一种具有类分子伴侣功能的固定化载体及应用

1.本发明属于酶的固定化技术领域，特别涉及一种具有类分子伴侣功能的柔性智能固定化载体及应用。


背景技术：

2.酶对生命至关重要，承担着催化几乎所有新陈代谢过程的重要任务。酶是绿色生物制造的“芯片”，由于具有高选择性、高专一性和温和性等优点，在工业生物合成中极具价值。酶的高活性和稳定性是酶催化的普遍要求。但是酶在工程化应用中的主要缺点是在复杂应用环境下的稳定性差、易失活，例如温度和ph的改变、有机溶剂、小分子抑制剂、甚至其他蛋白质的存在会对酶的活性和稳定性产生影响。为了提高酶的性能，目前发展的解决方法包括酶的分子改造和酶的固定化，分别对酶分子本身和酶分子的环境进行改造。但酶活性与稳定性存在trade-off效应，如何同时提高酶在复杂应用环境下的稳定性和活性仍是目前的研究难点。
3.常规的固定化酶载体大多为刚性，为酶提供的弛豫时间短，微环境与酶分子之间是非特异性相互作用，虽然可以提高酶的稳定性，但酶表观活性一般会有至少30-50％的损失，在实际应用中存在很大的局限性。正如陈超、汤文等人在专利(公开号cn110343693a)中公开的一种磁性固定化酶载体的制备方法，这种共价固定化方法能够最大限度的提高固定化酶的稳定性，但是将酶固定在载体后只保留了69.2％的脂肪酶活性。
4.酶蛋白在应用过程中往往伴随着二级结构的变化，当酶的二级结构变化后酶的活性遭到剧烈的破坏，为了让酶的二级结构得到恢复，人们已经设计出了一些恢复酶活性的方法，但是这些方法往往过程复杂，外加条件苛刻，有不可忽视的缺点。
5.董晓燕、刘护等人在专利(公开号cn105111390a)中公开了一种金属螯合纳米介质及制备方法和应用于强化包涵体蛋白复性与集成纯化的方法，具体步骤如下：在平均粒径为20-30nm的二氧化硅纳米粒子表面接枝聚合物制备高电荷密度的金属螯合纳米介质来强化包涵体蛋白的复性与集成纯化的方法，该方法得到的金属螯合纳米介质的电荷密度达到2520-5680μmol/g，远高于当前同电荷蛋白质复性研究中用到的其他介质的电荷密度。极高的电荷密度增强了介质与同电荷蛋白质分子间的静电排斥作用，从而更有效地抑制蛋白质的聚集；纳米介质极高的比表面积使得同电荷的蛋白质分子在空间上得到更有效的定向排布，因此更有利于同电荷蛋白质的复性，但是，此种方法合成的复合载体只针对同种电荷的酶，普适性较差，应用受到限制。
6.向开军在专利(公开号cn111777659a)中公开了一种普适的、电场驱动的蛋白质固相复性方法，具体步骤如下：首先，制备紧密接触的两层固相凝胶。第一层(底层或前置层)凝胶为很薄的一层非变性，低浓度聚丙烯酰胺凝胶(或性能类似的其他凝胶)，作为蛋白质复性的场所。第二层(上层或后置层)为含有变性剂尿素和变性蛋白质的固相变性琼脂糖凝胶(或性能类似其他凝胶)。将包涵体蛋白质变性裂解液与含有变性剂尿素的液态琼脂糖凝胶(或其他类似凝胶)混合后，加到非变性薄层固相聚丙烯酰胺凝胶(或其他类似凝胶)之
上，在低温(优选但不限于4℃～7℃)下凝固成含有变性蛋白质的尿素变性琼脂糖凝胶(上层或后置层)。然后，将紧密接触的两层凝胶置于直流电场中，通过电泳方式，使变性琼脂糖凝胶中的变性蛋白质迁移，进入到非变性聚丙烯酰胺凝胶中而复性。复性后的蛋白质在电场中继续迁移，穿过非变性聚丙烯酰胺凝胶进入前方透析袋中或电泳槽中而被回收。这种方法能够便利的进行酶的复性，但是需要构建复杂的实验装置和外加条件，使用条件受限。


技术实现要素：

7.本发明公开了一种具有类分子伴侣功能的固定化载体及应用。针对不同性质的酶蛋白，通过高通量筛选法简单快速的设计筛选对酶的性能具有促进作用的柔性聚合物固定化载体，利用固定化载体的性质调节酶的微环境，在不同的反应条件下大大提高了酶的催化活性和催化效率。同时，利用分子印迹技术提高固定化载体对酶的特异性结合力，克服以往固定化载体对酶的负载特异性较差、结合不强、容易发生酶脱落的缺点。利用载体的智能响应性能实现载体的再生利用。最终合成的固定化载体能够利用分子印迹空腔与变性失活的酶特异性结合，发挥类分子伴侣的功能。由于在分子印迹过程中，酶分子与柔性载体形成了主客体互补配对，所以这种方法可以为酶分子量身定制限域空间，在无外加条件下能够恢复变性酶的结构和性能，无需构建复杂的实验设备。该固定化载体制备成本低，特异性和选择性强，可用于酶的固定化，发挥载体的带电性和疏水性促进酶的活性。
8.所述的具有类分子伴侣功能的固定化载体的制备方法为：
9.(1)将n-叔丁基丙烯酰胺(tbam)或n-苯基丙烯酰胺(pam)溶在乙醇中，将n-异丙基丙烯酰胺(nipam)、功能单体、交联剂和引发剂溶在水中，以上反应物以不同比例混合，加入检测池中，超声通氮气5-10min脱除混合液中的氧气后，在检测池底原位聚合反应得到聚合物薄层；反应后用水清洗聚合物薄层3-5次，除去未反应的单体；
10.(2)向检测池中加入酶溶液进行孵育，酶被固载到检测池底部的聚合物薄层上，除去上清液，测定固定在聚合物薄层上的酶的催化活力，筛选出对酶分子亲和力高和活力提升大的聚合物合成配方；
11.(3)以步骤(2)筛选出来的配方配制原料，再加入模板剂和表面活性剂，超声通氮气5-10min脱除混合液中的氧气后，搅拌聚合反应得到聚合物纳米颗粒，洗脱模板剂并透析纯化，获得具有类分子伴侣功能的固定化载体。
12.所述的功能单体选自丙烯酸(aac)、衣康酸(ia)、甲基丙烯酸(maa)、n-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺(apm)、(3-丙烯酰胺丙基)三甲基氯化铵(atc)、1-乙烯基咪唑(im)、n-[(3-(二甲氨基)丙基]甲基丙烯酰胺(dmapaa)、4-乙烯基苯硼酸(vpba)、丙烯酰胺(aam)、甲基丙烯酸羟乙酯(hema)和n-(2-氨基乙基)丙烯酰胺(aem)、2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱(mpc)中的一种或几种。
[0013]
所述的交联剂为n,n'-亚甲基双丙烯酰胺、n,n'-乙烯基双丙烯酰胺和乙二醇二甲基丙烯酸酯中的一种或几种。
[0014]
所述的引发剂为过硫酸铵、偶氮二异丁腈或四甲基乙二胺。所述的引发剂的用量为0.3-2mg/ml。
[0015]
所述的n-叔丁基丙烯酰胺或n-苯基丙烯酰胺与n-异丙基丙烯酰胺、功能单体、交联剂的摩尔比为8-98:38-80:5-50:2-10。
[0016]
所述的n-叔丁基丙烯酰胺或n-苯基丙烯酰胺与n-异丙基丙烯酰胺、功能单体的总浓度为10-1000mm。
[0017]
所述步骤(1)的聚合反应在密封或氮气氛围下进行，聚合反应温度为25℃-80℃，聚合反应时间为2-72h。
[0018]
所述步骤(2)测定固定在聚合物薄层上的酶的催化活力的方法为：向检测池中加入显色剂，反应2min后，使用酶标仪测定吸光度值，计算出聚合物对酶活的影响。
[0019]
所述的表面活性剂为十二烷基硫酸钠或十六烷基三甲基溴化铵，所述的表面活性剂的用量为0.01-0.2mg/ml。
[0020]
所述的模板剂为酶分子、酶分子的表位多肽、酶分子或酶分子表位多肽表面修饰的二氧化硅微球、四氧化三铁磁球或玻璃珠微球。所述的模板剂的用量按酶分子或酶分子的表位多肽的含量计为0.01-0.4mg/ml。
[0021]
所述步骤(3)的聚合反应在密封或氮气氛围下进行，聚合反应温度为25℃-65℃，聚合反应时间为2-72h。
[0022]
所述步骤(3)的搅拌的转速为300-1000rpm。
[0023]
所述的步骤(3)的聚合反应完成后，通过升高温度到50-90℃、降低温度到0-10℃、或者加入浓度为0.5m-5m的nacl水溶液搅拌反应2-24h洗脱模板剂。
[0024]
一种酶固定的方法为：将具有类分子伴侣功能的固定化载体分散在水中，然后加入游离酶，在0-10℃下孵育1-48h，之后透析纯化，获得固相酶制剂。其中，固定化载体的浓度为0.5-100mg/ml，酶的浓度为0.1-50mg/ml。
[0025]
一种失活酶复性的方法为：将0.5-100mg/ml具有类分子伴侣功能的固定化载体与失活酶先35-40℃孵育0.5-2h，再3-5℃孵育20-30h。
[0026]
本发明制备的固定化载体为柔性聚合物，有利于适配酶的柔性构象，能够发挥分子伴侣功能，与变性失活的酶结合，利用柔性聚合物的特异性分子印迹空穴，无需外加条件和复杂的实验设备，能够恢复酶的结构和催化性能，实现变性酶的复性。本发明基于高通量筛选方法得到的柔性聚合物固定化载体对酶蛋白具有较高的亲和力和良好的选择性，可以代替传统的固定化载体；该固定化载体是由化学方法制备的柔性聚合物，具有较高的稳定性、较长的使用寿命和较强的抗恶劣环境的能力，克服了传统固定化酶载体对酶蛋白选择性差、制备成本高、酶的催化活性降低等缺点。本方法制备的柔性固定化载体针对需要固定化的酶灵活设计，成本大大降低，能够快速确定带电性、疏水性和亲和力最适宜的固定化载体，大大提高了合成效率，适用于各种酶蛋白的固定化载体筛选，并且通过分子印迹技术大大提高了固定化载体对酶的亲和力和选择性，通过分子印迹技术为酶分子量身定制的限域空间可介导酶的正确折叠，达到同时提高酶和活性和催化效率、恢复失活酶活性的效果。同时，利用载体的温度和ph等智能响应性能，实现了载体的再生利用。
附图说明
[0027]
图1是实施例2合成的具有类分子伴侣功能的柔性智能固定化酶载体的扫描电镜图。图(a)的合成配方为aac 10％，tbam 35％，bis 2％，nipam 53％；图(b)的合成配方为atc 10％，tbam 60％，bis 2％，nipam 28％；图(c)的合成配方为atc 10％，tbam 40％，bis 2％，nipam48％。
[0028]
图2是实施例2基于最佳单体配方合成的非印迹载体和印迹载体对脂肪酶的吸附量。功能单体为(3-丙烯酰胺基丙基)三甲基氯化铵(atc)。
[0029]
图3是实施例2基于最佳单体配方合成的非印迹载体和印迹载体对漆酶的吸附量。功能单体为丙烯酸(aac)。
[0030]
图4是实施例3基于不同功能单体配方(功能单体：丙烯酸aac，丙烯酰胺aam，(3-丙烯酰胺基丙基)三甲基氯化铵atc)合成的非印迹载体和印迹载体固定化漆酶的相对酶活。
[0031]
图5是实施例3以衣康酸为单体合成的印迹载体固定化漆酶的相对酶活。
[0032]
图6是实施例5中合成的非印迹载体和印迹载体促进失活酶二级结构恢复的圆二色谱结果。
[0033]
图7是实施例5中基于最佳单体配方合成的非印迹载体和印迹载体促进失活酶恢复酶活的结果。
[0034]
图8是实施例5中基于最佳单体配方合成的非印迹载体和印迹载体促进失活脂肪酶结构恢复的ftir结果。
[0035]
图9是实施例5中合成的非印迹载体和印迹载体促进失活脂肪酶结构恢复的圆二色谱结果。
[0036]
图10是实施例5中合成的非印迹载体和印迹载体促进失活漆酶结构恢复的圆二色谱结果。
[0037]
图11是实施例5中合成的非印迹载体和印迹载体促进失活脂肪酶结构恢复的蛋白负染透射电镜结果。
[0038]
图12是应用例5中合成的非印迹载体和印迹载体促进失活漆酶结构恢复的蛋白负染透射电镜结果。
具体实施方式
[0039]
为使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明提供的一种具有类分子伴侣功能的柔性智能固定化载体及应用进行详细描述。以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
[0040]
聚合物的设计策略是利用仿生分子设计方法，通过模拟酶-分子伴侣相互作用，研究酶-柔性聚合物相互作用。酶与分子伴侣是通过氢键、静电力和疏水等多种相互作用实现其特定结合域的特异性识别，因此选择带正电、负电、疏水和易形成氢键的类氨基酸功能单体构建单体组合化学文库，利用高通量筛选方法获得单体配方，聚合反应制备具有类分子伴侣功能和提高酶活的固定化载体。
[0041]
实施例1：基于高通量筛选合成对酶分子亲和力大和酶活提高最明显的固定化载体
[0042]
(1)将各个单体分别配制成200mm的储液，以表1的摩尔配比加入各单体和交联剂的储液得到总体积为200μl的混合液，再向混合液中加入表1浓度的引发剂过硫酸铵50μl，然后将各混合液分别置于96孔板各孔中，超声通氮气5-10min脱除混合液中的氧气后，使用密封贴纸密封96孔板，然后置于80℃的烘箱中反应3小时，在96孔板各孔底得到聚合物薄层，反应后用水清洗聚合物薄层3次，除去未反应的单体。
[0043]
(2)向步骤(1)获得的底部合成聚合物薄层的96孔板各孔中分别加入100μl的漆酶
(50μg/ml)或者脂肪酶(2.5mg/ml)或者细胞色素c(100μg/ml)、d-氨基酸氧化酶(50μg/ml，在摇床上孵育3h，酶则会被固定在96孔板板底的聚合物上，除去溶液。向各孔中加入显色剂(漆酶的显色剂为10mm abts、100μl；脂肪酶的显色剂为1.665mg/ml对硝基苯基月桂酸酯、20μl；细胞色素c的显色剂为5mm abts、100μl；daao的显色剂为100μm荧光红、30μl)，反应2min后，使用酶标仪测定吸光度值，计算出聚合物对酶活的影响，筛选出对酶分子亲和力较高和酶活提升较大的聚合物合成配方。
[0044]
表1固定化酶载体的合成配方
[0045]
[0046][0047]
以漆酶(laccase)、脂肪酶(lipase)、细胞色素c(cyt c)、d-氨基酸氧化酶(daao)为例，基于高通量筛选，最终确定最佳配方如下，漆酶(laccase，配方1)：ia 10％，tbam 40％，bis 2％，nipam 48％；脂肪酶(lipase，配方2)：atc 10％，tbam 60％，bis 2％，nipam 28％；细胞色素c(cyt c，配方3)：aac 40％，tbam 35％，bis 2％，nipam 23％；d-氨基酸氧化酶(daao，配方4)：atc 10％，tbam 35％，bis 2％，nipam 53％。以上配方合成的聚合物对其酶活提高最明显，从而通过高通量筛选确定对酶的性能最优的固定化载体。
[0048]
实施例2：利用分子印迹技术提高固定化载体对酶的亲和力和选择性
[0049]
根据实施例1利用高通量筛选得到对酶性能具有促进作用的配比后，分别选择脂肪酶和漆酶作为模板分子，然后以实施例1得到的最优配比配制单体溶液各50ml，加入500μl引发剂50mg，总单体浓度为20mm。然后加入0.02mg/ml十二烷基硫酸钠，5mg的脂肪酶或漆酶作为模板分子，再将反应液加入到反应釜中，辅助磁力搅拌或机械搅拌，在40℃下反应24h，通过沉淀聚合或反相乳液聚合反应合成聚合物纳米颗粒。反应后向纳米颗粒中加入1m的nacl水溶液并搅拌2h脱除酶模板，再用纯水透析，得到分子印迹固定化载体。或者将酶模板分子固定在材料上进行印迹，首先制备固相支持载体，可为二氧化硅微球、磁性四氧化三铁微球、玻璃珠等微球，在微球表面修饰氨基、羧基以及其他化学键，其后将酶分子固定在
固相载体表面。以将酶模板分子固定在四氧化三铁微球上为例，具体的操作过程如下：(1)磁性四氧化三铁微球magnp的合成：称取1.3g fecl3·
6h2o、0.62g十六烷基三甲基溴化铵、2.6g无水乙酸钠于圆底烧瓶内，加入40ml乙二醇，在80℃搅拌一小时至完全溶解，转移至反应釜。200℃反应10h，用水和乙醇洗涤，60℃烘干备用。(2)在磁性四氧化三铁微球表面合成sio2薄层(magnp@sio2)：将100mg mag np均匀分散在87.1ml 80％(v/v)乙醇溶液中加入1.4ml 25％nh3·
h2o，超声1min；然后加入11.5ml原硅酸四乙酯teos，于30℃水浴中、600-700rpm机械搅拌反应6h。反应后，用水洗至ph呈中性，再用乙醇洗，60℃烘干备用。(3)magnp@sio2表面修饰氨基：将300mg magnps@sio2分散在180ml乙醇溶液中(乙醇：水＝3/1，v/v)，在室温下超声30分钟。通氮气30min，置于40℃水浴中，将4ml 3-(氨基丙基)三甲氧基硅烷(aptms)注入烧瓶中，机械搅拌反应过夜，得到表面键合氨基的magnp@sio
2-nh2，用水和乙醇洗涤，60℃烘干备用。(4)模板分子的固定化：在室温下将50mg magnp@sio
2-nh2分散在含有3ml戊二醛(5％v/v)的30ml溶液中，600-700rpm机械搅拌3h将醛基结合到magnp@sio
2-nh2的表面上。用pbs(0.1m，ph 7.2-7.4)洗涤，以去除未反应的戊二醛。随后将magnp@sio
2-nh2分散在含有10ml 1mg/ml模板分子的pbs(0.1m，ph 7.2-7.4)溶液中孵育2h。通过磁性收集分离颗粒并用pbs(0.1m，ph 7.2-7.4)洗涤，获得固相模板。(5)固相印迹固定化载体的合成，以漆酶为例：将100mg的漆酶固相模板与20mm 50ml配方1的单体溶液混合均匀，通氮气30min，在40℃下反应24h，通过升高温度到65℃或降低温度到4℃洗脱，得到具有类分子伴侣功能的柔性智能固定化酶载体。具有类分子伴侣功能的柔性智能固定化酶载体的扫描电镜结果如图1。
[0050]
将实施例2制备的分子印迹载体分别对脂肪酶和漆酶进行固定化。具体步骤如下：取5mg的分子印迹固定化载体分散在5ml的纯水中，向溶液体系中加入0.25mg的游离酶，待酶完全溶解后，在低温下保存24h，之后对孵育体系进行透析纯化，测定分子印迹载体对目标蛋白的固载率。
[0051]
如图2所示，由实施例1获得的最佳配方合成的非印迹固定化酶载体对脂肪酶的吸附量是23.5mg/g，而实施例2中基于实施例1获得的最佳配方和分子印迹技术获得的分子印迹固定化酶载体对脂肪酶的吸附量是146.7mg/g，印迹因子为6.24，表明分子印迹技术进一步提高了固定化载体对酶的亲和力和选择性。
[0052]
同样的，如图3所示，由实施例1获得的最佳配方合成的非印迹柔性固定化酶载体对漆酶的吸附量是53.9mg/g，而实施例2中基于实施例1获得的最佳配方和分子印迹技术获得的分子印迹柔性固定化酶载体对漆酶的吸附量是235.6mg/g，印迹因子为4.37，表明分子印迹技术进一步提高了固定化载体对酶的亲和力和选择性。
[0053]
应用例3：分子印迹固定化载体提高酶的活性
[0054]
将脂肪酶(147μg/ml)和漆酶(235μg/ml)分别与配方2和配方1合成的固定化酶载体(1mg/ml)在37℃、200rpm孵育2h进行固定化，测定固定化酶的催化活性，并与游离酶的催化活性进行对比。脂肪酶活性测定：取50μl的0.33mg/ml的月桂酸4-硝基苯酯溶于异丙醇配制的溶液，加入ph＝8的磷酸盐缓冲液200μl以及20μl的1.25mg/ml的分子印迹载体固定化脂肪酶或非印迹载体固定化脂肪酶或游离脂肪酶，用酶标仪测定410nm处6min内产物的吸光度变化。漆酶的活性测定：取100μl浓度为0.05mg/ml的分子印迹载体固定化漆酶或非印迹载体固定化漆酶或游离漆酶，加入100μl浓度为10mm的2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑
啉-6-磺酸(abts)，用酶标仪测定其在420nm处2min内的吸光度变化。
[0055]
实验结果如图4和图5所示发现分子印迹固定化载体能够明显提高脂肪酶和漆酶的催化活性，脂肪酶和漆酶的酶活分别为对应游离酶水平的2.06和8.44倍。
[0056]
应用例4：分子印迹固定化载体提高酶的催化效率
[0057]
脂肪酶lipase动力学测定：取50μl的浓度为0.5-5mm的月桂酸4-硝基苯酯溶于异丙醇配制的溶液，加入ph＝8的磷酸盐缓冲液200μl以及20μl的1.25mg/ml的分子印迹载体固定化脂肪酶或非印迹载体固定化脂肪酶或游离脂肪酶，用酶标仪测定410nm处6min内产物的吸光度变化。
[0058]
漆酶laccase动力学测定：取100μl浓度为0.05mg/ml的分子印迹载体固定化漆酶或非印迹载体固定化漆酶或游离漆酶，加入100μl浓度为0.2-10mm的abts，用酶标仪测定其在420nm处2min内的吸光度变化。
[0059]
实验结果如表2和表3所示，可以看出分子印迹载体固定化酶的催化效率(k
cat
/km)明显优于游离酶。其中，分子印迹载体固定化漆酶的催化效率是游离漆酶的2.8倍，分子印迹载体固定化脂肪酶的催化效率是游离脂肪酶的3倍。同时，分子印迹载体固定化酶的催化效率明显优于非印迹载体固定化酶，进一步证实了构建的分子印迹识别位点在提高酶催化性能上的优越性。
[0060]
表2固定化漆酶和游离漆酶的催化反应动力学参数比较
[0061][0062]
表3固定化脂肪酶和游离脂肪酶的催化反应动力学参数比较
[0063][0064]
应用例5：分子印迹固定化载体对失活酶的复性
[0065]
首先对脂肪酶和漆酶分别用6m盐酸胍，37℃，200rpm处理3h进行失活，然后通过透析48h去除盐酸胍分子，失活后对变性的酶蛋白进行圆二色谱测试，表征其二级结构与天然酶的差异，证明酶蛋白变性后其二级构象遭到破坏。实验结果如图6所示，变性后的酶蛋白相较于天然酶来说，其特征峰强度大幅度降低，表明在此波长处的二级结构遭到破坏。然后，取5mg/ml的分子印迹固定化载体(配方1)与变性酶的漆酶(0.5mg/ml)或脂肪酶
(1.25mg/ml)37℃，200rpm共孵育1h，进一步4℃孵育24h。孵育完成后，对分子印迹固定化载体结合变性酶溶液进行圆二色谱测试，表征固定化载体对变性酶结构的恢复效果，观察其二级结构与变性酶和天然酶的差异，证明固定化载体能够对酶蛋白被破坏的二级构象进行有效地恢复，变性后的酶蛋白与分子印迹固定化载体孵育24h后，变性酶的二级构象能够恢复至接近天然酶的水平，其特征峰强度相较于变性酶大幅度增强，表明在此波长处的遭到破坏二级结构的结构得到恢复。
[0066]
分子印迹固定化载体对变性酶进行复性后，分别测定复性后酶的催化活性。具体实验过程如下：将漆酶(50μg/ml)、细胞色素c(100μg/ml)、d-氨基酸氧化酶(50μg/ml)分别与对应的1mg/ml的分子印迹固定化载体或者脂肪酶(2.5mg/ml)与对应的10mg/ml的分子印迹固定化载体置于200rpm、37℃摇床里孵育2h，然后置于4℃冰箱里孵育24h，取出待温度恢复至室温测试酶活。
[0067]
实验结果如图7所示。可以看出，变性失活后酶的催化活性不足天然酶的10％，说明酶蛋白结构遭到破坏使酶的催化活性受到影响。当分子印迹固定化载体与变性酶进行共孵育后，酶活恢复至天然酶甚至高于天然酶水平。进一步通过傅立叶红外变化、圆二色谱、负染tem等方式表征分子印迹固定化载体对变性酶的分子伴侣功能，其结果如图8-12所示，证明分子印迹固定化载体可介导变性酶的正确折叠，使其恢复至天然构象，从而恢复失活酶的活性。