技术特征：
dehydrogenase，ldh)释放率计算公式如下：ldh释放率(％)＝(od
实验组-od
对照组
)/(od
阳性组-od
对照组
)
×
100
ꢀꢀꢀ
(公式2)步骤四：激光共聚焦显微镜观察dermaseptin-pp对h157细胞膜的影响；步骤五：dermaseptin-pp肽对h157细胞凋亡的影响，dermaseptin-pp肽对h157细胞凋亡的影响包括细胞接种及给药以及式细胞仪检测h157细胞凋亡率两个程序；步骤六：统计学分析，每个实验均重复三次，以graphpad prism 6.0软件进行统计学分析，数据以平均值(mean)
±
标准差(sd)表示，组间两两比较采用t检验(two-tailed student’s tests)，多组间差异比较采用anova方差分析，p<0.05表示差异有统计学意义；步骤七：得出研究结果，研究结果包括dermaseptin-pp的体外抗肿瘤活性、ldh释放评价dermaseptin-pp对h157细胞膜完整性影响、激光共聚焦显微镜观察dermaseptin-pp对h157细胞膜破坏作用以及dermaseptin-pp诱导h157细胞凋亡。3.根据权利要求2所述的新型抗菌肽dermaseptin-pp的研究方法，其特征在于，所述激光共聚焦显微镜观察dermaseptin-pp对h157细胞膜的影响包括：酶标仪检测，将处于对数生长期的h157肿瘤细胞用0.25％胰蛋白酶-0.02％edta消化液消化下来，用培养基混悬得单细胞悬液后，利用血球计数板对细胞进行计数，按照细胞密度1
×
105个/ml，将细胞接种于共聚焦培养皿中，每皿2ml，置于5％co2，37℃细胞培养箱中过夜培养至细胞单层覆盖率80％；分组及给药，同浓度dermaseptin-pp(浓度范围为10-9-10-4
m)处理h157细胞24h以及高浓度dermaseptin-pp(浓度为10-4
m)处理h157细胞不同时间(30min，1h，2h，4h，8h，16h和24h)后对h157细胞膜的破坏情况，实验分为dermaseptin-pp给药组和空白组，将细胞从培养箱中取出，弃去原培养基，空白组加入1ml新鲜培养基，其他皿细胞加入1ml含不同浓度dermaseptin-pp的培养基(浓度范围为10-9-10-4
m)，继续于培养箱中孵育一定时间；染色，对细胞膜和细胞核进行染色后，利用激光共聚焦成像系统观察给药后的h157细胞形态，直观的观察dermaseptin-pp肽对肿瘤细胞细胞膜的影响，取出给药结束的共聚焦培养皿，弃去含药培养基，pbs
×
1ml冲洗2次，加入100μl dil染液(1︰50稀释)，37℃孵育20min，弃去dil染液，pbs
×
1ml冲洗2次，加入4％多聚甲醛500μl，4℃固定20min。pbs
×
1ml冲洗2次，加入100μl dapi工作液(1︰100稀释)，室温染色10min，pbs
×
1ml冲洗2次，将细胞保存在1ml hanks平衡盐溶液(hanks balanced salt solution,hbss)中，使用激光共聚焦显微镜观察染色后细胞膜与细胞核，进行拍照记录，dil染色液可将细胞膜染成红色，dapi染色液可将细胞核染成蓝色。4.根据权利要求1所述的新型抗菌肽dermaseptin-pp的研究方法，其特征在于，所述dermaseptin-pp和化疗药物协同抗肺癌活性及其细胞膜活性机制研究包括如下步骤：步骤一：溶血实验；步骤二：荷h157肺癌皮下瘤裸鼠模型的建立；步骤三：dermaseptin-pp肽抗肺癌体内药效评价；步骤四：细胞凋亡通路分析及生物安全性评价；以及步骤五：得出研究结果。5.根据权利要求4所述的新型抗菌肽dermaseptin-pp的研究方法，其特征在于，所述溶血实验包括：
红细胞的制备，家兔腹主动脉取血于肝素抗凝管中，取2ml血于50ml离心管中，置于离心机离心(930g
×
5min)，弃上清，用pbs清洗红细胞至上清无明显粉红色，最后加50ml pbs混匀红细胞；分组及样品制备，实验分为：阴性对照组，阳性对照组和dermaseptin-pp给药组。将dermaseptin-pp用pbs溶液(ph 7.4)稀释成320，160，80，40，20，10，4，2，0.2μg/ml的溶液；加样，取不同浓度样品100μl于1.5ml离心管中，加入2.1.1中制备好的红细胞悬液100μl；阴性对照组为生理盐水100μl加入100μl红细胞悬，阳性对照组为2％的triton x-100，每个浓度设置3个重复，样品置于37℃孵育2h，900
×
g离心3min，取100μl上清液于新的96孔盘中，除去气泡，在酶标仪450nm波长下测定各孔吸光度值，记录实验结果，溶血率计算公式如下：溶血率(％)＝(od
给药组-od
阴性组
)/(od
阳性组-od
阴性组
)
×
100
ꢀꢀꢀ
(公式3)。6.根据权利要求4所述的新型抗菌肽dermaseptin-pp的研究方法，其特征在于，所述荷h157肺癌皮下瘤裸鼠模型的建立包括：实验动物饲养，spf级balb/c雄性裸鼠，放置于25℃，12h光暗交替的环境中饲养，由专门饲养员提供食物和水，实验小鼠可以自主觅食与饮水；荷瘤动物模型建立，将生长状态良好的h157细胞培养到对数生长期，用0.25％胰蛋白酶-0.02％edta消化液消化完全，利用血球计数板对细胞进行计数，用pbs缓冲液洗涤细胞2次并重悬细胞使成为细胞密度为1
×
108个/ml的细胞悬液，balb/c-裸鼠(18g-20g)，通过腋下皮下接种h157细胞悬液，接种量为100μl/只，(含有1
×
107个细胞)，接种h157细胞的小鼠继续培养14天后备用(平均肿瘤体积约为200-250mm3)。7.根据权利要求4所述的新型抗菌肽dermaseptin-pp的研究方法，其特征在于，所述dermaseptin-pp肽抗肺癌体内药效评价包括：分组及给药，将荷瘤小鼠随机分成5组，每组5只：包括低、中、高浓度dermaseptin-pp肽组，模型组和阳性对照组，同时，设置空白对照组，即为正常无瘤小鼠，低、中、高浓度dermaseptin-pp肽组(浓度为4，6，8mm)，连续10天瘤内注射20μl含有相应浓度肽的pbs溶液；模型组小鼠连续10天瘤内注射20μl无菌pbs；阳性对照组为临床常用抗肺癌化疗药物顺铂(ddp)，连续5天腹腔注射200μl浓度为0.7mm的ddp溶液，全部结束给药后正常喂养至第10天；空白对照组不做处理；体重与瘤体积，自第一天给药起，每两天记录一次各组小鼠的体重和肿瘤体积，通过数字游标卡尺测量肿瘤的长度(l)和宽度(w)，根据下式计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝(l
×
w2)/2
ꢀꢀꢀ
(公式4)；抑瘤率及脾脏指数，末次给药的24h后，即第11天，解剖各组小鼠，剥离出皮下肿瘤组织，并解剖出肝和肺，脾，用生理盐水洗涤器官直至器官表面没有浮血，用滤纸吸干各器官多余的水分，然后于天平上记录各组肿瘤和脾脏重量，同时拍照记录，结束后肝，肿瘤和脾脏转移至4％多聚甲醛中固定，肺则先浸泡于pbs中直至漂浮到液面上，然后转移至4％多聚甲醛中固定过夜，根据以下公式计算肿瘤抑制率(tumor inhibition rate,tir)及脾脏指数：抑瘤率(tir)＝(1-给药组瘤重/pbs组平均瘤重)
×
100％
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(公式5)脾脏指数＝脾脏质量/体重量
ꢀꢀꢀ
(公式6)。
8.根据权利要求4所述的新型抗菌肽dermaseptin-pp的研究方法，其特征在于，所述细胞凋亡通路分析及生物安全性评价采用he染色分析各器官的病理情况及肿瘤转移情况，评价dermaseptin-pp肽的生物安全性，采用tunel染色和免疫组化染色综合分析dermaseptin-pp作用后肿瘤组织中凋亡相关蛋白的表达情况，分析dermaseptin-pp肽的作用机制。
技术总结
本发明公开了一种新型抗菌肽Dermaseptin-PP的研究方法，属于生物制药技术领域，其技术要点是：包括Dermaseptin家族抗菌肽的主要抗肿瘤机制为破坏肿瘤细胞膜，由于其通常具有正电性及两亲性，可以选择性的与富含阴离子成分的肿瘤细胞膜通过静电作用而结合，进而插入细胞膜使产生孔洞，造成肿瘤细胞内容物的外泄，从而快速且高效地杀伤肿瘤细胞。此种独特的破膜机制作用迅速，且不易使肿瘤细胞产生耐药性，因此，Dermaseptin家族抗菌肽作为新型抗肿瘤药物具有较好的应用前景，Dermaseptin-PP与Dermaseptin家族抗菌肽Dermaseptin-3的序列相似性高于90%，具有显著的抑制作用的优点。的抑制作用的优点。的抑制作用的优点。
技术研发人员：陆洋 杜守颖 董姊怡 郭明雪
受保护的技术使用者：北京中医药大学
技术研发日：2022.08.18
技术公布日：2023/1/23