一种新型小鼠前脂肪细胞的分离方法与流程

1.本发明属于原代细胞分离技术领域，尤其涉及一种新型小鼠前脂肪细胞的分离方法。


背景技术：

2.目前，前脂肪细胞是一类呈梭形或三角形，形状圆润的细胞。目前，大多脂肪发育相关的研究根据需要会选择原代脂肪细胞以及3t3-l1细胞系作为细胞模型。不同于成纤维细胞，前脂肪细胞形态更加圆润，具有极强的成脂分化的能力，可以分泌脂滴，形成脂滴圆环，在染色剂的辅助下观察更加明显。脂肪组织是众多领域的研究热点组织，由于脂肪组织在体内具有内分泌、保护器官、平衡炎症反应、保温等功能。在肥胖、糖尿病、粥样动脉硬化、运动恢复、器官移植多个领域脂肪组织都扮演重要角色。为了更好地开展体外研究以及各类实验猜想的功能验证，需要对原代脂肪细胞进行分离，开展更贴近体内状况的模拟实验，此类实验是永生化细胞系无法替代或重复的。但是，现有分离小鼠原代脂肪细胞的技术存在效率低、成功率低等问题。另外，传统方法步骤繁琐，增加了细胞与外界接触的机会和时间，容易发生污染，且离心过程对细胞有损伤，细胞存活率降低到可传代的时间较长，获得的细胞数量较少。因此，亟需设计一种新的小鼠前脂肪细胞的分离方法。
3.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有分离小鼠原代脂肪细胞的技术存在效率低、成功率低等问题。传统方法步骤繁琐，增加了细胞与外界接触的机会和时间，容易发生污染，且离心过程对细胞有损伤，细胞存活率降低到可传代的时间较长，获得的细胞数量较少。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种新型小鼠前脂肪细胞的分离方法，旨在解决现有技术分离小鼠原代脂肪细胞的效率低、成功率低等问题。
5.本发明是这样实现的，一种新型小鼠前脂肪细胞的分离方法，所述新型小鼠前脂肪细胞的分离方法包括：获取小鼠皮下腹股沟脂肪组织、性腺周围的脂肪组织以及肾周脂肪组织；将脂肪组织放在无菌培养皿中，用剪刀将脂肪组织剪碎至肉糜状；取部分肉糜并置于离心管中，加入消化液轻柔颠倒混匀；置于水浴锅中水浴加热，于加热期间轻轻上下颠倒混匀组织样本。
6.进一步，所述获取小鼠皮下腹股沟脂肪、性腺周围的脂肪以及肾周脂肪包括：获取小鼠皮下腹股沟脂肪，去除淋巴结；获取性腺周围的脂肪，去除结缔组织以及血管，同时获取肾周脂肪去除血管。
7.进一步，所述取部分肉糜置于离心管中并加入消化液包括：将肉糜取3ml体积量置于15ml离心管中，并加入10ml 10％的二型胶原酶加胰蛋白酶混合物。
8.进一步，所述水浴加热的时间为45min。
9.进一步，所述新型小鼠前脂肪细胞的分离方法包括以下步骤：
10.步骤一，获取三周龄icr小鼠的皮下脂肪以及内脏脂肪，并去除薄膜、淋巴结、血管、结缔组织以及肌肉组织；
11.步骤二，将脂肪组织置于无菌培养皿中用灭菌眼科剪剪至肉糜状，将脂肪组织团加入10％的二型胶原酶加胰蛋白酶混合物，消化；
12.步骤三，消化完成后过筛，将细胞悬液离心弃上清，再次过滤后离心，用培养液冲匀，将细胞瓶置于培养箱中培养。
13.进一步，所述步骤一中的内脏脂肪包括性腺脂肪以及肾周脂肪。
14.进一步，所述步骤二中，按照1:10的体积比率添加10％的二型胶原酶加胰蛋白酶混合物，37℃消化40min。
15.进一步，所述步骤三中，将细胞悬液二次离心后用10％fbs培养液冲匀。
16.进一步，所述步骤三中，将细胞瓶置于37℃5％二氧化碳，湿度适宜的培养箱中培养。
17.进一步，所述步骤三中，将细胞瓶置于培养箱培养12h后换液。
18.结合上述的技术方案和解决的技术问题，请从以下几方面分析本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
19.第一，针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：
20.本发明提供的新型小鼠前脂肪细胞的分离方法，分离小鼠原代脂肪细胞的效率高且成功率高。
21.第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：
22.本发明对现有的传统消化法进行了改良，减少了过滤和离心的过程，使操作简便化，同时也降低了操作过程对细胞的伤害，减少了细胞与外界接触的时间和机会，大大降低了细胞污染几率。
23.第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：
24.(1)本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：通过本方法分离出来的前脂肪细胞不仅能够用于分析脂肪发育和脂肪沉积的机制，还可以应用于人类医学领域的整形科的技术开发，例如前脂肪细胞用于脂肪组织的获取与纯化后，用于美容，有巨大的科研前景和商业价值。
25.(2)本发明的技术方案是否克服了技术偏见：本发明分离出来的脂肪细胞前具有活性强，数目多，经过传代培养后还保留正常细胞的基本遗传特征和诱导成脂能力。
附图说明
26.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
27.图1是本发明实施例提供的新型小鼠前脂肪细胞的分离方法流程图；
28.图2是本发明实施例提供的刚消化完成的细胞示意图；
29.图3是本发明实施例提供的分离的前脂肪细胞示意图；
30.图4是本发明实施例提供的诱导分化的成熟脂肪细胞示意图。
具体实施方式
31.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
32.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种新型小鼠前脂肪细胞的分离方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
33.一、解释说明实施例。为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。
34.如图1所示，本发明实施例提供的新型小鼠前脂肪细胞的分离方法包括以下步骤：
35.s101，获取小鼠皮下腹股沟脂肪、性腺周围的脂肪以及肾周脂肪；
36.s102，将脂肪组织放在无菌培养皿中，用剪刀将脂肪组织剪碎至肉糜状；
37.s103，取部分肉糜并置于离心管中，加入消化液轻柔颠倒混匀；
38.s104，置于水浴锅中水浴加热，期间轻轻上下颠倒混匀组织样本。
39.本发明实施例通过对大鼠前体脂肪细胞原代培养体系进行了改良，提供更为稳定、方便操作的培养体系，为前体脂肪细胞向脂肪细胞分化机制的研究、肥胖病因探索及肉品质改良提供更为有利的技术支持。
40.本发明实施例提供的步骤s101中的获取小鼠皮下腹股沟脂肪、性腺周围的脂肪以及肾周脂肪包括：获取小鼠皮下腹股沟脂肪，去除淋巴结；获取性腺周围的脂肪，去除结缔组织以及血管，同时获取肾周脂肪去除血管。
41.本发明实施例提供的步骤s102中，将肉糜取3ml体积的量置于15ml离心管中，加入10ml消化液，其中消化液为10％的二型胶原酶加胰蛋白酶混合物。
42.作为优选，本发明实施例提供的新型小鼠前脂肪细胞的分离方法具体包括：将三周龄icr小鼠处死，将皮下脂肪以及内脏脂肪(包含性腺脂肪以及肾周脂肪)剥离出来，去除薄膜、淋巴结、血管、结缔组织、肌肉组织。将脂肪组织置于无菌培养皿中用眼科剪(灭菌)将脂肪组织剪至肉糜状，将脂肪组织团加入10％的二型胶原酶加胰蛋白酶混合物，体积按照1:10的比率加，37度消化40分钟，过筛后将细胞悬液离心弃上清，再次过滤后离心，用10％fbs培养液冲匀，将细胞瓶置于37度5％二氧化碳，湿度适宜的培养箱培养，12小时后换液。
43.二、实施例相关效果的证据。本发明实施例在研发或者使用过程中取得了一些积极效果，和现有技术相比的确具备很大的优势，下面内容结合试验过程的数据、图表等进行描述。
44.作为优选实施例，本发明实施例提供的新型小鼠前脂肪细胞的分离方法，具体包括以下步骤：
45.1.将小鼠使用颈椎脱离的方式处死；
46.2.取出皮下腹股沟脂肪，去除淋巴结，取出性腺周围的脂肪，去除结缔组织以及血管，取出肾周脂肪去除血管；
47.3.将脂肪组织放在无菌培养皿中，用剪刀将脂肪组织剪碎至肉糜状；
48.4.将肉糜取3ml体积的量置于15ml离心管中，加入10ml消化液(10％的二型胶原酶加胰蛋白酶混合物)；
49.5.轻柔颠倒混匀；
50.6.置于水浴锅中水浴45分钟，期间轻轻上下颠倒混匀组织样本。
51.本发明实施例提供的刚消化完成的细胞示意图如图2所示，分离的前脂肪细胞示意图如图3所示，诱导分化的成熟脂肪细胞示意图如图4所示。
52.以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。