一种引物、探针、组合物、层析试纸及制备方法、试剂盒与流程

一种引物、探针、组合物、层析试纸及制备方法、试剂盒
1.技术领域
2.本技术涉及一种生物检测技术领域，更具体地说，尤其涉及一种引物、探针、组合物、层析试纸及制备方法、试剂盒。


背景技术：

3.新型冠状病毒肺炎( coronavirus disease 2019, covid-19)由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（the novel severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,sars-cov-2）引起，新冠的全球传播对各个国家构成了多方面威胁。
4.sars-cov-2是一种具有30 kb基因组的正链单链rna病毒，其形态为圆形或椭圆形，直径约60-140nm，在电镜下可观察到包膜上存在的刺突糖蛋白。
5.sars-cov-2基因组的前端为编码16种非结构蛋白的orf1ab区域，其余部分编码几种辅助蛋白和四种结构蛋白，包括刺突 (spike,s) 糖蛋白、包膜 (envelope,e)、基质 (matrix,m) 和核衣壳蛋白 (nucleocapsid,n) ，它们对于维持新冠病毒的结构完整性有着重要意义。
6.根据sars-cov-2的全基因组序列，国家卫健委推荐新冠病毒的三个特异性区域（orf1ab基因、n基因和e基因）适合作为pcr扩增区域。
7.mira（multienzyme isothermal rapid amplification, mira）是一种混合多种酶的核酸恒温扩增技术，基础型的mira法试剂盒主要包括以下几种酶：
①
能够与寡核苷酸（即引物、探针）形成复合物并带领引物探针找到匹配模板的重组酶；
②
单链结合蛋白（ssb）；
③
能够进行单链置换的dna聚合酶；
④
用以识别四氢呋喃修饰位点具有核酸内切酶活性的endonuclease iv（nfo酶）。同时，由于新冠病毒为rna病毒，其在扩增过程中又加入了反转录酶步骤。
8.申请人经过文献调研，发现以下文献：文献1：cn112831600a提供了一种检测sars-cov-2病毒的引物探针组合，所述检测sars-cov-2病毒的引物探针组合特异性扩增并检测sars-cov
‑ꢀ
2病毒的orf1ab基因、n基因或e基因中的任意一种或至少两种的组合。
9.文献2：cn111733293a提供了一种检测sars-cov-2的双链引物探针，所述双链引物探针包括用于检测sars-cov-2病毒的orf1ab、n和e基因序列的特异性引物探针。本发明采用双链引物探针来减少引物自身形成茎环结构或引物之间形成二聚体的机率，使得pcr扩增效率达到一致，从而解决了多重pcr之间的竞争性抑制，实现了sars-cov-2病毒orf1ab、n和e多个靶基因的单管同时检测。
10.文献3：kr20220004468a用pna探针同时诊断sars-cov-2和引起冠状病毒感染19的salvecovirus的方法和试剂盒。
11.文献4：cn113817868a提供了一种用于检测新型冠状病毒及其变异株的引物、探针
组合物及试剂盒。
12.文献5：cn111534641a提供了一种核酸检测试剂盒、检测方法及应用。
13.申请人在先申请“2022110650049”提出了一种核酸检测装置，其设计思路是在反应仓中预先设置有扩增体系，样本在反应仓中进行扩增；然后得到的扩增产物流动到层析试纸上来显示结果，其要求是在：尽可能短的时间内完成扩增，显示结果。
14.申请人基于检索式：“层析试纸 ande基因”，发现了现有技术cn112981008a，该技术采用了rpa扩增技术，其可在37-42℃的条件下需要20分钟实现靶标基因的扩增；然而，对于家庭环境，20分钟的测量时间仍然偏长。同时，灵敏度也是核酸检测的核心指标，灵敏度越高，意味着初阳人员也能检验出来。
15.因此，结合实际使用，本技术的研发目标是研发适合的引物、探针、层析试纸，以便完成下述目标：1）恒温扩增时间指标：控制在10分钟；2）灵敏度指标：扩增体系内的样本在100copies/ml，也能有较高的检出率。


技术实现要素：

16.本技术的目的在于针对上述现有技术的不足，提供一种引物、探针、组合物、层析试纸及制备方法、试剂盒。
17.本技术的技术方案是：一种用于检测2019-ncove基因的引物，其核苷酸序列为：上游引物序列：cgtttcggaagagayaggtacgttaatagt(seq id no.1)；下游引物序列：[5
’‑
biotin]-agatcaggaactctagaagaattcagattttta(seq id no.2)。
[0018]
一种用于检测2019-ncove基因的探针，其核苷酸序列为：探针序列：[5’fam]-tcgattgtgtgcgtactgctgcaatattgt[thf]aacgtgagtcttgt-[3’c3spacer] (seq id no.3)。
[0019]
一种用于检测2019-ncove基因的引物探针组合，所述检测sars-ncov病毒的引物探针组合特异性扩增并检测sars-ncov病毒的e基因；扩增所述e基因的特异性引物对包括seq id no.1～2所示的核苷酸序列，检测所述e基 因的探针包括seq id no.3所示的核苷酸序列。
[0020]
进一步，所述引物有一个修饰位点：下游引物5’端标记生物素（biotin）；所述探针有四个修饰位点：探针5’端标记fam；探针距离5’端约30nt、距离3’端约15nt位置设置一个四氢呋喃（thf)修饰位点；探针3’端进行c3-spacer修饰。
[0021]
一种试剂盒，所述试剂盒包括前述的组合物。
[0022]
一种试剂盒，其用于检测2019-ncov，所述试剂盒包括：扩增反应液、酶冻干粉及层析试纸；所述扩增反应液中包含：缓冲液
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29.4μl10μm上游引物
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2μl
10μm下游引物
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2μl10μm探针
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0.6μldepc-h2o
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3.5μl激活剂
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2.5μl总rna
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10μl；上游引物序列为：cgtttcggaagagayaggtacgttaatagt；下游引物序列为：[5
’‑
biotin]-agatcaggaactctagaagaattcagattttta；探针序列：[5’fam]-tcgattgtgtgcgtactgctgcaatattgt[thf]aacgtgagtcttgt-[3’c3spacer]；所述层析试纸为前述的层析试纸。
[0023]
进一步，所述的缓冲液采用ph=7.0的tris-hcl缓冲液。
[0024]
一种层析试纸，包括pvc底板、样品垫、结合垫、检测垫、吸水垫；样品垫、结合垫、检测垫、吸水垫沿着溶液流动方向依次布置在所述底板上，样品垫与结合垫部分重合，结合垫与检测垫部分重合，吸水垫与检测垫部分重合；结合垫与检测垫重合1mm，吸水垫与检测垫重合1mm；其中，所述结合垫中包含：fam抗体-显色颗粒复合物、dnp-显色颗粒复合物，所述fam抗体-显色颗粒复合物经由显色乳胶微球与fam抗体混合反应形成；所述dnp-显色颗粒复合物经由显色乳胶微球与dnp混合反应形成；其中，所述检测垫包括硝酸纤维素膜，在检测垫上设置检测区域、、质控区域；检测区域经由链霉亲和素加载在硝酸纤维素膜上形成；质控区域其经由对dnp抗体加载在硝酸纤维素膜上形成。
[0025]
进一步，dnp抗体由dnp多克隆抗体与磷酸缓冲液组成。
[0026]
进一步，所述的显色颗粒均为红色乳胶微球。
[0027]
进一步，所述乳胶微球粒径为400nm。
[0028]
一种层析试纸的制备方法，包括如下步骤：第一步骤，制备显色颗粒溶液，将显色颗粒溶液与fam抗体混合反应形成fam抗体-显色颗粒复合物，将显色颗粒溶液与dnp混合反应形成dnp-显色颗粒复合物，将fam抗体-显色颗粒复合物、dnp-显色颗粒复合物加载到结合垫上；第二步骤，链霉亲和素和dnp抗体分别加载在检测垫上的检测区域和质控区域；第三步骤，制备试纸大板：样本垫、结合垫、检测垫、吸水垫依次布置在pvc底板上形成试纸大板；其中，结合垫与检测垫两者部分重合，吸水垫与检测垫两者部分重合；第四步骤，制备层析试纸，将步骤三中制备的试纸大板进行裁切，制备成检测试纸。
[0029]
本技术的有益效果在于：第一，本技术的基础构思是设计一种引物、探针，其能够在恒温状态下（40℃～50℃），在10min内即可对2019-ncov的e基因进行扩增以及标识。
[0030]
基础构思的难点主要体现在：初始设计时，研发团队也是采用现有的引物探针设
计软件来进行设计、测试。但是，在经过大量的测试后，发现无法得到满意的结果。
[0031]
其关键因素是：基于扩增温度、扩增时间的要求，本技术的引物的长度是30-35nt，探针的长度在46-52nt；而常规的设计软件均是基于npcr技术，其引物的长度18-22nt，探针的25-35nt。
[0032]
同时，e基因恒温扩增，也是现有技术中未曾设计的: himmpat数据库中“恒温扩增 e基因
”ꢀ
检索结果为2， 而“恒温扩增 n基因”检索结果为24（仅仅检索中国发明申请）。也即，恒温扩增技术是一种技术人员已知的技术，将其应用到e基因中，是需要打破现有知识的偏见。而究其原因，之所以e基因研究恒温扩增的技术偏少，是因为e基因的全长仅约228bp，对引物探针的设计局限性强，同时e基因的突变率较高于n、o基因，上述原因使得没有合适的引物探针来完成e基因的扩增。
[0033]
也即，需要克服了现有设计思想、设计工具带来的技术偏见，才能得到本技术的引物、探针设计。
[0034]
第二，本技术的第二个发明点在于：根据sars-cov-2的包膜蛋白基因（后简称新e基因）的保守核酸序列进行恒温扩增的上下游引物、探针的设计，同时因引物扩增后产物使用试纸条进行检测，所以对引物、探针进行了不同的特定核苷酸修饰，主要修饰包括：（1）下游引物5’端标记生物素（biotin），用于与试纸条硝酸纤维素膜上的t线链霉亲和素结合；（2）探针5’端标记fam，用于与试纸条结合垫中的fam抗体偶联微球结合；（3）探针距离5’端约30nt、距离3’端约15nt位置设置一个四氢呋喃（thf)修饰位点，用以nfo酶识别和酶切；（4）探针3’端进行c3-spacer修饰，防止探针过早进行非特异性扩增。
[0035]
第三，本技术的第三个发明点是经过灵敏性试验研究，表明：本技术的引物探针组合、层析试纸的配合设计，最低检测限可低于200copies/ml。对于初阳、无症状人员而言，也能检测出来。
[0036]
对于灵敏度试验而言，虽然部分研究如：cn111334611a采用了rna恒温扩增+胶体金层析试纸，宣称其也能实现e基因的rna拷贝的最低检测限为100拷贝/ml，但是这一现有知识事实上可到了相反的技术启示。原因是申请人按照该文献的做法进行大量重复试验，发现：其灵敏度至少在1000拷贝/ml。作为公知的知识，检测的基因数越多，灵敏度越高；cn111334611a同时检测三种基因，灵敏度仍然能达到100copies/ml是存疑的；按照研发人员的认识，现有技术中及时仅仅检测一种e基因，灵敏度达到100copies/ml都是未曾实现过。
[0037]
因此，从灵敏度角度出发，现有技术给出了相反的技术启示：申请人不断的重复试验，初始认为是试验有误，因而导致无法得到文献的结果。同时，上述试验无法重复，导致申请人一度放弃恒温检测+层析试纸检测的研发。
[0038]
第四，本技术的第四个发明点在于：本技术提出了适配的层析试纸条。
附图说明
[0039]
下面结合附图中的实施例对本技术作进一步的详细说明，但并不构成对本技术的任何限制。
[0040]
图1是本技术的验证性实验一的测试结果。
[0041]
图2是本技术的验证性实验二的测试结果。
[0042]
图3是本技术的特异性试验的测试结果。
[0043]
图4是本技术的层析试纸的设计示意图。
[0044]
附图标记说明如下：样品垫101；结合垫102；检测垫103；吸水垫104；检测区域201；质控区域202。
具体实施方式
[0045]
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
[0046]
《研发要求》本技术的引物、探针设计，其应用到层析试纸上，主要应用环境是家庭等场所，其没有pcr仪等大型设备。
[0047]
因此，研发的重点在于：（1）在层析试纸上应用，本技术的引物探针必须要保证快速、高效、特异性地对目的片段进行扩增，扩增时间不能超过10min，最低检测拷贝数在200 copies/ml；采用层析试纸，仅根据显色情况便可进行结果判断。
[0048]
（2）由于应用在层析试纸上，扩增过程变温不能过于复杂，反应温度要控制在40℃～50℃之间（试验设备较小，无法支持高温扩增）。
[0049]
恒温扩增有rpa、raa、lamp、mira多种方式；在项目预研阶段，检索了“raa orlampormira
”ꢀ
and
ꢀ“
e基因”，并未发现上述“扩增时间在10min+最低检测拷贝数在100 copies/ml”的技术方案。例如：cn112981008a采用的是rpa方法，但是，该方法需要的扩增时间要在20min，最低检测拷贝数在1000copies/ml（测试cn112981008a方法所得）。
[0050]
也即，恒温扩增技术应用在e基因上，扩增时间缩短到10min，缺少经验。
[0051]
（3）灵敏度则是更具挑战的一个方面。对于灵敏度而言，项目初始研发阶段是想通过延长扩增时间的方式来提升灵敏度。但是事实上这一方式并不能达到要求，即在一定时间范围内，延长扩增时间的方式确实能提升灵敏度；但是超过一定范围后，就没有多大作用了。
[0052]
从项目初始研发阶段可知晓：满足“扩增时间不能超过10min，最低检测拷贝数在100 copies/ml”这两个指标，是个巨大的难题。特别得，扩增时间和灵敏度这两个指标在一定阶段是两个相互关联限制的指标。
[0053]
基于上述分析，项目研发的重点在于：不论是扩增时间、还是灵敏度，通过前述分析可知，现有的技术知识是无法满足的。因此，研发团队选择mira技术作为恒温扩增技术，意图通过：1）设计以及优化恒温扩增的引物探针；2）设计以及优化层析试纸，来满足项目要求。
[0054]
也即，本技术研发面临的挑战同时来自于引物、探针和层析试纸的设计优化上。
[0055]
《实施例一、研发方案》第一，根据sars-cov-2病毒两端e基因保守序列设计下述引物探针：上游引物序列：cgtttcggaagagayaggtacgttaatagt下游引物序列：[5
’‑
biotin]-agatcaggaactctagaagaattcagattttta探针序列：[5’fam]-tcgattgtgtgcgtactgctgcaatattgt[thf]aacgtgagtcttgt-[3’c3spacer]第二，层析试纸结合附图4所示，一种核酸检测层析试纸，包括pvc底板、样品垫101、结合垫102、检测垫103、吸水垫104；样品垫101、结合垫102、检测垫103、吸水垫104沿着溶液流动方向依次布置在所述底板上（搭接），样品垫101与结合垫102部分重合，结合垫102与检测垫103部分重合，吸水垫104与检测垫103部分重合；结合垫102与检测垫103重合1mm，吸水垫104与检测垫103重合1mm。
[0056]
其中，所述结合垫102中包含：fam抗体-显色颗粒复合物、dnp-显色颗粒复合物，所述fam抗体-显色颗粒复合物经由显色乳胶微球与fam抗体混合反应形成；所述dnp-显色颗粒复合物经由显色乳胶微球与dnp混合反应形成；所述的显色颗粒均为红色乳胶微球，所述乳胶微球粒径为400nm。
[0057]
其中，所述检测垫103包括硝酸纤维素膜。在检测垫上设置检测区域201（即t线）、质控区域202（即c线）。检测区域201，其经由链霉亲和素加载在硝酸纤维素膜上形成；质控区域202其经由对dnp抗体加载在硝酸纤维素膜上形成（dnp抗体由dnp多克隆抗体与磷酸缓冲液组成）。
[0058]
作为一种全新的层析试纸，其制备方法是：第一步骤，制备显色颗粒溶液，将显色颗粒溶液与fam抗体混合反应形成fam抗体-显色颗粒复合物，将显色颗粒溶液与dnp混合反应形成dnp-显色颗粒复合物，将fam抗体-显色颗粒复合物、dnp-显色颗粒复合物加载到结合垫上；第二步骤，链霉亲和素和dnp抗体分别加载在检测垫上的检测区域（即t线）和质控区域（即c线）；第三步骤，制备试纸大板：样本垫、结合垫、检测垫、吸水垫依次布置在pvc底板上形成试纸大板；其中，结合垫与检测垫两者部分重合，吸水垫与检测垫两者部分重合；第四步骤，制备层析试纸，将步骤三中制备的试纸大板进行裁切，制备成检测试纸。
[0059]
层析试纸的作用机理为：若有sars-cov-2病毒，其e基因在经过扩增体系后会产生扩增产物；扩增产物首先与样本垫结合，然后经过结合垫，其在经过结合垫时，扩增产物的fitc标签（即fam）与fam抗体-显色颗粒复合物结合；再经过检测垫：经过检测区域时，扩增产物的另一端生物素标签会和检测区上的链霉亲和素结合使t线显色（t线显色的要求是：扩增产物的一端与要和fam抗体-显色颗粒
复合物连接，另外一端与链霉亲和素结合）；经过质控区域，溶液在经过结合垫时，必然会混入dnp-显色颗粒复合物，溶液在层析试纸流动的时候，经过质控区域时，dnp-显色颗粒复合物会与dnp抗体结合，c线显色。其优点在于c线的显色不受模板浓度的影响，为独立的质控体系，若没采样独立质控体系，当模板浓度较高时，c线会不显色，判定试纸无效。
[0060]
因此，层析试纸会产生如下四种情况：t线显色、c线不显色，表示：无效；t线不显色、c线不显色，表示：无效；t线不显色、c线显色，表示: 阴性 ；t线显色、c线显色，表示：阳性。
[0061]
《验证性实验一》制备样本使用申请人自制的核酸提取试剂盒（磁珠法）对新冠e基因假病毒（拷贝数约2
×
108copies/ml）进行核酸提取，提取后e基因核酸分别稀释10、102、103、104、105、106倍后作为阳性模板p1、p2、p3、p4、p5、p6，用以验证引物探针扩增效果。
[0062]
检测体系根据mira法试剂盒（其选购自潍坊安普未来生物科技有限公司），对新冠e基因核酸进行恒温扩增体系配制。配制体系如下表：
模板类型阴性对照p1p2p3p4p5p6模板浓度（copies/ml)02
×
10
72×
10
62×
10
52×
10
42×
10
32×
102缓冲液（μl）29.429.429.429.429.429.429.410μm上游引物(μl)2.02.02.02.02.02.02.010μm下游引物(μl)2.02.02.02.02.02.02.010μm探针(μl)0.60.60.60.60.60.60.6depc-h2o(μl)13.53.53.53.53.53.53.5激活剂(μl)2.52.52.52.52.52.52.5模板(μl)0101010101010
检测程序1）扩增体系粘稠，配制后需在涡旋仪中涡旋震荡混匀20s后再将体系放置于42℃金属浴或其他恒温仪器中，扩增10min；2）待扩增结束后，使用蒸馏水对扩增产物进行稀释20倍。
[0063]
3）产物稀释后，取80μl稀释产物滴加到自制微球法试纸条样品垫上，5-10min读取结果。
[0064]
如图1所示，为验证性实验一的测试结果。结果显示：该组引物、探针对e基因核酸模板的扩增，最低检测限可低于200copies/ml，且未出现非特异性扩增。
[0065]
《验证性实验二》制备样本e基因核酸稀释至200copies/ml，用以验证引物探针对低浓度模板扩增的稳定性。
[0066]
根据mira法试剂盒说明书要求，对新冠e基因核酸进行恒温扩增体系配制。配制体
系如下表（阴性配制4组重复，阳性配制10组重复）。
[0067]
检测体系根据mira法试剂盒，进行如下配置：模板类型阴性对照阳性样本模板浓度（copies/ml)0200缓冲液（μl）29.429.410μm上游引物(μl)2.02.010μm下游引物(μl)2.02.010μm探针(μl)0.60.6depc-h2o(μl)13.53.5激活剂(μl)2.52.5模板(μl)010检测程序1）扩增体系粘稠，配制后需在涡旋仪中涡旋震荡混匀20s后再将体系放置于42℃金属浴或其他恒温仪器中，扩增10min；2）待扩增结束后，使用蒸馏水对扩增产物进行稀释20倍。
[0068]
3）产物稀释后，取80μl稀释产物滴加到本技术的自制微球法试纸条样品垫上，5-10min读取结果。
[0069]
如图2所示，为验证性实验二的测试结果。结果显示：该组引物、探针对e基因核酸模板的扩增，最低检测限可低于200copies/ml，且未出现非特异性扩增。
[0070]
《特异性扩增试验》特异性试验选用：模板：1）阴性模板n：dpec-h2o；2）阴性参考品盘模板：n1：阴性拭子样本；n2：乙型流感yamagata；n3：乙型流感victoria；n4：季节性h1n1流感病毒；n5：eb病毒；n6：肺炎支原体；n7：肺炎衣原体；n8：冠状病毒oc43；n9：冠状病毒 229e；n10：冠状病毒hku1；n11：冠状病毒nl63；n12：腺病毒3型；n13：副流感2型；n14：呼吸道合胞病毒；来进行对比说明。
[0071]
3）阳性模板+：e基因假病毒。
[0072]
反应体系如下（仅仅更换模板）：模板类型浓度模板浓度（copies/ml)2
×
107缓冲液（μl）29.410μm上游引物(μl)2.010μm下游引物(μl)2.010μm探针(μl)0.6depc-h2o(μl)3.5激活剂(μl)2.5
模板(μl)10检测程序同验证性实验一的检测程序。
[0073]
以上模板使用本技术的引物探针组合物进行恒温扩增，从图3的结果可知显示无非特异性扩增反应。
[0074]
以上所举实施例为本技术的较佳实施方式，仅用来方便说明本技术，并非对本技术作任何形式上的限制，任何所属技术领域中具有通常知识者，若在不脱离本技术所提技术特征的范围内，利用本技术所揭示技术内容所作出局部更动或修饰的等效实施例，并且未脱离本技术的技术特征内容，均仍属于本技术技术特征的范围内。