一种油莎豆原生质体的制备方法

1.本发明属于植物原生质体制备技术领域，具体涉及一种油莎豆原生质体的制备方法。


背景技术：

2.油莎豆(cyperus esculentus l.)为莎草科莎草属植物，又名虎坚果、铁荸荠和油莎草等，是一种非传统的地下块茎类作物，其圆形或椭圆形豆状块茎积累大量油脂，且产量和出油率高，抗逆性及适应性强，能于沙化、荒漠、盐碱化等土壤种植，不与粮食争地，是一种发展潜力巨大、综合利用价值极高的特色油料作物。
3.原生质体是指去除细胞壁后由质膜包裹的裸露细胞。原生质体由于没有细胞壁，更易摄取外源遗传物质，是进行基因功能研究和遗传转化的理想受体。同时原生质体具有细胞全能性，可再生分化成完整的植株，因此，原生质体的制备及培养是植物繁殖和再生的重要途径。利用原生质体融合进行体细胞杂交，可解决油莎豆有性杂交困难的育种问题，此外，原生质体也是遗传基础研究的重要材料，借助原生质体可对油莎豆基因进行亚细胞定位以及蛋白间的相互作用等研究，从而为揭示油莎豆基因功能奠定基础。因而，油莎豆原生质体的高质量高效率的制备是这些研究顺利开展的前提。目前，许多模式植物和粮食作物例如烟草、拟南芥、玉米、水稻等的原生质体制备技术已非常完善，但国内外关于油莎豆原生质体制备的研究尚未见报道。
4.油莎豆叶片窄长坚硬，表面覆盖较厚的腊质层，且具有“空腔”结构。目前，拟南芥和玉米都是采用其叶片进行原生质体的制备，参照上述拟南芥和玉米原生质体的制备方法，利用油莎豆叶片进行原生质体制备时，发现油莎豆叶片细胞数少且栅栏组织较难裂解，原生质体释放量少、完整性差，无法满足后续试验要求。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种油莎豆原生质体的制备方法。该制备方法结合油莎豆自身的形态结构和生理生长特点，探索出适用于油莎豆原生质体制备的最佳组织材料，为油莎豆基因功能研究、品种遗传改良等提供一定技术和材料支撑。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.一种油莎豆原生质体的制备方法，包括以下步骤：
8.(1)分别选取长势好、健壮一致的油莎豆幼嫩根、芽、叶片、茎、匍匐茎和分蘖节6个不同组织；
9.(2)选用锋利的刀片快速将步骤(1)中所取的组织切成0.5-1mm宽的细条或薄片，然后迅速将所述细条或薄片转移至盛有酶解液的12孔细胞培养板中，使其完全沉浸于酶解液中；
10.(3)将步骤(2)中的细胞培养板置于摇床上，避光酶解；
11.(4)将步骤(3)中酶解后的酶解液用w5溶液浸湿的800目的尼龙网筛过滤，过滤后将残渣夹回原生质体容器中，然后用适量体积w5溶液洗涤后再次过滤，重复3-5次，直至将残渣充分洗涤，原生质体全部过滤干净，最后再用1000目尼龙网将滤液重复过滤2-3次，得最终滤液；
12.(5)将步骤(4)中所得的最终滤液进行离心，得上清液和油莎豆原生质体沉淀，倒掉所述上清液，用w5溶液稀释重悬所述原生质体沉淀，得所述油莎豆原生质体。
13.进一步的，所述步骤(1)中选取6个不同组织的具体方法为：将油莎豆块茎置于30℃无菌水中浸种48h后，移至沙土中于光照培养箱培养，待油莎豆芽长为0.5-1.0cm时，取其幼嫩的根和芽；幼嫩叶片和茎取于发芽7-10天的油莎豆苗；分蘖节取于发芽15-18天的油莎豆苗；油莎豆匍匐茎伸长初期，取长度为0.5-1.0cm的幼嫩匍匐茎。
14.进一步的，所述步骤(2)中选取的组织为分蘖节。
15.进一步的，所述步骤(2)中刀片切组织的方法为：首先将刀片用75％乙醇消毒；然后在切前将油莎豆植株外部老叶及叶鞘拨除，再用消毒后的刀片切取消毒后的刀片切露出的幼嫩分蘖节。
16.进一步的，所述步骤(2)中酶解液的制备方法为：首先，将加入质量体积比为0.5-2.0％纤维素酶、质量体积比为0.3-1.2％离析酶、100mm 2-(n-吗啡啉)乙磺酸和质量体积比为8％-12％甘露醇的容器进行水浴加热8-10min；然后冷却至室温加入0.1％牛血清蛋白和1mm氯化钙，再用ddh2o定容后将ph调制至5.2-6.6；最后用0.45μm滤膜过滤灭菌，即得所述酶解液。
17.进一步的，所述纤维素酶质量体积比为2％、离析酶质量体积比为0.9％、甘露醇质量体积比为11％；所述ph为6.0。
18.进一步的，所述步骤(3)中摇床的工作条件为20-30℃，转速为30-50rpm。
19.进一步的，所述步骤(3)中避光酶解的时间为2-12h。
20.进一步的，所述避光酶解的时间为6h。
21.进一步的，所述步骤(4)中w5溶液的制备方法为：首先将154mm氯化钠、125mm氯化钙、5mm氯化钾和2mm 2-(n-吗啡啉)乙磺酸溶于水中，得混合溶液，然后用氢氧化钾将所述混合溶液的ph调至5.8，即得所述w5溶液。
22.进一步的，所述步骤(5)中离心的转速为600-900rpm，离心时间为5-6min。
23.与现有技术相比，本发明具备的积极有益效果在于：
24.(1)不同组织材料细胞结构和数目不同，原生质体在酶解时释放的难易程度和数量存在差异，本发明在制备油莎豆原生质体时选取的分蘖节组织分生能力强、细胞数多、无“空腔”结构，酶解分离的原生质体效果最佳。植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶等组分构成，但不同植物间各组分比例不同。纤维素酶能够酶解纤维素；离析酶是复合酶，能够酶解半纤维素和果胶。利用纤维素酶和离析酶进行酶解分离原生质体时，酶组合浓度比例会影响原生质体释放量，通过本发明实施例中的试验可以证明质量体积比为2％纤维素酶+质量体积比为0.9％离析酶组合时，油莎豆原生质体制备的效果最佳。适宜的酶解时间对原生质体制备十分关键，酶解时间短则酶解不彻底，酶解时间长会对原生质体产生伤害，原生质体易破碎，通过本发明实施例中的试验可以证明酶解时间为6h时，油莎豆原生质体制备的效果最佳。酶解液的ph值对维持质膜的稳定性及酶的活性起到重要作用，ph值过高
会导致原生质体失水皱缩，ph值过低则会使其涨破失活，通过本发明实施例中的试验可以证明ph为6.0时，合时，油莎豆原生质体制备的效果最佳。甘露醇作为酶解液渗透压稳定剂，浓度的高低影响渗透压，而渗透压过低或过高会导致原生质体受到渗透胁迫毒害，进而影响原生质体的产量，通过本发明实施例中的试验可以证明甘露醇浓度为11％时，油莎豆原生质体制备的效果。
25.(2)本发明建立了一套高效的油莎豆原生质体制备体系，克服了油莎豆叶片原生质体制备效率低、完整性差的难题，能够制备出大量的高质量油莎豆原生质体，为油莎豆后期原生质体培养、融合、瞬时转化体系的建立、遗传性状改良和分子育种等研究领域提供了技术支持。
附图说明
26.图1是本发明实施例1中以油莎豆分蘖节为组织制备的油莎豆原生质体；
27.图2是本发明实施例2中不同组织材料对油莎豆原生质体产量的影响图；
28.图3是本发明实施例3不同酶组合对油莎豆原生质体产量的影响图；
29.图4是本发明实施例4不同酶解时间对油莎豆原生质体产量的影响图；
30.图5是本发明实施例5不同甘露醇浓度对油莎豆原生质体产量的影响图；
31.图6是本发明实施例6不同酶解液ph对油莎豆原生质体产量的影响图。
具体实施方式
32.以下实施例便于更好地理解本发明，但不限定本发明。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规方法，所用的试剂、耗材等如无特殊说明，均可通过商业途径得到。
33.实施例1
34.(1)选取长势好、健壮一致的油莎豆的块茎于30℃无菌水中浸种48h后，移至沙土中于光照培养箱培养，待油莎豆发芽15-18天，取分蘖节，现用现取，保证细胞活力；
35.(2)选用锋利的刀片，用75％乙醇消毒后，将油莎豆植株外部老叶及叶鞘拨除，露出幼嫩分蘖节，并快速将其切成0.5-1mm厚的薄片，称取0.2g切好的薄片迅速转移至盛有4ml酶解液的12孔细胞培养板中，使其完全沉浸于酶解液中；
36.本实施例中酶解液的配制方法如下：首先将质量体积比为2.0％纤维素酶、质量体积比为0.9％离析酶、100mm 2-(n-吗啡啉)乙磺酸和质量体积比为11％甘露醇加入容器中，然后将加入以上试剂后的容器置于40-50℃水浴加热8-10min，冷却至室温后加入0.1％牛血清蛋白和1mm氯化钙，最后，用ddh2o定容后ph调至6.0，用0.45μm滤膜过滤灭菌，即得所述酶解液，现用现配。
37.(3)将步骤(2)中的细胞培养板置于25℃，40rpm的摇床上，避光酶解6h；
38.(4)将步骤(3)所得酶解液用w5溶液浸湿的800目的尼龙网筛过滤，过滤后将残渣夹回原生质体容器中，用适量体积w5溶液洗涤后再次过滤，重复3次，直至将残渣充分洗涤，原生质体全部过滤干净，最后再用1000目尼龙网将滤液重复过滤2次，以便更好的去除细胞碎片，得最终滤液；
39.本实施例中w5溶液配制方法如下：首先将154mm氯化钠、125mm氯化钙、5mm氯化钾
和2mm 2-(n-吗啡啉)乙磺酸溶于水中，得混合溶液，然后用氢氧化钾将所述混合溶液的ph调至5.8，即得所述w5溶液。
40.(5)将步骤(4)中所得的最终滤液以800rpm的转速离心5-6min，得上清液和油莎豆原生质体沉淀，小心倒掉所述上清液，用w5溶液稀释重悬所述原生质体沉淀，得所述油莎豆原生质体。
41.首先，采用血球计数板法来计算所得油莎豆原生质体的产量，计算公式为：原生质体产量(个/g)＝25个中方格(血球计数板里面中方格的个数，以下实施例相同)内原生质体总数/0.1
×
1000
×
稀释倍数/酶解材料质量，本实施例所得的原生质体产量为22.91
×
105个/g；然后采用荧光染料荧光素双醋酸酯(fda)进行原生质体活力测定，具体测定方法如下：fda用丙酮溶液配成1mg/ml的工作液，-20℃保存，取10μl酶解后的原生质体，向其中加入1μl fda储存液(即终浓度为0.01％)，混合均匀后静止5min，将染色后的原生质体用血球计数板制片，于荧光显微镜下观察，有活力的油莎豆原生质体呈白色荧光亮点，具体如图1所示。
42.实施例2
43.本实施例与实施例1的区别仅在于：步骤(1)中选取的油莎豆组织不同，以及步骤(2)中酶解液中离析酶浓度、甘露醇浓度、ph不同，其他步骤与实施例1完全相同。本实施例的步骤(1)：将油莎豆的块茎于30℃置于无菌水中浸种48h后，移至沙土中于光照培养箱培养，选取长势好、健壮一致的油莎豆幼嫩根、芽、叶片、茎、匍匐茎和分蘖节6个组织，待油莎豆芽长为0.5-1.0cm时，取其幼嫩的根和芽；幼嫩叶片和茎取于发芽7-10天的油莎豆苗；分蘖节取于发芽15-18天的油莎豆苗；油莎豆匍匐茎伸长初期，取长度为0.5-1.0cm的幼嫩匍匐茎。所有材料均现用现取。步骤(2)酶解液的配制方法如下：质量体积比为1.5％纤维素酶、质量体积比为0.9％离析酶，100mm 2-(n-吗啡啉)乙磺酸和质量体积比为10％甘露醇，加入以上试剂后40-50℃水浴加热8-10min，冷却至室温后加入0.1％牛血清蛋白，1mm氯化钙，ddh2o定容后ph调至5.8，用0.45μm滤膜过滤灭菌，现用现配。6个不同油莎豆组织分别按照实施例1中的步骤(2)-(5)进行原生质体的制备。
44.本实施例的结果表明，取材组织不同对油莎豆原生质体的制备效果影响不同，具体如图2所示，6个不同组织所制备的原生质体产量从高到低依次为：分蘖节》匍匐茎》茎》叶》根》芽，说明分蘖节是油莎豆原生质体制备的最佳材料。
45.实施例3
46.本实施例与实施例1的区别仅在于：步骤(2)中酶解液中的纤维素酶和离析酶的质量体积比为不同，且甘露醇质量体积比为10％，酶解液ph为5.8，其他步骤与实施例1完全相同。本实施例步骤(2)中酶解液中的不同浓度的纤维素酶和离析酶组合具体如表1所示。
47.表1酶解液中不同浓度纤维素酶和离析酶的组合
48.酶组合编号纤维素酶质量体积比(％)离析酶质量体积比(％)10.50.320.50.630.50.940.51.251.00.3
61.00.671.00.981.01.291.50.3101.50.6111.50.9121.51.2132.00.3142.00.6152.00.9162.01.2
49.通过采用表1中不同质量体积比的纤维素酶和离析酶组合的酶解液进行油莎豆原生质体的制备时，会对油莎豆原生质体的产量产生不同的影响，具体结果如图3所示，结果表明纤维素酶在油莎豆原生质体制备过程中起主要作用，随着纤维素酶质量体积比的升高，原生质体产量显著增加；离析酶质量体积比对原生质体的产量也有一定影响，随着离析酶浓度的升高原生质体产量呈现先增加后降低的趋势，最适合油莎豆原生质体制备的酶组合是质量体积比为2.0％纤维素酶+质量体积比为0.9％离析酶。
50.实施例4
51.本实施例与实施例1的区别仅在于：步骤(2)酶解液中甘露醇质量体积比为10％，ph为5.8，步骤(3)中避光酶解时间不同，其他步骤与实施例1完全相同。本实施例中步骤(3)中避光酶解的时间分为以下6个梯度，分别为2h、4h、6h、8h、10h和12h。通过采用不同的避光酶解时间进行油莎豆原生质体的制备时，会对油莎豆原生质体的产量产生不同的影响，具体结果如图4所示，结果表明，避光酶解时间6h以内，油莎豆分蘖节原生质体产量随着酶解时间的增加而逐渐提高，之后呈现下降逐渐趋势，因此，6h为制备油莎豆原生质体最佳的避光酶解时间。
52.实施例5
53.本实施例与实施例1的区别仅在于：步骤(2)中酶解液中的甘露醇质量体积比不同，酶解液ph为5.8，其他步骤与实施例1完全相同。本实施例中步骤(2)中甘露醇浓度分为以下5个梯度，分别为8％，9％，10％，11％和12％。通过采用不同浓度甘露醇的酶解液进行油莎豆原生质体的制备时，会对油莎豆原生质体的产量产生不同的影响，具体结果如图5所示，结果表明，油莎豆分蘖节原生质体产量随着甘露醇浓度的增加而逐渐升高，当甘露醇浓度为11％时，原生质体产量达到最高，之后呈现下降逐渐趋势。因此，11％为制备油莎豆原生质体最适的甘露醇浓度。
54.实施例6
55.本实施例与实施例1的区别仅在于：步骤(2)中酶解液ph不同，其他步骤与实施例1完全相同。本实施例中步骤(2)中酶解液ph分为以下8个梯度，分别为5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4和6.6。通过采用ph酶解液进行油莎豆原生质体的制备，具体结果如图6所示，结果表明，油莎豆分蘖节原生质体产量随着酶解液ph的升高，呈现先增加后降低的趋势，当酶解液ph为6.0时，原生质体产量达到最高，之后呈现下降逐渐趋势。因此，6.0为制备油莎
豆原生质体最适酶解液ph。
56.综上所述，以油莎豆分蘖节为原生质体制备材料，酶液组合为质量体积比为2.0％纤维素酶+质量体积比为0.9％离析酶，酶解时间为6h，甘露醇质量体积比为11％，酶解液ph为6.0，油莎豆原生质体的产量最高。
57.以上已用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在同等参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。因此，在不偏离本发明的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护范围。