技术特征：
1.一种油莎豆原生质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)分别选取长势好、健壮一致的油莎豆幼嫩根、芽、叶片、茎、匍匐茎和分蘖节6个不同组织；(2)选用锋利的刀片快速将步骤(1)中所取的组织切成0.5-1mm宽的细条或薄片，然后迅速将所述细条或薄片转移至盛有酶解液的12孔细胞培养板中，使其完全沉浸于酶解液中；(3)将步骤(2)中的细胞培养板置于摇床上，避光酶解；(4)将步骤(3)中酶解后的酶解液用w5溶液浸湿的800目的尼龙网筛过滤，过滤后将残渣夹回原生质体容器中，然后用适量体积w5溶液洗涤后再次过滤，重复3-5次，直至将残渣充分洗涤，原生质体全部过滤干净，最后再用1000目尼龙网将滤液重复过滤2-3次，得最终滤液；(5)将步骤(4)中所得的最终滤液进行离心，得上清液和油莎豆原生质体沉淀，倒掉所述上清液，用w5溶液稀释重悬所述原生质体沉淀，得所述油莎豆原生质体。2.根据权利要求1所述的一种油莎豆原生质体的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中选取6个不同组织的具体方法为：将油莎豆块茎置于30℃无菌水中浸种48h后，移至沙土中于光照培养箱培养，待油莎豆芽长为0.5-1.0cm时，取其幼嫩的根和芽；幼嫩叶片和茎取于发芽7-10天的油莎豆苗；分蘖节取于发芽15-18天的油莎豆苗；油莎豆匍匐茎伸长初期，取长度为0.5-1.0cm的幼嫩匍匐茎。3.根据权利要求1所述的一种油莎豆原生质体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中选取的组织为分蘖节。4.据权利要求1所述的一种油莎豆原生质体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中刀片切组织的方法为：首先将刀片用75％乙醇消毒；然后在切前将油莎豆植株外部老叶及叶鞘拨除，再用消毒后的刀片切取消毒后的刀片切露出的幼嫩分蘖节。5.根据权利要求1所述的一种油莎豆原生质体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中酶解液的制备方法为：首先，将加入质量体积比为0.5-2.0％纤维素酶、质量体积比为0.3-1.2％离析酶、100mm 2-(n-吗啡啉)乙磺酸和质量体积比为8％-12％甘露醇的容器进行水浴加热8-10min；然后冷却至室温加入0.1％牛血清蛋白和1mm氯化钙，再用ddh2o定容后将ph调制至5.2-6.6；最后用0.45μm滤膜过滤灭菌，即得所述酶解液。6.根据权利要求5所述的一种油莎豆原生质体的制备方法，其特征在于，所述纤维素酶质量体积比为2％、离析酶质量体积比为0.9％、甘露醇质量体积比为11％；所述ph为6.0。7.根据权利要求1所述的一种油莎豆原生质体的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中摇床的工作条件为20-30℃，转速为30-50rpm。8.根据权利要求1所述的一种油莎豆原生质体的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中避光酶解的时间为2-12h。9.根据权利要求1所述的一种油莎豆原生质体的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中w5溶液的制备方法为：首先将154mm氯化钠、125mm氯化钙、5mm氯化钾和2mm 2-(n-吗啡啉)乙磺酸溶于水中，得混合溶液，然后用氢氧化钾将所述混合溶液的ph调至5.8，即得所述w5溶液。10.根据权利要求1所述的一种油莎豆原生质体的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)
中离心的转速为600-900rpm，离心时间为5-6min。
技术总结
本发明公开了一种油莎豆原生质体的制备方法，包括以下步骤：(1)分别油莎豆幼嫩根、芽、叶片、茎、匍匐茎和分蘖节6个不同组织；(2)快速将所述组织切成细条或薄片，然后迅速将其转移至盛有酶解液的细胞培养板中，使其完全沉浸于酶解液中；(3)将细胞培养板置于摇床上，避光酶解；(4)将酶解后的酶解液用尼龙网筛过滤，过滤后将残渣夹回原生质体容器中，然后用W5溶液洗涤后再次过滤，直至将残渣充分洗涤，最后再用尼龙网将滤液重复过滤得最终滤液；(5)将最终滤液进行离心，倒掉所述上清液，用W5溶液稀释重悬所述原生质体沉淀，得所述油莎豆原生质体。本发明的制备方法有效地解决了油莎豆原生质体制备效率低、完整性差的难题。完整性差的难题。完整性差的难题。
技术研发人员：张向歌 王会伟 朱雅婧 李春鑫 王艳 李居政 王晓青
受保护的技术使用者：河南省农业科学院经济作物研究所
技术研发日：2022.09.16
技术公布日：2022/11/29