一种猪伪狂犬病自组装纳米颗粒及其制备的疫苗和制备方法以及应用

本发明属于生物制品，具体涉及一种猪伪狂犬病自组装纳米颗粒及其制备的疫苗和制备方法以及应用。

背景技术：

1、猪伪狂犬病(porcine pseudorabies，pr)，又名奥叶兹基氏病(aujeszky'sdisease)，是由猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus，prv)引起的以仔猪神经系统紊乱和高死亡率、育肥猪呼吸障碍和体重减轻以及母猪繁殖能力下降等为特征的一种急性发热性传染病[1-5]，对养殖业造成了巨大经济损失。疫苗接种是预防和控制该病的主要手段。开发针对pr的更有效的新型疫苗迫在眉睫。

2、prv属于疱疹病毒科(herpesviridae)，α-疱疹病毒亚科(alphaherpesvirinae)病毒，基因组为全长约150kb的双链dna，包含一个独特的长区(ul)和一个独特的短区(us)。编码区共有70个开放阅读框，编码70～100个病毒蛋白。其中包含了11种糖蛋白：gb、gc、gd、ge、gg、gh、gi、gk、gl、gm和gn[3,6]。传统的pr疫苗包括灭活疫苗和减毒活疫苗，早期它们在prv感染的控制中发挥着重要作用。然而灭活疫苗免疫效率低下，减毒活疫苗安全性较低，并且随着新变异株的出现，传统的pr疫苗不再具有优势。为更好地控制和根除pr疫情，研究人员开发了一系列的基因工程新型疫苗，包括亚单位疫苗、核酸疫苗、基因重组载体疫苗和基因缺失疫苗。其中，基因缺失疫苗技术相对成熟，已用于临床预防和控制pr，而其他的基因工程疫苗仍然处于开发研究阶段。

3、亚单位疫苗是将病毒的主要保护性抗原基因，在原核或真核表达系统中进行表达，并辅以合适的佐剂制成的疫苗。在prv的11种糖蛋白中，gb、gc和gd均能诱导机体产生保护性中和抗体，因而常成为prv亚单位疫苗的首选靶标。亚单位疫苗具有安全性好、稳定性高、易于生产和运输等优点，然而其制作成本相对较高、免疫原性较差等缺点限制了其在临床中的应用。

4、参考文献

5、1.li,x.；zhang,w.；liu,y.；xie,j.；hu,c.；wang,x.,role of p53 inpseudorabies virus replication,pathogenicity,and host immuneresponses.veterinary research 2019,50,(1),9.

6、2.pomeranz,l.e.；reynolds,a.e.；hengartner,c.j.,molecular biology ofpseudorabies virus:impact on neurovirology and veterinarymedicine.microbiology and molecular biology reviews:mmbr 2005,69,(3),462-500.

7、3.klupp,b.g.；hengartner,c.j.；mettenleiter,t.c.；enquist,l.w.,complete,annotated sequence of the pseudorabies virus genome.journal of virology 2004,78,(1),424-40.

8、4.an,t.q.；peng,j.m.；tian,z.j.；zhao,h.y.；li,n.；liu,y.m.；chen,j.z.；leng,c.l.；sun,y.；chang,d.；tong,g.z.,pseudorabies virus variant in bartha-k61-vaccinated pigs,china,2012.emerging infectious diseases 2013,19,(11),1749-55.

9、5.wu,r.；bai,c.；sun,j.；chang,s.；zhang,x.,emergence of virulentpseudorabies virus infection in northern china.journal of veterinary science2013,14,(3),363-5.

10、6.mettenleiter,t.c.,immunobiology of pseudorabies(aujeszky'sdisease).veterinary immunology and immunopathology 1996,54,(1-4),221-9.

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种猪伪狂犬病自组装纳米颗粒及其制备的疫苗和制备方法以及应用，制备的纳米颗粒能够激起机体产生强烈的体液免疫与细胞免疫反应，并对猪伪狂犬病感染产生很好的防控效果。

2、本发明提供了一种猪伪狂犬病自组装纳米颗粒，是重组蛋白scls和stgd自组装得到；

3、所述重组蛋白scls的氨基酸序列如seq id no:9所示；

4、重组蛋白stgd的氨基酸序列如seq id no:10所示。

5、优选的，所述重组蛋白stgd的n端包含蜂毒素信号肽，c端含有8×his标签；

6、所述蜂毒素信号肽的核苷酸序列如seq id no:5所示；

7、所述8×his标签的核苷酸序列如seq id no:6所示。

8、本发明提供了一种所述猪伪狂犬病自组装纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

9、将编码重组蛋白scls的核苷酸序列插入载体中经原核表达系统表达，纯化，得到重组蛋白scls；

10、将含酶位点、肽标签的prv gd蛋白的核苷酸序列以双拷贝的形式插入杆状病毒转移载体中，得到含双拷贝的stgd的重组杆状病毒转移载体；

11、将所述含双拷贝的stgd的重组杆状病毒转移载体转化至dh10bac感受态细胞中，经筛选得到重组杆状病毒穿梭载体；

12、将所述重组杆状病毒穿梭载体bacmid-2×stgd转染昆虫细胞，拯救得到重组杆状病毒

13、将所述重组杆状病毒经重组表达和纯化，得到重组蛋白stgd；

14、将所述重组蛋白scls和重组蛋白stgd经体外自组装得到，猪伪狂犬病自组装纳米颗粒。

15、优选的，所述编码重组蛋白scls的核苷酸序列如seq id no:1所示。

16、优选的，将编码重组蛋白scls的核苷酸序列插入载体中经原核表达系统表达和纯化的方法为将编码重组蛋白scls的核苷酸序列先插入puc57载体中，经过限制性内切酶ncoi和xho i酶切处理，回收scls基因再插入相同酶切处理的原核表达质粒pet-28a(+)中，得到的重组质粒pet-28a(+)-scls转化至bl21(ed3)大肠杆菌感受态中，经iptg诱导表达，镍柱纯化，得到重组蛋白scls。

17、优选的，所述含酶位点、肽标签的prv gd蛋白的核苷酸序列包括含bamh i/ecor i酶位点、spytag003肽标签的prv gd蛋白的核苷酸序列和含spe i/hind iii酶位点、spytag003肽标签的prv gd蛋白的核苷酸序列；

18、所述含bamh i/ecor i酶位点、spytag003肽标签的prv gd蛋白的核苷酸序列采用引物对stgd-1f/stgd-1r扩增得到；所述stgd-1f的核苷酸序列如seq id no：2所示；所述stgd-1r的核苷酸序列如seq id no：3所示；

19、所述含spe i/hind iii酶位点、spytag003肽标签的prv gd蛋白的核苷酸序列采用引物对stgd-2f/stgd-2r扩增得到；所述stgd-2f的核苷酸序列如seq id no：7所示；所述stgd-2r的核苷酸序列如seq id no：8所示。

20、优选的，所述将含酶位点、肽标签的prv gd蛋白的核苷酸序列以双拷贝的形式插入杆状病毒转移载体中的方法，包括将含bamh i/ecor i酶位点、spytag003肽标签的prvgd蛋白的核苷酸序列和含spe i/hind iii酶位点、肽标签的prv gd蛋白的核苷酸序列分别插入杆状病毒转移载体pfbd2ph-p10-egfp的bamh i/ecor i克隆位点处和spe i/hind iii克隆位点处。

21、优选的，所述体外组装的条件：scls与stgd的摩尔比为1:5；组装温度为4～55℃；组装时间为10～120min。

22、本发明提供了所述猪伪狂犬病自组装纳米颗粒或所述制备方法得到的猪伪狂犬病自组装纳米颗粒在制备防控猪伪狂犬病的疫苗中的应用。

23、本发明提供了一种防控猪伪狂犬病的纳米颗粒疫苗，包括所述猪伪狂犬病自组装纳米颗粒或所述制备方法得到的猪伪狂犬病自组装纳米颗粒和佐剂。

24、优选的，所述猪伪狂犬病自组装纳米颗粒的终浓度为160～400μg/ml。

25、本发明提供的猪伪狂犬病纳米颗粒，涉及的ls蛋白骨架中超嗜热菌二氧四氢蝶啶合酶由同源寡聚体组成，可形成包含六十聚体的纳米颗粒，其表面展示的抗原有序排列并增加了局部抗原浓度，具有很强的免疫原性，显示其作为疫苗抗原的强大潜力。本发明所述猪伪狂犬病纳米颗粒中重组蛋白具有正确的加工和修饰，其生物学活性更接近于天然蛋白。本发明重组蛋白scls中蛋白质伴侣(spycatcher003，sc)和肽标签(spytag003)之间存在酰胺键，通过共价结合，使得ls蛋白骨架和目标抗原在体外能够自组装形成纳米颗粒。

26、本发明提供的猪伪狂犬病自组装纳米颗粒疫苗的应用。本发明免疫小鼠后能够产生很强的针对prv的特异性抗体与中和抗体。本发明所述方法制备的prv gd抗原可以与纳米颗粒载体ls在体外自装成六十聚体的纳米颗粒，制备的疫苗能够激起机体产生强烈的体液免疫与细胞免疫反应，并对小鼠产生很好的保护效果，可作为一种非常有前景的候选基因工程疫苗来预防猪伪狂犬病，具有较高的临床应用价值。