结合FGFR2B的抗体及其用途的制作方法

发明领域本发明涉及一种与fgfr2b特异结合的抗体或其抗原结合部分、及其制备和用途，尤其是其在治疗与fgfr2b相关疾病例如癌症中的用途。

背景技术：

1、成纤维细胞生长因子(fgf)信号通路，在促分裂(胚胎发生、生长发育等)和非促分裂(神经调节、代谢调节等)等的生物学过程中起着重要作用。fgf与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(hspg)结合，形成亲和fgf受体(fgfr)的复合体，进而与fgfr结合。fgfr包含胞外免疫球蛋白(ig)样结构域和胞内酪氨酸激酶结构域，配体依赖的fgfr聚体化会引发酪氨酸的磷酸化(katoh m.(2008)int j oncol.33(2)：233-7)。

2、fgfr2存在两种剪切异构体，fgfr2 iiib(fgfr2b)和fgfr2 iiic(fgfr2c)，两者的结构差异在于第三胞外ig样结构域的一部分由不同外显子编码。fgfr2b主要表达于上皮细胞，为fgf1、fgf3、fgf7、fgf10和fgf22的高亲和受体，而fgfr2c主要表达于间充质细胞，为fgf1、fgf2、fgf4、fgf6、fgf9、fgf16、和fgf20的高亲和受体(ornitz dm et al.，(1996)jbiol chem 271(25)：15292-15297；zhang x et al.，(2006)j biol chem 281(23)：15694-15700)。此外，fgfr2b存在两种亚型，fgfr2bα和fgfr2bβ，其中fgfr2bα包含igi、igii和igiii三个胞外ig结构域，而fgfr2bβ只含有igii和igiii两个胞外ig结构域。fgf7-fgfr2b信号通路在成体的伤口愈合和粘膜修复中发挥作用，fgf10-fgfr2b信号通路则在胚胎发育中不可或缺。

3、在促分裂通路中，fgfr2的高表达、突变等会导致fgf-fgfr2信号通路的异常激活，使得促分裂作用不受控制，随之产生肿瘤。例如，fgfr2b可以经由fgfr2基因扩增或fgfr2b转录上调而在癌组织，例如胃癌、鳞状非小细胞肺癌、三阴性乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌和肝内胆管癌中高表达。在fgfr2基因扩增中，可能因外显子21的缺失而形成非正常fgfr2b转录子，以非配体依赖性方式磷酸化frs2，组成性地激活mapk和pi3k信号通路(moffa ab etal.，(2004)mol cancer res 2(11)：643-652)。另外，通常集中在fgfr2的铰链区和第三ig样结构域、或酪氨酸激酶结构域的错义突变，可能影响配体结合的特异性和/或非配体依赖型的磷酸化，引起fgfr2的癌变激活。例如，s252w等错义突变常发生在子宫癌中。目前，已发现错义突变与乳癌、胃癌、肺癌、卵巢癌以及子宫内膜癌等存在一定关联(jang jh et al.，(2001)cancer res 61(9)：3541-3543；davies h et al.，(2005)cancer res 65(17)：7591-7595；pollock pm et al.，(2007)oncogene 26(50)：7158-7162)。不管何种原因引起的fgf-fgfr2信号通路的异常激活，都有导致肿瘤细胞的增殖、生存和上皮-间质转化的可能，是多种肿瘤较差预后的标志。

4、贝马妥珠单抗(bemarituzumab)，又称fpa144，是由five prime研制的fgfr2b单抗。该抗体可以通过抑制fgfr2通路和多种下游促肿瘤信号通路，以及对于fgfr2阳性肿瘤细胞的增强adcc，延缓癌症的进展(xiang h et al.，(2021).mabs 13(1)：1981202)。目前，贝马妥珠单抗正针对fgfr2b过度表达肿瘤，如胃癌和胃食管交界癌，进行测试。在一项全球性、随机、双盲、安慰剂对照的研究中，对于亚美欧等15个国家入组的155例新诊断的fgfr2b+her2-晚期胃或胃食管交界癌患者，评估了贝马妥珠单抗联合化疗(mfolfox6)用于一线治疗的疗效和安全性。结果显示，与安慰剂组相比，贝马妥珠单抗组患者在无进展生存期(pfs)主要终点、总生存期(os)和总缓解率(orr)次要终点上有统计学显著性和临床意义的改善，且治疗获益与fgfr2b+肿瘤细胞的百分比呈正相关。

5、然而，贝马妥珠单抗在安全性方面有进一步提升的空间。例如，在上述临床研究中，观察到例如干眼症、角膜炎、点状角膜炎、口腔炎和转氨酶升高等。找到这些副作用的原因，开发新的具有更合适的特性的治疗抗体，对于同类癌症治疗来说非常紧迫和重要。上述更合适的特性包括例如具有差异化的结合亲和力、阻断活性等。

6、对于本技术中任何文件的引用，并不等同于承认这些文件是本技术的现有技术。

技术实现思路

1、本技术提供一种分离的单克隆抗体，例如，与fgfr2b(例如，人、猴、和/或小鼠fgfr2b)特异结合的单克隆抗体，或其抗原结合部分，其与现有技术抗体例如fpa144相比，具有相当或更高的人、猴、和/或小鼠fgfr2b(包括fgfr2bα、fgfr2bβ、fgfr2bα-s252w变体)结合亲和力/结合活性、相当或更高的fgfr2b阳性细胞结合力、相当或更佳的引发对于fgfr2b阳性细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)、相当或更佳的引发对于fgfr2b阳性细胞的补体依赖性细胞毒性(cdc)、相当或更佳的fgf-fgfr2b阻断活性、和/或相当或更高的体内抗肿瘤效力。本技术的单克隆抗体或其抗原结合部分还能被fgfr2b阳性细胞内吞。

2、本技术的抗体或其抗原结合部分可以用于多种应用，包括fgfr2b的体外检测、fgfr2b相关疾病如癌症的治疗等。

3、因此，在一个方面，本技术涉及一种分离的单克隆抗体(例如，小鼠源、嵌合、或人源化抗体)、或其抗原结合部分，其与fgfr2b特异结合，可以包含i)重链可变区，该重链可变区可以含有vh cdr1区、vh cdr2区和vh cdr3区，其中，vh cdr1区、vh cdr2区和vh cdr3区可以分别包含与(1)seq id nos：1、2和3；或(2)seq id nos：7、8和9具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；和/或ii)轻链可变区，该轻链可变区可以含有vl cdr1区、vl cdr2区和vl cdr3区，其中，vl cdr1区、vl cdr2区和vl cdr3区可以分别包含与(1)seq id nos：4、5和6；或(2)seqid nos：10、11和12具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

4、本技术的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含重链可变区和轻链可变区，其中vh cdr1区、vh cdr2区、vh cdr3区、vl cdr1区、vl cdr2区和vl cdr3区可以分别包含与(1)seq id nos：1、2、3、4、5和6；或(2)seq id nos：7、8、9、10、11和12具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

5、本技术抗体或其抗原结合部分的重链可变区可以包含与seq id nos：13、15(x1＝m、x2＝v、x3＝m、x4＝r、x5＝t、x6＝v；x1＝m、x2＝a、x3＝l、x4＝r、x5＝t、x6＝v；x1＝m、x2＝a、x3＝l、x4＝a、x5＝k、x6＝v；x1＝i、x2＝a、x3＝l、x4＝a、x5＝k、x6＝a)、17或19(x1＝m、m2＝v、x3＝m、x4＝r、x5＝v、x6＝a；x1＝m、m2＝a、x3＝l、x4＝r、x5＝v、x6＝a；x1＝m、m2＝a、x3＝l、x4＝a、x5＝v、x6＝t；x1＝i、m2＝a、x3＝l、x4＝a、x5＝a、x6＝t)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

6、本技术抗体或其抗原结合部分的轻链可变区可以包含与seq id nos：14、16(x1＝i、x2＝f；x1＝n、x2＝y)、18或20(x1＝l、x2＝f；x1＝w、x2＝y)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

7、本技术抗体或其抗原结合部分的重链可变区和轻链可变区可以分别包含与(1)seq id nos：13和14；(2)seq id nos：15(x1＝m、x2＝v、x3＝m、x4＝r、x5＝t、x6＝v)和16(x1＝i、x2＝f)；(3)seq id nos：15(x1＝m、x2＝a、x3＝l、x4＝r、x5＝t、x6＝v)和16(x1＝i、x2＝f)；(4)seq id nos：15(x1＝m、x2＝a、x3＝l、x4＝r、x5＝t、x6＝v)和16(x1＝n、x2＝y)；(5)seq id nos：15(x1＝m、x2＝a、x3＝l、x4＝a、x5＝k、x6＝v)和16(x1＝i、x2＝f)；(6)seq id nos：15(x1＝m、x2＝a、x3＝l、x4＝a、x5＝k、x6＝v)和16(x1＝n、x2＝y)；(7)seq idnos：15(x1＝i、x2＝a、x3＝l、x4＝a、x5＝k、x6＝a)和16(x1＝i、x2＝f)；(8)seq id nos：15(x1＝i、x2＝a、x3＝l、x4＝a、x5＝k、x6＝a)和16(x1＝n、x2＝y)；(9)seq id nos：17和18；(10)seq id nos：19(x1＝m、m2＝v、x3＝m、x4＝r、x5＝v、x6＝a)和20(x1＝l、x2＝f)；(11)seq id nos：19(x1＝m、m2＝a、x3＝l、x4＝r、x5＝v、x6＝a)和20(x1＝l、x2＝f)；(12)seqid nos：19(x1＝m、m2＝a、x3＝l、x4＝r、x5＝v、x6＝a)和20(x1＝w、x2＝y)；(13)seq idnos：19(x1＝m、m2＝a、x3＝l、x4＝a、x5＝v、x6＝t)和20(x1＝l、x2＝f)；(14)seq id nos：19(x1＝m、m2＝a、x3＝l、x4＝a、x5＝v、x6＝t)和20(x1＝w、x2＝y)；(15)seq id nos：19(x1＝i、m2＝a、x3＝l、x4＝a、x5＝a、x6＝t)和20(x1＝l、x2＝f)；或(16)seq id nos：19(x1＝i、m2＝a、x3＝l、x4＝a、x5＝a、x6＝t)和20(x1＝w、x2＝y)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

8、在另一个方面，本技术涉及一种分离的单克隆抗体(例如，小鼠源、嵌合、或人源化抗体)、或其抗原结合部分，其与fgfr2b特异结合，可以包含i)重链可变区，该重链可变区可以含有vh cdr1区、vh cdr2区和vh cdr3区，其中，vh cdr1区、vh cdr2区和vh cdr3区分别与选定的vh序列的vh cdr1区、vh cdr2区和vh cdr3具有同一性，和/或ii)轻链可变区，该轻链可变区可以含有vl cdr1区、vlcdr2区和vlcdr3区，其中，vl cdr1区、vl cdr2区和vlcdr3区分别与选定的vl序列的vl cdr1区、vl cdr2区和vl cdr3区具有同一性；其中所述选定的vh序列和所述选定的vl序列为下面中的一种：(1)所述选定的vh序列和所述选定的vl序列分别为seq id nos：13和14；(2)所述选定的vh序列和所述选定的vl序列分别为seq idnos：15(x1＝m、x2＝v、x3＝m、x4＝r、x5＝t、x6＝v)和16(x1＝i、x2＝f)；(3)所述选定的vh序列和所述选定的vl序列分别为seq id nos：15(x1＝m、x2＝a、x3＝l、x4＝r、x5＝t、x6＝v)和16(x1＝i、x2＝f)；(4)所述选定的vh序列和所述选定的vl序列分别为seq id nos：15(x1＝m、x2＝a、x3＝l、x4＝r、x5＝t、x6＝v)和16(x1＝n、x2＝y)；(5)所述选定的vh序列和所述选定的vl序列分别为seq id nos：15(x1＝m、x2＝a、x3＝l、x4＝a、x5＝k、x6＝v)和16(x1＝i、x2＝f)；(6)所述选定的vh序列和所述选定的vl序列分别为seq id nos：15(x1＝m、x2＝a、x3＝l、x4＝a、x5＝k、x6＝v)和16(x1＝n、x2＝y)；(7)所述选定的vh序列和所述选定的vl序列分别为seq id nos：15(x1＝i、x2＝a、x3＝l、x4＝a、x5＝k、x6＝a)和16(x1＝i、x2＝f)；(8)所述选定的vh序列和所述选定的vl序列分别为seq id nos：15(x1＝i、x2＝a、x3＝l、x4＝a、x5＝k、x6＝a)和16(x1＝n、x2＝y)；(9)所述选定的vh序列和所述选定的vl序列分别为seq id nos：17和18；(10)所述选定的vh序列和所述选定的vl序列分别为seq idnos：19(x1＝m、m2＝v、x3＝m、x4＝r、x5＝v、x6＝a)和20(x1＝l、x2＝f)；(11)所述选定的vh序列和所述选定的vl序列分别为seq id nos：19(x1＝m、m2＝a、x3＝l、x4＝r、x5＝v、x6＝a)和20(x1＝l、x2＝f)；(12)所述选定的vh序列和所述选定的vl序列分别为seq id nos：19(x1＝m、m2＝a、x3＝l、x4＝r、x5＝v、x6＝a)和20(x1＝w、x2＝y)；(13)所述选定的vh序列和所述选定的vl序列分别为seq id nos：19(x1＝m、m2＝a、x3＝l、x4＝a、x5＝v、x6＝t)和20(x1＝l、x2＝f)；(14)所述选定的vh序列和所述选定的vl序列分别为seqidnos：19(x1＝m、m2＝a、x3＝l、x4＝a、x5＝v、x6＝t)和20(x1＝w、x2＝y)；(15)所述选定的vh序列和所述选定的vl序列分别为seq id nos：19(x1＝i、m2＝a、x3＝l、x4＝a、x5＝a、x6＝t)和20(x1＝l、x2＝f)；(16)所述选定的vh序列和所述选定的vl序列分别为seq id nos：19(x1＝i、m2＝a、x3＝l、x4＝a、x5＝a、x6＝t)和20(x1＝w、x2＝y)。

9、在一个实施方式中，本技术的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含重链恒定区和/或轻链恒定区。其中，重链恒定区可以为igg1、igg2、igg3或igg4重链恒定区、或其功能片段如fc区。进一步地，可以对重链恒定区进行工程化改造，例如改造成具有加强的fcr和/或补体系统蛋白结合力，以加强对于fgfr2b阳性细胞的抗体依赖型细胞介导的细胞毒性(adcc)和/或补体依赖型细胞毒性(cdc)作用。在一个实施方式中，重链可变区可以是具有seq id no：21(x＝k或r)氨基酸序列的人igg1恒定区，其中seq id no：21(x＝k)的重链恒定区和具有seq id no：21(x＝r)的重链恒定区都是自然存在的，在功能上没有差别。轻链恒定区可以为κ恒定区，例如具有seq id no：22氨基酸序列的人κ恒定区或其功能片段。其中，重链恒定区的n端与重链可变区的c端连接，轻链恒定区的n端与轻链可变区的c端连接。

10、本技术的抗体或其抗原结合部分可以例如在某些哺乳动物细胞系中重组表达，以去岩藻糖化。可表达去岩藻糖化抗体或其抗原结合部分的细胞系包括但不限于，slc35c1基因剔除细胞系、fut8剔除细胞系、变异cho细胞系lec13、大鼠融合瘤细胞系yb2/0、包含特异性地针对fut8基因的小干扰rna的细胞系以及共表达β-1,4-n-乙酰基葡糖胺基转移酶iii和高尔基体α-甘露糖苷酶ii。

11、本技术的抗体在一些实施方式中包含两条重链和两条轻链，或由两条重链和两条轻链构成，其中各重链包含上述的重链恒定区序列、重链可变区序列和/或cdr序列，且各轻链包含上述的轻链恒定区序列、轻链可变区序列和/或cdr序列。在一些实施方式中，本技术的抗体可以是单链抗体，或由抗体片段构成，例如fab或f(ab′)2片段。

12、本技术还提供含有本技术抗体或其抗原结合部分的免疫偶联物，该抗体或其抗原结合部分与治疗剂例如细胞毒素或抗癌剂相连接。本技术还提供含有本技术抗体或其抗原结合部分的双特异性分子，该抗体或其抗原结合部分连接有第二功能基团，例如，第二抗体，该第二功能基团具有不同于本技术抗体或其结合部分的结合特异性。在另一方面，本技术的抗体或其抗原结合部分可以是嵌合抗原受体(car)或基因改造t细胞受体(tcr)的一部分。本技术还提供含有上述car和/或tcr的免疫细胞，包括t细胞、nk细胞等。本发明的抗体或其抗原结合部分还可以由溶瘤病毒编码或由溶瘤病毒承载。

13、本技术还包括编码本技术抗体或其抗原结合部分、双特异性分子、和/或car/tcr的核酸分子。在一个实施方式中，本技术表达载体包括一个或多个上述核酸。在又一个实施方式中，本技术表达载体包括两种上述核酸，其分别编码本技术抗体或其抗原结合部分的vh和vl。在另一个实施方式中，本技术涉及一对载体，其中每个载体包括上述核酸中的一种，该成对载体共同编码本技术抗体或其抗原结合部分上的vh和vl。

14、本技术还提供包含上述核酸的表达载体、包含该表达载体或使上述核酸整合入基因组的宿主细胞，以及使用该宿主细胞来制备本技术抗体或其抗原结合部分、双特异性分子、或car/tcr的方法，包括：(i)在宿主细胞中表达抗体、其抗原结合部分、双特异性分子、或car/tcr，以及(ii)从宿主细胞或其培养物中分离抗体、其抗原结合部分、双特异性分子、或car/tcr。

15、本技术还提供一种试剂盒，其包含本技术的抗体或其抗原结合部分、核酸分子、表达载体、或宿主细胞。任选地，该试剂盒还可以包含合适的载体，如合适的溶剂。任选地，该试剂盒还包含使用说明书。该试剂盒可以是检测试剂盒，用于检测样本中fgfr2b的存在或含量。在某些实施方式中，检测试剂盒可以包含用于fgfr2b含量测定的标准品。

16、本技术还提供药物组合物，其包含本技术的抗体或其抗原结合部分、免疫偶联物、双特异性分子、免疫细胞、溶瘤病毒、核酸分子、表达载体或宿主细胞，以及药学上可接受的载体。

17、另一方面，本技术提供在受试者中治疗或减缓fgfr2b相关疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本技术药物组合物。fgfr2b相关疾病可以为与fgfr2b相关的癌症。癌症可以为实体癌，包括但不限于，胃癌、胃食管交界癌、肺癌(例如非小细胞肺癌，如鳞状非小细胞肺癌)、乳腺癌(如三阴性乳腺癌)、卵巢癌、胰腺癌、胆管癌(如肝内胆管癌)、子宫癌、和子宫内膜癌。在一些实施方式中，本技术抗体或其抗原结合部分可以与至少一种其他抗癌抗体一起施用，例如pd-1抗体、pd-l1抗体等。在另一个实施方式中，本技术的抗体或其抗原结合部分与细胞因子(例如il-2和/或il-21)或共刺激抗体(例如cd137抗体和/或gitr抗体)一起施用。在另一个实施方式中，本技术的抗体或其抗原结合部分可以与化疗剂一起施用，该化疗剂可以是细胞毒性剂。本技术的抗体可以是例如小鼠源、嵌合、和人源化抗体。

18、本技术还提供一种用于检测样本中fdfr2b的存在或含量的方法，包括将本技术的检测试剂盒应用至该样本。在检测样本中fdfr2b的含量的实施方式中，还可包括使用检测试剂盒中的标准品进行标准曲线制作，以及根据该标准曲线确定样本中fdfr2b的含量。

19、在本技术中引用或提及的所有文件(包括但不限于本文引用的所有文献、专利、公开的专利申请)(“本技术引用文件”)，在本技术引用文件中引用或提及的所有文件，以及本技术或任意本技术引用文件中提及的任何产品的制造商手册、说明书、产品规格和产品页，均通过引用的方式并入本技术，且可能在实施本发明时采用。更具体而言，所有参考文件均通过引用的方式并入本技术，如同各文件通过引用的方式并入。在本文中提及的任何genbank序列通过引用的方式并入本技术。