肿瘤微环境特异激活的Her2-CD3双特异性抗体的制作方法

本发明涉及抗体药物领域，尤其是涉及一种肿瘤微环境特异激活的her2-cd3双特异性抗体。

背景技术：

1、多特异抗体是指可以结合两个不同抗原或一个抗原不同表位的特殊抗体，现已成为抗体工程领域的研究热点，在肿瘤免疫治疗及自身免疫疾病等领域具有广阔的应用前景。

2、2014年，amgen公司研制的blinatumomab多特异抗体获得fda批准用于急性淋巴细胞白血病的治疗。2017年11月，罗氏制药公司研制的emicizumab被fda批准上市，用于a型血友病的治疗。随着多特异抗体的临床应用成功及批准上市，多特异抗体已成为药物研究中的一个新热点。但是，多特异抗体还是有一些亟待解决的问题，细胞因子风暴、神经毒性等不良反应以及生产工艺问题是多特异抗体的主要问题。

3、因此，本领域仍然需要提供安全性高、特异性强、抗肿瘤活性高的多特异性抗体。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种肿瘤微环境特异激活的her2-cd3双特异性抗体。

2、本发明的目的还在于提供一种可激活的多特异性抗体的构建方法及其用途。

3、在本发明的第一方面，提供了一种突变型的cd3抗体，所述突变型的cd3抗体相对于野生型的cd3抗体序列，在重链可变区和/或轻链可变区的互补决定区(cdr区)引入一个或多个突变，所述突变选自下组：

4、重链可变区的m34、s53、y61、d68、f104、w111或f112的位置；和/或轻链可变区的y34、n54、k55、r56、w93、y94、或n96的位置包含一个或多个氨基酸替换为半胱氨酸(cys)的突变；

5、其中，所述野生型的cd3抗体结合cd3的亲和力为e0，突变型的cd3抗体结合cd3的亲和力为e1，e1/e0≤5.5(较佳地e1/e0≤3，较佳地≤1.5，更佳地e1/e0≤1)；

6、其中，所述野生型的cd3抗体的重链可变区含有以下三个互补决定区cdr：

7、seq id no.1所示的vh-cdr1，

8、seq id no.2所示的vh-cdr2，和

9、seq id no.3所示的vh-cdr3；以及

10、轻链可变区含有以下三个互补决定区cdr：

11、seq id no.5所示的vl-cdr1，

12、seq id no.6所示的vl-cdr2，和

13、seq id no.7所示的vl-cdr3。

14、在另一优选例中，所述野生型cd3抗体包括：单链抗体、双链抗体、单克隆抗体、嵌合抗体(如人鼠嵌合抗体)、鼠源抗体、或人源化抗体。

15、在另一优选例中，所述结合cd3的亲和力为结合cd3的ec50值。

16、在另一优选例中，所述的突变型的cd3抗体与cd3结合的亲和力e1与相应野生型cd3抗体与cd3结合的亲和力e0之比(e1/e0)为0.4-5.5，较佳地为0.5-2，较佳地为0.7-1.5，和更佳地0.8-1.2。

17、在另一优选例中，所述野生型cd3抗体为cd3鼠源抗体或cd3人源化抗体。

18、在另一优选例中，所述野生型cd3抗体包含如seq id no.10所示的重链可变区，和如seq id no.11所示的轻链可变区。

19、在另一优选例中，所述cd3人源化抗体包含如seq id no.4所示的重链可变区，和如seq id no.8所示的轻链可变区。

20、在另一优选例中，所述突变型的cd3抗体相对于野生型cd3抗体的重链可变区和/或轻链可变区的互补决定区(cdr)包含一个或多个突变；较佳地为1个、2个、3个、4个或5个氨基酸的突变。

21、在另一优选例中，所述突变型的cd3抗体相对于野生型cd3抗体的重链可变区的互补决定区(cdr)包含一个或多个氨基酸替换为半胱氨酸(cys)的突变；和/或相对于野生型cd3抗体的轻链可变区的互补决定区(cdr)包含一个或多个氨基酸替换为半胱氨酸(cys)的突变。

22、在另一优选例中，所述突变型的cd3抗体在对应于野生型cd3抗体的重链可变区的互补决定区包含选自下组的突变：m34c、s53c、y61c、d68c、f104c、w111c、f112c、或其组合，优选包含y61c的突变；和/或

23、对应于野生型cd3抗体的轻链可变区的互补决定区包含选自下组的突变：y34c、n54c、k55c、r56c、w93c、y94c、n96c、或其组合，优选包含y34c的突变。

24、在另一优选例中，针对抗体的氨基酸残基提及的氨基酸的所有位置编号均基于kabat编号。

25、在另一优选例中，所述抗体的可变区的互补决定区(cdr)内不形成链间二硫键或链内二硫键。

26、在另一优选例中，所述突变型的cd3抗体的重链可变区含有以下三个互补决定区cdr：

27、seq id no.1所示的vh-cdr1，

28、seq id no.9所示的vh-cdr2，和

29、seq id no.3所示的vh-cdr3；以及

30、轻链可变区含有以下三个互补决定区cdr：

31、seq id no.5所示的vl-cdr1，

32、seq id no.6所示的vl-cdr2，和

33、seq id no.7所示的vl-cdr3。

34、在另一优选例中，所述突变型的cd3抗体包括：(i)fab片段；(ii)f(ab')2片段；(iii)fd片段；(iv)fv片段；(v)单链fv(scfv)分子；或(vi)dab片段。

35、在另一优选例中，所述突变型的cd3抗体为双特异性、三特异性抗体或多特异性抗体。

36、在另一优选例中，所述突变型的cd3抗体包括经修饰的突变型的cd3抗体。

37、在另一优选例中，所述经修饰的突变型的cd3抗体为肿瘤微环境特异激活的抗体(tmeabody)，即掩蔽型抗体。

38、在另一优选例中，所述经修饰的突变型的cd3抗体包括但不限于，将掩蔽体(blocker)通过可裂解的连接肽连接至突变型的cd3抗体的突变位点处的半胱氨酸，所述突变位点位于突变型的cd3抗体的重链可变区和/或轻链可变区的互补决定区(cdr区)。

39、在另一优选例中，所述突变型的cd3抗体包括经修饰的突变型的cd3抗体，其具有如下所示的结构：

40、ab-(p-r1)n

41、其中，

42、ab为突变型的cd3抗体；

43、r1各自独立地为掩蔽体(blocker)；

44、p为可裂解的连接肽；

45、n为1-5的正整数；

46、“-”为化学键或接头或连接子。

47、在另一优选例中，所述掩蔽体是指阻止ab与它的配体或受体结合的基团。

48、在另一优选例中，所述掩蔽体选自包含聚乙二醇-c1-5-烷基羰基的基团：

49、

50、

51、其中每个r独立地是c1-4烷基；每个n独立地是1至30000范围内的整数，例如1至15000，1至5000，1至2000，1至300，1至150，1至50，1至20的整数或3至12；聚乙二醇或pegm表示分子量为44至132000的聚乙二醇，例如1000至50000或10000至30000的聚乙二醇；m表示聚乙二醇的分子量；波浪线表示连接r2的位置。

52、在另一优选例中，所述掩蔽体选自下组：peg5k、peg10k、peg20k、或peg40k。

53、在另一优选例中，所述r1为其中n独立地是1至2000，1至300，1至150，1至50或1至20的整数。

54、在另一优选例中，所述p包含如下所示的结构：

55、r2-r3-r4，其中，

56、r2不存在，或者是一个可切割的连接臂，其可以一个或多个蛋白水解酶激活或者是一个可以在病理微环境中被酸性激活的一个化学键；

57、r3不存在，或者是一个在r2被切割或者r2在病理微环境被酸激活之后自动脱落的连接臂；当r2不存在时，r3是一个在病理微环境被酸激活的一个化学键；

58、r4是一个可以与突变型的cd3抗体包含的半胱氨酸残基里的硫原子共价结合的基团。

59、在另一优选例中，所述r1通过化学键与p中的r2连接。

60、在另一优选例中，所述r2是能够被一种或多种蛋白水解酶，蛋白酶或肽酶活化或裂解的肽，其中所述蛋白酶选自下组：天冬酰胺内肽酶、颗粒酶、组织蛋白酶b、组织蛋白酶c、组织蛋白酶d、组织蛋白酶e、组织蛋白酶k、组织蛋白酶l、激肽释放酶、hk1、hk10、hk15、纤溶酶、胶原酶、iv型胶原酶、星形胶质素、xa因子、胰凝乳蛋白酶样蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶、弹性蛋白酶样蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶、猕猴桃蛋白酶、菠萝蛋白酶、钙蛋白酶、半胱天冬酶(caspase)、半胱天冬酶-3(caspase-3)、mirl-cp、木瓜蛋白酶、hiv-1蛋白酶、hsv蛋白酶、cmv蛋白酶、凝乳酶、肽酶、间质蛋白酶、，血浆蛋白酶、猪笼草蛋白酶、金属外肽酶、金属内肽酶、基质金属蛋白酶(mmp)、mmp1、mmp2、mmp3、mmp8、mmp9、mmp10、mmp11、mmp12、mmp13、mmp14、adam10、adam12、尿激酶纤溶酶原激活物(upa)、肠内激酶、前列腺特异性抗原(psa、hk3)、白细胞介素-113转换酶、凝血酶、fap(fap-a)、跨膜肽酶(meprin)、二肽基肽酶和二肽基肽酶-4(dppiv/cd26)，优选为天冬酰胺内肽酶。

61、在另一优选例中，所述r2为在病理微环境的酸性条件下可裂解的连接肽；优选地r2是三肽，其中与r1连接的三肽的第一个氨基酸残基选自ala，thr，val和ile，中间的第二个氨基酸残基选自ala，thr，val和asn，以及第三个氨基酸与ab连接的酸残基选自asn和asp；其中r2以酰胺，酯，氨基甲酸酯，脲或腙键的连接方式通过第一个氨基酸残基的氨基与r1连接，并通过第三个氨基酸残基的羧基以酰胺，酯，氨基甲酸酯，尿素或腙键连接方式与r3连接；优选地，三肽选自ala-ala-asn和ala-ala-asp。

62、在另一优选例中，ala-ala-asn可以被天冬酰胺内肽酶识别和切割，并且ala-ala-asp可以被颗粒酶识别和切割。

63、在另一优选例中，r2为在病理微环境的酸性条件下可裂解的连接肽，并且选自酰胺，酯，氨基甲酸酯，脲和腙键；优选地，其中r1-r2-r3-r4的结构由下式表示：

64、

65、其中x和y各自独立地为nr'或o，z为h或c1-10烷基，r'为h或c1-4烷基；r3分别以酰胺，酯，氨基甲酸酯，脲或腙键的连接方式通过x和y与r1和r4连接。

66、在另一优选例中，r4为

67、

68、在另一优选例中，所述p-r1的结构如下所示，

69、

70、其中r1为peg20k，结构式为：

71、在另一优选例中，所述经修饰的突变型的cd3抗体为可活化抗体。

72、在另一优选例中，所述蛋白酶由接近组织中表达cd3的细胞的肿瘤产生和/或由与cd3在组织中共定位的肿瘤产生，且其中当所述可活化抗体暴露于所述蛋白酶时，所述蛋白酶切割所述可活化抗体中的p。

73、在另一优选例中，所述p中的r4连接于突变型的cd3抗体(ab)的巯基。

74、在另一优选例中，所述p中的r4定点连接于突变型的cd3抗体的选自下组的氨基酸位点：对应于野生型cd3抗体的重链可变区的互补决定区的m34、s53、y61、d68、f104、w111或f112的位置；和/或轻链可变区的互补决定区的y34、n54、k55、r56、w93、y94、或n96的位置。

75、在另一优选例中，所述p中的r4定点连接于突变型的cd3抗体的选自下组的氨基酸位点：对应于野生型cd3抗体的重链可变区的互补决定区的m34c、s53c、y61c、d68c、f104c、w111c或f112c；和/或轻链可变区的互补决定区的y34c、n54c、k55c、r56c、w93c、y94c、或n96c。

76、在另一优选例中，所述p中的r4定点连接于突变型的cd3抗体的选自下组的氨基酸位点：对应于野生型cd3抗体的重链可变区的互补决定区的y61的位置；和/或轻链可变区的互补决定区的y34的位置。

77、在另一优选例中，所述r1具有选自以下的与所述ab结合的解离常数：

78、大于ab与cd3的解离常数；等于ab与cd3的解离常数；和小于ab与cd3的解离常数。

79、在另一优选例中，当所述经修饰的突变型的cd3抗体在切割状态下时，所r1不干扰ab结合cd3或与ab竞争结合cd3。

80、在另一优选例中，所述r1位于所述可活化抗体中，使得当所述可活化抗体在未切割状态下时，r1干扰ab与cd3的特异性结合，且当所述可活化抗体在切割状态下时，r1不干扰ab特异性结合cd3或不与ab竞争特异性结合cd3。

81、在另一优选例中，所述的经修饰的突变型的cd3抗体与cd3结合的亲和力e2与相应野生型cd3抗体与cd3结合的亲和力e0之比(e2/e0)为1-1000，较佳地为2-800，较佳地为5-600，更佳地为10-500。

82、在本发明的第二方面，提供了一种多特异性抗体，所述多特异性抗体包括：如本发明的第一方面所述的突变型的cd3抗体或经修饰的突变型的cd3抗体。

83、在另一优选例中，所述多特异性抗体还包括一个或多个靶向选自下组靶点的抗原结合区：her2、dll3、cldn6、egfr、tgfβ、bcma、b7h6、gucy2c、cd38、cd123、cd19、cd20、cd22、b7-h3、gpc3、cd73、pmsa、cd28、4-1bb、ox40、cd40、cd27、ctla4、pd1、pdl1、bcma、glp-1、trop2、tigit、lag-3、fgl1、tlr7。

84、在另一优选例中，所述抗原结合区为抗体或抗体片段，所述抗体片段包括：(i)fab片段；(ii)f(ab')2片段；(iii)fd片段；(iv)fv片段；(v)单链fv(scfv)分子；(vi)dab片段。

85、在另一优选例中，所述多特异性抗体包括双特异性抗体或三特异性抗体。

86、在另一优选例中，所述多特异性抗体还包括靶向选自下组靶点的第二抗原结合区：her2、dll3、cldn6。

87、在另一优选例中，所述第二抗原结合区为靶向her2的scfv片段。

88、在另一优选例中，所述多特异性抗体还包含抗体的fc段。

89、在另一优选例中，所述的fc段包含杵臼结构(knobs-into-holes，kih)。

90、在另一优选例中，所述的fc段为人igg fc段。

91、在另一优选例中，所述如权利要求1所述的突变型的cd3抗体或如权利要求2所述的经修饰的突变型的cd3抗体为cd3抗体的fab片段。

92、在另一优选例中，所述cd3抗体的fab片段的重链可变区含有以下三个互补决定区cdr：

93、seq id no.1所示的vh-cdr1，

94、seq id no.9所示的vh-cdr2，和

95、seq id no.3所示的vh-cdr3；以及

96、轻链可变区含有以下三个互补决定区cdr：

97、seq id no.5所示的vl-cdr1，

98、seq id no.6所示的vl-cdr2，和

99、seq id no.7所示的vl-cdr3。

100、在另一优选例中，所述靶向her2的scfv片段的序列如seq id no.12所示。

101、在另一优选例中，所述多特异性抗体为双特异性抗体，所述双特异性抗体包括：

102、第一结合元件d1；和

103、第二结合元件d2；

104、其中，所述d1为本发明的第一方面所述的突变型的cd3抗体或其衍生抗体(经修饰的突变型的cd3抗体)；

105、所述d2特异性结合选自下组的靶分子蛋白：her2、dll3或cldn6。

106、在另一优选例中，所述的d1和d2通过连接肽相连。

107、在另一优选例中，所述连接肽包括抗体恒定区。

108、在另一优选例中，所述抗体恒定区包括重链恒定区、轻链恒定区或fc段。

109、在另一优选例中，所述的fc段包含杵臼结构(knobs-into-holes，kih)。

110、在另一优选例中，所述cd3蛋白为cd3的ε链(cd3ε)。

111、在另一优选例中，所述d1为突变型的cd3抗体或其衍生抗体(经修饰的突变型的cd3抗体)。

112、在另一优选例中，所述的经修饰的突变型的cd3抗体如本发明的第一方面所述。

113、在另一优选例中，所述突变型的cd3抗体相对于野生型cd3抗体的重链可变区的互补决定区(cdr)包含一个或多个氨基酸替换为半胱氨酸(cys)的突变；和/或相对于野生型cd3抗体的轻链可变区的互补决定区(cdr)包含一个或多个氨基酸替换为半胱氨酸(cys)的突变。

114、在另一优选例中，所述突变型的cd3抗体在对应于野生型cd3抗体的重链可变区的的互补决定区y61的位置；和/或轻链可变区的y34位置包含氨基酸替换为半胱氨酸(cys)的突变。

115、在另一优选例中，所述d1为突变型的cd3抗体的fab段。

116、在另一优选例中，所述d2为抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段靶向选自下组靶分子蛋白：her2、dll3、cldn6，较佳地为her2。

117、在另一优选例中，所述抗原结合片段的结构选自下组：(i)fab片段；(ii)f(ab')2片段；(iii)fd片段；(iv)fv片段；(v)单链fv(scfv)分子；或(vi)dab片段。

118、在另一优选例中，所述d2为靶向her2抗体的scfv。

119、在本发明的第三方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白包括：

120、(1)如本发明的第一方面所述的突变型的cd3抗体或经修饰的突变型的cd3抗体或如本发明的第二方面所述的多特异性抗体；

121、(2)任选的具有治疗功能的多肽分子或片段；和/或

122、(3)任选的协助提高分子理化特征和药学特征的蛋白功能域。

123、在另一优选例中，所述重组蛋白还包括：(4)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

124、在另一优选例中，所述的标签序列选自下组：6his标签、gggs序列、flag标签。

125、在另一优选例中，所述的重组蛋白为单体、二聚体、或多聚体。

126、在另一优选例中，所述具有治疗功能的多肽分子或片段包括但不限于：靶向选自下组靶点的的多肽分子或片段：her2、dll3、cldn6、egfr、tgfβ、bcma、b7h6、gucy2c、cd38、cd123、cd19、cd20、cd22、b7-h3、gpc3、cd73、pmsa、cd28、4-1bb、ox40、cd40、cd27、ctla4、pd1、pdl1、bcma、glp-1、trop2、tigit、lag-3、fgl1、tlr7。

127、在另一优选例中，所述的重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。

128、在另一优选例中，所述的融合蛋白包括多特异性抗体、嵌合抗体。

129、在另一优选例中，所述提升蛋白理化性质或成药性的功能域包括fc段、抗白蛋白纳米抗体(hle)、白蛋白结合域(abd)。

130、在本发明的第四方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明的第一方面所述的突变型的cd3抗体或本发明的第二方面所述的多特异性抗体。

131、在本发明的第五方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明的第四方面所述的多核苷酸。

132、在本发明的第六方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明的第五方面所述的载体或基因组中整合有本发明的第四方面所述的多核苷酸。

133、在本发明的第七方面，提供了一种制备本发明的第二方面所述的多特异性抗体的方法，包括步骤：

134、(i)在合适的条件下，培养本发明的第六方面所述的宿主细胞，获得含有本发明的第二方面所述的多特异性抗体的混合物；和

135、(ii)对步骤(i)中得到的混合物进行纯化和/或分离，从而获得本发明的第二方面所述的多特异性抗体。

136、在本发明的第八方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：

137、(i)如本发明的第二方面所述的多特异性抗体；和

138、(ii)药学上可接受的载体。

139、在另一优选例中，所述的药物组合物还包含：

140、(b)其他生物活性的药物，如治疗肿瘤的药物。

141、在另一优选例中，所述的药物组合物包括单方药物、复方药物、或协同药物。

142、在另一优选例中，所述的药物组合物的施用方式选自下组：皮下注射、皮内注射、肌肉注射、静脉注射、腹腔注射、微针注射、口服、或口鼻腔喷入和雾化吸入。

143、在另一优选例中，所述药物组合物的施用方式为，将所述药物组合物和免疫细胞(如树突状细胞、自然杀伤细胞、淋巴细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞等)共培养后，分离免疫细胞进行体内回输。

144、在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型选自下组：液态、固体、或凝胶态。

145、在另一优选例中，所述的药物组合物用于抗肿瘤治疗。

146、在本发明的第九方面，提供了一种免疫偶联物，所述免疫偶联物包括：

147、(a)如本发明的第二方面所述的多特异性抗体；和

148、(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。

149、在另一优选例中，所述的组分(a)和(b)可操作性连接。

150、在另一优选例中，所述偶联物部分选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、mri(磁共振成像)或ct(电子计算机x射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如il-2等)、抗体、抗体fc片段、抗体scfv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，dt-心肌黄酶(dtd)或联苯基水解酶-样蛋白质(bphl))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。

151、在本发明的第十方面，提供了如本发明的第一方面所述的突变型的cd3抗体或经修饰的突变型的cd3抗体、如本发明的第二方面所述多特异性抗体或如本发明的第九方面所述的免疫偶联物的用途，用于制备(a)检测试剂或试剂盒；和/或(b)制备预防和/或治疗癌症或肿瘤或自身免疫病的药物组合物。

152、在本发明的第十一方面，提供了一种预防或治疗肿瘤的方法，向有需要的受试者施用如本发明的第二方面所述的多特异性抗体、如本发明的第八方面所述的药物组合物或如本发明的第九方面所述的免疫偶联物。

153、在另一优选例中，所述的肿瘤包括但不限于：乳腺癌、肝癌、胃癌、大肠癌、白血病、肺癌、肾脏肿瘤、小肠癌、前列腺癌、结直肠癌、前列腺癌、宫颈癌、淋巴癌、骨癌、肾上腺肿瘤、或膀胱肿瘤。

154、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。