一种I型内含子核酶、其制备方法和在调控RNA成环中的应用与流程

一种i型内含子核酶、其制备方法和在调控rna成环中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种i型内含子核酶、其制备方法和在调控rna成环中的应用。


背景技术：

2.circrnas(circular rnas，环形rna分子)是一类不具有5'末端帽子和3'末端poly(a)尾巴、并以共价键形成环形结构的rna分子。circrna来源于基因的外显子或者内含子区域，在哺乳动物细胞中大量存在。天然存在的circrna由特殊的可变剪切产生，大量存在于真核细胞的细胞质中，但少部分内含子来源的circrna则存在于核酸内，具有一定的组织、时序和疾病特异性。研究表明，circrna广泛存在于人体细胞中，有时甚至超过它们线性异构体的10倍之多，与传统的线型rna(linear rna，含5’和3’末端)不同，circrna分子呈封闭环状结构，不易被核酸外切酶rnaser降解，比线性rna更稳定。目前发现的天然circrna具有高度保守性，部分具有快速的进化性改变；大多数来源于外显子，少部分由内含子直接环化形成。此外，部分circrna分子含mirna应答元件(mirnaresponse element，mre)，可充当竞争性内源rna(competing endogenousrna，cerna)，与mirna结合，在细胞中起到mirna海绵的作用，进而解除mirna对其靶基因的抑制作用，上调靶基因的表达水平。部分circrna可以翻译成蛋白质，大部分是非编码rna。
3.circrna的环状结构能抵抗rnase r的降解而比较稳定，同时，由于其表达的特异性和调控的复杂性，以及在疾病发生中的重要作用，circrna已经成为rna领域的一个研究热点。目前circrna常用体外成环方式主要有两种：t4 rna连接酶连接成环，以及i型内含子自剪接成环。采用t4 rna连接酶法进行连接时，其中一种方式是通过对待成环的核苷酸序列进行二级结构分析，根据分析结果，设计切割位点后加入t4 rna连接酶进行连接。此种环化方式高度依赖线性化rna的二级结构，成环效率低。为提高t4 rna连接酶的circrna成环效率，通常会加入与线性rna末端互补的夹板，拉进两个末端距离，使之形成切口，便于t4 rna连接酶进行连接。但此种成环方式常伴随着其他的分子间的连接反应，反应副产物较多，目标环状rna的产量降低，同时造成后续纯化回收过程更加繁琐。由于加入夹板链后，夹板链与线性rna链所形成的中间体不稳定，此种方法很难制备较小的环。此外，目前用于circrna自剪接成环的i型内含子核酶为t4 bacteriophage或anabeana的核酶。此类核酶在成环时均需要在线性rna的两段分别添加5’或者3’exon fragment and spacer用于辅助两类核酶成环，这两类核酶在辅助线性rna成环后，会分别引入74和138nt的核苷酸。额外引入的寡核苷酸会改变环状rna的折叠构象，例如，会和环状rna内部的核苷酸序列配对，或所额外引物的外源序列自身形成稳定的双链结构，最终造成将环状rna转入细胞后所引起的天然免疫反应。因此，亟需一种能够在不额外引入核苷酸的前提下，广谱高效的circrna体外成环制备方法。


技术实现要素：

4.针对上述采用t4 rna连接酶法体外制备环状rna存在的环状rna产率低、或需要借助夹板链，副产物繁多，后期纯化处理手段繁琐，以及采用某些i型内含子自剪接核酶导致的额外引入寡核苷酸，导致细胞内天然免疫反应的问题，本发明提供了一种i型内含子核酶、其制备方法和在调控rna成环中的应用。采用该i型内含子核酶体外制备环状rna的制备时，制备方法简单，制备效率高，不额外引入除目标序列之外的多余核苷酸，从而实现环状rna能够被在体外高效制备，同时不引起细胞内天然免疫反应的目的。
5.本发明提供一种i型内含子核酶，其为1)～3)中任意一种：
6.1)核苷酸序列如seq id no.1所示的核酸；
7.2)在seq id no.1所示的核酸中取代、缺失或添加一个或多个核苷酸，且与seq id no.1所示的核酸的调控功能相同或相似的核酸；
8.3)与seq id no.1所示的核苷酸序列具有至少60％同源性的核酸。
9.本发明提供的i型内含子自剪接核酶，其核苷酸长度为387bp，序列如seq id no.1所示，其上游识别位点为u-g不配对碱基对，下游识别位点为t。所述i型自剪接核酶还可以是与seq id no.1所示的核苷酸序列相似性大于60％的核苷酸序列，包括但不限于插入、缺失、重复以及除核心序列外添加额外的序列。
10.本发明还提供了编码所述的i型内含子核酶的dna片段，其核苷酸序列如seq idno.2所示。
11.为了有效地促进rna成环，本发明对所述核酶进行了进一步的改造，提供一种包含所述i型内含子核酶的dna片段的dna表达框。所述dna表达框从5’端到3’端依次包括反义核酸序列(记为anti-sense region)、igs序列、本发明i型内含子核酶、目的靶标序列和anti-sense region的反向互补链，命名为anti-sense region-igs-i型内含子核酶-target orf-anti-sense region的反向互补链。
12.所述igs序列从5’端到3’端依次包括：与目的靶标序列的5’末端部分碱基反向互补的序列、固定序列和与目的靶标序列的3’末端部分碱基反向互补的序列；
13.所述固定序列为碱基g；
14.所述反义核酸序列由20～80个碱基随机组成。
15.本发明中，目的靶标序列为编码待成环rna序列的dna序列。
16.本发明中，所述anti-sense region序列(即反义核酸序列)优选为由40～50个碱基随机组成。所述anti-sense region序列与igs序列之间还包括随机序列1，所述随机序列1由1～20个碱基随机组成，优选为由4～10个碱基随机组成。所述igs序列的长度为8-30bp，优选为13bp；所述与目的靶标序列的5’末端部分碱基反向互补的序列的长度为3～15bp，优选为5-10bp，更优选为7bp；所述固定序列为g；所述与目的靶标序列的3’末端部分碱基反向互补的序列的长度为3～20bp,优选为3-7bp，更优选为5bp。
17.一些具体实施例中，所述igs序列的长度为13bp。具体地，所述igs前7个碱基能够与target orf的最上游7个核苷酸反向互补配对；所述igs序列的后5个碱基与target orf最下游5个碱基反向互补配对；所述的igs序列的第8个碱基为固定序列g。
18.一些实施方案中，所述目的靶标序列和所述anti-sense region的反向互补链之间还包括随机序列2；所述随机序列2由8～30个碱基随机组成，优选为由10～20个碱基随机
组成。
19.本发明中，所述反义核酸序列为随机组成的序列。一些实施方案中，在制备环状rna时，首先将所述的dna表达框插入到骨架载体，获得重组表达载体，然后以重组表达载体为模板，合成线性化rna、成环。在这种情况下，反义核酸序列可以是随机的序列，也可根据插入位点后的骨架载体序列进行设计。根据骨架载体的序列进行设计时，将待插入位点后的骨架载体上的部分序列作为反义核酸序列的反向互补链，反义核酸序列与插入位点后的骨架载体序列反向互补配对，此时，在合成dna表达框时无需再额外增加anti-sense region的反向互补链。
20.igs序列用于5’端剪接位点的识别，能够使不同的rna得以环化，同时促进核酶二级结构的形成。所述igs序列从5’端到3’端依次包括：与目的靶标序列的5’末端部分碱基反向互补的序列、固定序列和与目的靶标序列的3’末端部分碱基反向互补的序列。
21.本发明中，目标rna片段(target orf)末端需为u残基，作为g-u摇摆碱基的5端识别位点。核酶的3’端识别位点为g，是核酶的最后一个碱基，存在于核酶的二级结构中。igs的后6个碱基与目标rna5'端的第2到7个碱基互补，形成稳定的p10螺旋。
22.本发明还提供一种表达载体，包含启动子和本发明所述的dna表达框。所述启动子包括但不限于t7、sp6、t3，进一步的，本发明具体实施例中，采用的启动子为t7启动子；表达载体的载体骨架为真核细胞表达载体，包括但不限于常规载体、慢病毒载体、腺病毒载体或者腺相关病毒载体。
23.本发明还提供了所述的i型内含子核酶、编码所述i型内含子核酶的dna片段、所述的dna表达框以及所述的表达载体，在制备环状rna分子中的应用。
24.本发明还提供一种环状rna分子的制备方法，以本发明所述的dna表达框的线性片段为模板，经体外成环反应，获得环状rna分子。
25.本发明中，所述成环反应的反应体系包括：
[0026][0027][0028]
所述成环反应的程序为：0-70℃下，反应0.5-24h。
[0029]
一些具体实施例中，本发明提供的环状rna分子的制备方法，具体包括：
[0030]
步骤一，获得包含有t7启动子和本发明dna表达框的线性化dna片段。所述线性化dna片段的方法包括但不限于直接合成法、pcr法以及酶切法；所述的线性化dna片段需要经
过胶回收法进行纯化；
[0031]
步骤二，将所述线性化dna片段进行体外成环。所述成环反应体系如下所示：
[0032][0033]
反应体系配好后，室温混匀，置于20-70℃下，反应0.5-24h。优选的，反应温度为37-45℃，反应时间为2-4h。
[0034]
反应完全后，可加入脱氧核糖核酸酶和核糖核酸外切酶进行酶切，去掉反应体系中的模板dna和线性rna。反应液中的环状rna可用醇沉法、氯化锂沉淀法以及柱回收法进行回收及浓缩。
[0035]
本发明提供了一种i型内含子核酶、其制备方法和应用，利用本发明所述的核酶进行体外环状rna的制备，不需要引入额外核苷酸即可获得新型环状rna。基于该种核酶，本发明提供了一种环状rna的制备方法，该方法简单、成环率高，不需要添加额外的长反向互补序列，能够有效降低人工合成环状rna的成本。此外，由于不额外引入额外的核苷酸，有望降低目前人工合成环状rna所引起的细胞天然免疫反应的问题。
附图说明
[0036]
图1示实施例1中i型内含子自剪接核酶及利用该核酶自剪接成circdnmt1的机制；
[0037]
图2示实施例2中circdnmt1的凝胶电泳图(a)与测序图(b)；
[0038]
图3示实施例3中基于i型内含子自剪接核酶的环状rna荧光蛋白gfp表达系统的构建；
[0039]
图4示实施例3中基于i型内含子自剪接核酶的环状rna荧光蛋白gfp剪接位点及剪接机制；
[0040]
图5示实施例3中基于i型内含子自剪接核酶的环状rna荧光蛋白gfp剪接测序结果；
[0041]
图6示基于i型内含子自剪接核酶的环状rna荧光蛋白gfp细胞表达结果图；
[0042]
图7示du145细胞与pc3细胞分别转染基于i型内含子自剪接核酶的circfoxo3后，transwell分析不同组别的细胞迁移效率。a为不同组别细胞的迁移电镜图；b为不同组别du145细胞迁移后的克隆形成数量；c为不同组别pc3细胞迁移后的克隆形成数量。
具体实施方式
[0043]
本发明提供了一种i型内含子核酶、其制备方法和在调控rna成环中的应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0044]
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0045]
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0046]
实施例1基于i型内含子自剪接核酶的dnmt1环状rna系统的构建
[0047]
circdnmt1是mrna nm_001130823.1的外显子6和7的155个核苷酸产物，高表达的环状rna circ-dnmt1可以结合并调控乳腺癌细胞中的致癌蛋白。基于此，本发明首先构建了针对较短长度circrna(circdnmt1)的核酶来验证该系统是否起作用，并circdnmt1下游的尿苷残基作为5'剪接位点。i型内含子自剪接核酶的结构及剪接后连接处核苷酸位点信息见图1。circdnmt1的核苷酸序列见seq id no.3，体外促进circdnmt1成环的dna表达框的核苷酸序列见seq id no.4。
[0048]
合成dnmt1序列后，在序列两端分别添加pcdh载体同源臂，与pcdh载体进行gibson连接反应，反应条件如下：线性化pcdh载体3ul、dnmt1片段1ul、2x gibson assembly4 ul；50℃下反应30min。反应完全后，将全部反应液加入到100ul的感受态大肠杆菌中，静置30min后，42℃下放置50s，冰上放置2min。随后，加入到500ml的无抗性lb培养液中，37℃摇床中以200rpm的转速复苏1h后，室温下4000rpm离心1min，取下层菌体沉淀，均匀涂布于氨苄抗性培养板上。16h后，挑克隆菌落，菌落pcr后测序。序列正确的质粒大量扩增备用。
[0049]
实施例2基于i型内含子自剪接核酶的dnmt1环状rna制备
[0050]
通过pcr反应，将含有t7启动子序列的促进环状rna成环的dna表达框线性化，所用的引物为：forward-taatacgactcactatagggagaacggggatttccaagtctcca；reverse：cggagccagtacacgacatca。pcr条件为：引物f与r各2ul、模板1ul、酶：25ul、ddh2o：20ul。pcr反应条件为：98℃-30s，(98℃-2min，55℃-5s，72℃-10s)
×
35cycles，72℃-2min，4℃保存。将pcr产物进行凝胶电泳，并采用柱回收法进行产物回收。nanodrop测得回收产物的浓度为100ng/ul，a260/280＝2.0，a230/280＝1.8。取rnase-free的ep管，室温下按顺序分别向其中加入下表一中的反应物，37℃下反应4h。反应完全后，向其中分别加入rnaseh和dnase i，反应30min，去除模板线性dna，以及线性rna反应物。待反应完全后，按照反应液：无水乙醇：ph 5.2的3mol/l的醋酸钠比例为10:20:1分别混匀后，置于-80℃下过夜。随后于4℃下，12000rpm离心20min。轻轻去除上清后，加入1mlrnase-free的70％乙醇轻轻漂洗，12000rpm离心20min。在将漂洗液移去后，加入20ul的ddh2o重悬，跑凝胶电泳观测条带位置(见图2a)，并于nanodrop下测得浓度为1000ng/ul。采用反向pcr对产物进行测序(见图2b)，测序的引物序列分别为：forward-ctcaggaagagtctgaaagagc；reverse-gctctttcagactcttcctgag。
[0051]
表1dnmt1环状rna制备反应体系
[0052][0053]
实施例3基于i型内含子自剪接核酶的gfp蛋白环状rna表达系统的构建
[0054]
为进一步验证基于i型内含子自剪接核酶的环状rna表达系统能够在自剪接的同时不额外引入核苷酸，我们将目的基因选为绿色荧光蛋白gfp基因与内部核糖体进入位点ires基因的融合基因，并将gfp断开分为300bp与395bp大小两片段，同时使其5端最后一个碱基为核酶识别位点t，只有当核酶对目标序列剪接后并不引入额外的核苷酸造成完整gfp编码氨基酸不移码的前提下，gfp采会在cvb3 ires的作用下启动表达。circgfp的核苷酸序列见seq id no.5，体外促进circgfp成环的dna框架见seq id no.6。具体的基于i型内含子自剪接核酶的gfp蛋白环状rna表达系统结构见图3，剪切位点及剪切机制见图4。基于i型内含子自剪接核酶的环状gfp蛋白表达系统制备过程同实施例2。采用反向引物对产物进行测序，测序引物序列分别为：forward-agtgcttcagccgctaccc；reverse-gttgtactccagcttgtgcc。测序结果见图5。测序结果表明，基于i型内含子核酶及本发明的circrna制备方法得到circgfp能够首尾连接，且不引入额外的核苷酸。
[0055]
实施例4circgfp蛋白表达的细胞验证
[0056]
将hek293t细胞在含10％胎牛血清、100u/ml青霉素和100ug/ml链霉素的1
×
dmem或1640培养基中培养。待细胞生长至对数期时，提前4h将细胞培养液换成不含抗性的培养液后，进行转染。在细胞转染时，首先分别用50ul无血清dmem将2ul circgfp和1ul的lipo3000分别稀释后，将circgfp加入到lipo3000中，轻轻搅匀后，室温下静置10min后，轻轻滴加到细胞培养液中。16h后于激光共聚焦下观察荧光表达后，见图6。通过观察可以发现，gfp可以在293t细胞中得到很好的表达，进一步说明本发明的成环不引入额外的核苷酸，成环效果稳定性且可靠性。
[0057]
实施例5长片段circfoxo3的成环及细胞功能验证
[0058]
circfox3的制备和细胞转染分别如实施例2和实施例5所述。circfox3的核苷酸序列见seq idno.7，体外促进circgfp成环的dna框架见seq id no.8。在进行transwell细胞迁移实验时，使用一个24孔的transwell室，上面有一个室中加入不含血清的dmem，并将1.0
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105细胞接种于上腔，在下室中加入含10％fbs的dmem培养基。分别转染不同组别rna后，孵育24h，取transwell小室，倒掉培养基，用棉签擦拭膜上表面的细胞，对穿过膜的细胞用结晶紫染色计数。染色结果及计数结果见图7。结果说明，制备得到的circfoxo3 rna能够发挥与机体内天然circrna同样的抑制肿瘤细胞迁移的生理功能。
[0059]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来
说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。