20b，正离子模式下，可见明显的[m+2h]2+，[m+3h]3+ 和[m+4h]4+的峰，且杂峰较少，证明产物der-s-s-dope已成功合成且具有一定纯度。
[0282]
2.13.2der-s-s-pl的粒径和电位
[0283]
采用马尔文粒度仪测定了dermseptin-pp修饰前后脂质体的粒径和电位，如图21所示， pl的粒径为(121.6
±
0.64)nm，pdi为0.212
±
0.004，而der-s-s-pl的粒径为(134.8
ꢀ±
3.07)nm，pdi为0.248
±
0.012。与pl的粒径相比，der-s-s-pl的粒径略有增大，说明引入der-s-s-dope使脂质体的粒径增加，提示dermseptin-pp成功修饰于脂质体表面。 pl的zeta电位为(-6.0
±
0.57)mv，而der-s-s-pl的电位为(4.8
±
1.12)mv，提示 dermseptin-pp
修饰后脂质体的电位由负变为正，这可能是由于dermseptin-pp肽带有正电性，这也进一步说明dermseptin-p确实成功修饰于脂质体表面。
[0284]
2.13.3der-s-s-pl的包封率和载药量
[0285]
同1.1.3中高效液相法的液相条件，同样采用低速离心法测定der-s-s-pl对ptx的包封率，根据ptx的标准曲线(y＝37885x+374939，r2＝0.9993)可计算ptx浓度。本实验测得der-s-s-pl脂质体对ptx的包封率为93.5％，载药量为11.5％，相比于ptxl脂质体86.1％的包封率和19.4％的载药量，der-s-s-pl的包封率更高但载药量略低，原因可能是由于本部分脂质制备过程中ptx的投料量相对较低，且由于der-s-s-dope磷脂材料的加入，脂质体材料的整体质量变大，使得脂质体载体对药物的包封率增大但是计算得到的载药量变低。
[0286]
2.13.4der-s-s-pl的外观
[0287]
利用tem观察脂质体的形貌，如图22所示，pl和der-s-s-pl均为均匀类球形，表面平整光滑，分布较为均匀，磷钨酸染色后可观察到脂质体的膜结构和中心空腔，且tem 下观察到的粒径与粒度仪测得的一致。
[0288]
2.13.5der-s-s-pl的存放稳定性
[0289]
如图23所示，der-s-s-pl在室温(25℃)下储存48h的药物泄漏率约为18％，说明载药脂质体较为稳定。而在4℃条件下储存48h后，der-s-s-pl中ptx的泄漏率仅约13％。提示der-s-s-pl更适于在4℃条件下储存，储存时间48h内可以保持稳定。
[0290]
2.13.6der-s-s-pl的血清稳定性
[0291]
制剂的血清稳定性对其体内循环至关重要。在本研究中，使用fbs评估znps在生理条件下的稳定性。如图24所示，48h内，der-s-s-pl的粒径未发生明显变化，表明der-s-s-pl 在血清中可以稳定分散，未出现聚集沉淀现象。
[0292]
2.13.7der-s-s-pl的体外释放
[0293]
以ph 7.4的pbs缓冲溶液为释放介质，考察der-s-s-pl的体外释药特性。结果如图 25所示，0-8h，ptx的释放量随着释放时间延长而增加，8h后制剂的释放达到平台期，释放量随时间变化不明显，在48h时的ptx的累积释放量才为52％，说明der-s-s-pl具有一定缓释特性，保证了到达肿瘤部位前脂质体的稳定性。
[0294]
2.13.8der-s-s-pl的溶血性
[0295]
前期研究表明游离dermasetpin-pp具有较强的溶血毒性，因此，本部分中将制剂与红细胞悬液等体积混合共孵育2h以考察将dermasetpin-pp通过二硫键修饰于脂质体表面后制剂的溶血毒性。结果如图26所示，der-s-s-pl和pl的溶血毒性较低，两种脂质体母液浓度下(ptx浓度2000μg/ml)的溶血率分别仅为30.5％和18.7％，虽然der-s-s-pl组的溶血率略高于pl组，但仍处于较低的溶血率水平，这进一步证明了在生理条件下，dermasetpin-pp以二硫键修饰于脂质体材料上后其溶血性大大降低，这确保了制剂在体循环中的安全性，实现在肿瘤部分定点释药。
[0296]
2.13.9体外细胞毒性实验验证制剂的还原响应性
[0297]
2.13.9.1der-s-s-dope在不同还原条件下的细胞毒性结果
[0298]
采用cck-8细胞毒性实验考察中合成的der-s-s-dope材料在普通1640培养基和含有10mm gsh的1640培养基中对h157肺癌细胞的毒性差异，证明该材料的还原响应性。结果如图27所示，在正常培养基条件下给药，发现der-s-s-dope基本没有抗肿瘤活性，在40μg/
ml浓度下的细胞抑制率小于15％。相比于正常培养基条件，在含有10mm gsh 的培养基条件下给药时，der-s-s-dope在各个浓度下的细胞毒性均明显较高，在40μ g/ml的浓度下，对h157细胞的抑制率可达约48％。以上结果说明将dermaseptin-pp以二硫键连接在dope材料上时，dermaseptin-pp的活性被显著抑制，而在gsh条件下，二硫键断开，游离的dermaseptin-pp仍可以发挥抗肿瘤活性。
[0299]
2.13.9.2肽修饰的空白脂质体在不同还原条件下的细胞毒性
[0300]
采用cck-8细胞毒性实验进一步考察引入der-s-s-dope材料的肽修饰脂质体载体 (der-s-s-l，未包载药物ptx)和未用肽修饰的脂质体(称为lip)在普通1640培养基和含有10mm gsh的1640培养基中给药后对h157肺癌细胞的毒性差异，进一步证明肽修饰脂质体的还原响应性。在正常培养基条件下给药时(图28a)，lip在各浓度下对细胞的抑制率均小于20％，说明脂质体载体未产生细胞毒性，而der-s-s-l对细胞的抑制率与lip的结果接近，在实验最高浓度时对h157细胞的抑制率也仅为约33％，说明二硫键未断开时，dermasesptin-pp的活性大大降低，der-s-s-l对细胞的毒性基本等同于lip，这保证了制剂在体内循环时的安全性。反观在含有10mm gsh的培养基条件下给药时(28 b)，lip在各浓度下对细胞的抑制率仍均小于20％，但der-s-s-l的细胞毒性随浓度增加而明显增大，在实验最高浓度时对细胞的抑制率可达约76％，进一步说明der-s-s-dope 修饰在脂质体表面时，其二硫键仍可以在还原条件下断开后，游离dermaseptin-pp可以发挥活性。
[0301]
2.13.9.3der修饰的载药脂质体在不同还原条件下细胞毒
[0302]
最后采用cck-8细胞毒性实验考察引入der-s-s-dope材料的肽修饰紫杉醇脂质体 (der-s-s-pl)和未用肽修饰的紫杉醇脂质体(pl)在普通1640培养基和含有10mm gsh 的1640培养基中给药后对h157肺癌细胞的毒性差异。在正常培养基条件下给药时(图 29a)，der-s-s-pl和pl对h157细胞的抑制作用接近，对h157细胞的抑制率曲线基本重合，说明在正常培养基条件下，二硫键未断开，dermaseptin-pp的作用被屏蔽。而在gsh 还原条件下，如图27b所示，der-s-s-pl在各给药浓度下的细胞抑制率均明显大于pl，进一步说明制剂到达肿瘤部位后，二硫键在肿瘤还原条件下断开，游离dermaseptin-pp可以发挥其破膜活性，提高紫杉醇脂质体的抗肿瘤活性。
[0303]
2.13.10脂质体的细胞定性摄取
[0304]
激光共聚焦显微镜结果如图30所示，dapi用于细胞核染色，呈现蓝色，ir780显示红色。der-s-s-irl和irl与h157细胞共孵育2h后，即可在细胞内检测到明显的红色荧光。在正常1640培养基中，der-s-s-irl和irl组细胞中的红色荧光信号接近，而在含有 10mm gsh的培养基条件下，der-s-s-irl组细胞中的红色荧光信号明显强于irl组细胞，说明dermaseptin-pp修饰能够增加细胞对染料的摄取量，这可能是因为二硫键在gsh条件下断开后，游离的dermaseptin-pp能够提高细胞膜通透性或破坏细胞膜，使得进入细胞中的染料量增多。
[0305]
2.13.11脂质体的细胞定量摄取
[0306]
流式细胞仪显示的细胞定量摄取结果与激光共聚焦结果一致。der-s-s-c6l和c6l分别在正常培养基和10mm gsh条件下与h157细胞共孵育2h或4h。结果见图31，4h 时各组细胞内的荧光强度均相较于2h有所增强。但不论是共孵育2h还是4h，在正常培养基中，der-s-s-c6l和c6l组细胞中的荧光强度均基本相同，而在10mm gsh条件下， der-s-s-c6l组细胞
中的荧光强度显著大于c6l组。在10mm gsh条件下共孵育2h和4 h时，der-s-s-c6l组细胞中的荧光强度分别是c6l组的1.39倍和2.15倍。说明 dermaseptin-pp肽修饰在脂质体表面后，在还原条件响应下，游离下来的dermaseptin-pp 可以通过发挥其膜作用机制，从而大大增加了细胞对药物的摄取，这为药物在肿瘤部位的大量蓄积、提高紫杉醇脂质体疗效提供了可能。
[0307]
从以上结果可以看出，dermaseptin-pp修饰的脂质体der-s-s-pl静脉给药后能够深入到肿瘤更深部位。不论将游离dermaseptin-pp作为药物之一还是将dermaseptin-pp作为靶头修饰于制剂表面用于特定部位响应，dermaseptin-pp都可以通过其独特的破膜作用，提高紫杉醇药物的细胞摄取，提高药物在实体瘤内的渗透和蓄积，从而使抗肿瘤治疗效能最大化而副作用最小化。应用不同的制剂手段实现了dermaseptin-pp与紫杉醇联合抗肿瘤的应用，明确了dermaseptin-pp作为破膜靶头进行制剂学修饰的可能性，拓宽了 dermaseptin-pp辅助化疗药物抗肿瘤的新形式，同时也为阳离子抗菌肽类药物的抗肿瘤研究提供的新的方法和思路。
[0308]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。