一种体外高效扩增人黏膜相关恒定T细胞的方法

一种体外高效扩增人黏膜相关恒定t细胞的方法
技术领域
1.本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种体外高效扩增人黏膜相关恒定t细胞的方法。


背景技术：

2.黏膜相关恒定t(mucosa-associated invariant t,mait)细胞是一类固有t细胞，广泛分布在肝脏、肺和胃肠道等粘膜组织，以及外周血(peripheral blood,pb)中。mait细胞有直接清除细菌的作用，此外凭借其多能性发挥诸多免疫调节作用，如对抗病毒/细菌感染、维持粘膜免疫稳态、促进组织修复以及抗肿瘤等。然而，作为科学实验的一种重要手段，实验用大、小鼠由于mait细胞比率较低，极难用于进一步研究。不仅如此，大、小鼠mait细胞的表型和生物学功能等并不能与人源mait细胞完全等同。由于目前缺乏体内、外扩增人源组织mait细胞的有效手段，诸多研究者仅能浅显分析mait细胞和诸多疾病的相关性，其中包括感染性疾病(如脓毒症)、自身免疫性疾病(炎症性肠病、多发性硬化症)以及代谢性疾病(如糖尿病、脂肪性肝病)等。如需进一步研究mait细胞在人类疾病中的作用，mait细胞回输势在必行。因此，亟需体外大量扩增mait细胞，进而用于医学研究。因此，确定一种有效从人外周血(或其他组织中)分离、培养、扩增mait细胞的方法具有意义。
3.寻找到一种强有力的、针对人源组织mait细胞的特异性抗原，将有助于体外对人源组织mait细胞进行特异性增殖，进而更好了解mait细胞的生物学功能，为治疗多重疾病提供新的靶点。
4.申请人前期研究蝙蝠宿主免疫时，体外应用mait细胞最强有力的特异性抗原5-op-ru进行刺激，成功对蝙蝠外周血的mait细胞进行体外增殖。尽管均为哺乳动物，人和蝙蝠无论是机体免疫系统应答，还是mait细胞的t细胞受体序列均存在巨大差异。不仅如此，抗原提呈细胞(如单核细胞等，用于提呈5-op-ru给mait细胞)的比率和功能在人和蝙蝠中均存在不均一性。基于mr1序列在哺乳动物间高度保守这一特征，能否用5-op-ru联合炎症因子体外刺激、增殖人来源的mait细胞，且同时保证其活性和生物学功能，用于人类生理或疾病研究尚有待进一步验证。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术中的不足，本发明旨在提供一种体外高效扩增人黏膜相关恒定t细胞的方法。
6.本发明的具体技术方案如下：
7.本发明一方面提供一种体外高效扩增人黏膜相关恒定t细胞的方法，包括如下步骤：
8.1)将人外周血单个核细胞或人黏膜相关恒定t细胞重悬于不含外源物质及血清的t细胞扩增培养基中，同时培养体系中添加免疫细胞血清补充物、重组人白介素-12或重组人白介素-1b和重组人白介素-23，进行培养；
9.2)在第0、5和10天，向培养体系中加入5-op-ru进行刺激，每2～3天更换t细胞扩增培养基，并补充与步骤1)相同浓度的免疫细胞血清补充物、重组人白介素-12或重组人白介素-1b和重组人白介素-23，在扩增第11天时，去除死细胞，流式细胞术检测mait细胞比率，当人黏膜相关恒定t细胞的细胞比率》70％时，收集细胞。
10.进一步地，所述人黏膜相关恒定t细胞分离自人外周血或组织器官。
11.进一步地，步骤1)的培养体系中还添加庆大霉素和normocin；
12.优选地，所述庆大霉素的浓度为50μg/ml；
13.优选地，所述normocin的浓度为100μg/ml。
14.进一步地，步骤1)的培养体系中，所述免疫细胞血清补充物的终浓度为8％；
15.所述重组人白介素-12或重组人白介素-1b的浓度5～10ng/ml；
16.所述重组人白介素-23的浓度为5～10ng/ml。
17.进一步地，步骤2)培养体系中加入的5-op-ru终浓度为2～10nm；
18.所述5-op-ru采用不含外源物质及血清的t细胞扩增培养基进行稀释；
19.所述5-op-ru稀释和向培养体系的加入的过程，控制时间不超过5min；
20.优选地，加入的5-op-ru终浓度为10nm。
21.进一步地，所述方法还包括对收集细胞采用vα7.2磁珠进行提纯。
22.本发明另一方面提供所述方法扩增获得的人黏膜相关恒定t细胞。
23.本发明另一方面提供所述的人黏膜相关恒定t细胞在制备治疗如下之一疾病的药物中的应用，其特征在于，所述疾病包括：
24.1)感染性疾病；
25.2)自身免疫性疾病；
26.3)代谢性疾病；
27.4)肿瘤。
28.进一步地，所述感染性疾病包括脓毒症、病毒和细菌感染；
29.所述自身免疫性疾病包括炎症性肠病和多发性硬化症；
30.所述代谢性疾病包括糖尿病和脂肪性肝病。
31.本发明另一方面提供所述的人黏膜相关恒定t细胞作为细胞模型在研究人黏膜相关恒定t细胞在人类疾病中作用的应用。
32.进一步地，所述人类疾病包括感染性疾病、自身免疫性疾病、代谢性疾病和肿瘤；
33.优选地，所述感染性疾病包括脓毒症、病毒和细菌感染；
34.所述自身免疫性疾病包括炎症性肠病和多发性硬化症；
35.所述代谢性疾病包括糖尿病和脂肪性肝病。
36.本发明的有益效果为：
37.本发明提供一种体外高效扩增人黏膜相关恒定t细胞的方法，通过5-(2-氧代氧亚丙基氨基)-6-(d-核糖胺基)尿嘧啶(5-(2-oxopropylideneamino)-6-d-ribitylaminouracil,5-op-ru)、重组人白介素-12或重组人白介素-1b和重组人白介素-23进行协同刺激人外周血单个核细胞或mait细胞，对于mait细胞比率小于5％的受试者同样可有效进行体外扩增，第10天mait细胞比率即可超过70％，为在生理、病理状态下研究mait细胞的生物学行为，以及未来mait细胞介导的免疫治疗手段提供基础。
附图说明
38.图1为实施例1和对比例收集细胞中mait细胞比率。
39.图2为实施例2磁珠分选结果。
具体实施方式
40.为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
41.缩写及英文含义
[0042][0043]
本发明中，5-op-ru参照已发表文献中的合成方法(makjy等.nat commun 2017.pmid:28272391)，委托无锡药明康德公司定制合成，所合成的5-op-ru的纯度为90％。
[0044]
实施例1
[0045]
本实施例详细说明体外高效扩增人黏膜相关恒定t细胞的方法，步骤如下：
[0046]
复苏于冻存管内保存的人外周血单个核细胞(通常每管含1*10^7个细胞)，该人外周血单个核细胞中的mait细胞比率小于5％，将其重悬于不含外源物质及血清的t细胞扩增培养基中(美国stem cell公司提供，货号：10981)，同时补充8％终浓度的免疫细胞血清补充物(美国thermo fisher公司提供，货号：a2596101)、5ng/ml的重组人il-12或il-1b(美国r&d公司提供)和5ng/ml的重组人il-23(美国r&d公司提供)，培养体系中还含有50μg/ml的庆大霉素以及100μg/ml的normocin(美国invivogen公司提供)。培养体系中加入庆大霉素和normocin的目的是避免细菌、支原体等微生物污染。将培养体系置于37℃，5％co2的培养箱中培养。在第0、5和10天，向培养体系中加入5-op-ru，采用终浓度为10nm的5-op-ru对外周血单个核细胞进行刺激。每2天更换培养基(包含上述浓度的免疫细胞血清补充物和细胞因子)。在扩增第11天时，通过梯度密度离心去除死细胞。应用流式细胞术检测mait细胞比率。当mait细胞比率》70％时，细胞可用于下游实验。
[0047]
在体外扩增人mait细胞时，由于5-op-ru在二甲基亚砜溶液中较稳定，但遇水后可快速转化为无活性的二氧四氢蝶啶，因此应在极短时间内(通常不超过5min)使用t细胞扩
增培养基进行稀释，并加入到扩增体系中。
[0048]
对比例
[0049]
对比例与实施例1的区别在于，5ng/ml的重组人il-12或il-1b和5ng/ml的重组人il-23替换为5ng/ml的重组人il-2(美国r&d公司提供)和5ng/ml的重组人il-7(美国r&d公司提供)。其他操作步骤同实施例1。
[0050]
实施例1和对比例收集细胞中mait细胞比率如图1。第0天mait细胞比率：3.89％；第5天mait细胞比率：11.8％(il-2+il-7)，32.6％(il-1b+il-23)，16.8％(il-12+il-23)；第10天mait细胞比率：13.4％(il-2+il-7)，71.5％(il-1b+il-23)，79.6％(il-12+il-23)。采用本发明重组人il-12或il-1b和重组人il-23联合5-op-ru刺激，仅第10天mait比率即可超过70％，用于下游实验。
[0051]
申请人前期采用5-op-ru、il-2和il-7进行刺激发现，仅mait细胞比率较高(》5％)的受试者，可对其有效进行体外扩增，即第10天mait细胞比率超过70％。对于mait细胞比率小于5％的受试者，不能有效进行体外扩增，即第10天mait细胞比率小于70％。但是健康人群mait细胞比率平均值仅为3％。对于mait细胞比率小于5％的受试者，采用本发明5-op-ru、il-1b或il-12和il-23进行体外刺激，可有效进行体外扩增，更有效地保证了细胞来源。
[0052]
实施例2
[0053]
在一具体实施方式中，可采用vα7.2磁珠(siawr等，star protoc.2021；pmid:34041501)对mait细胞进行提纯，进一步提高mait细胞纯度。本实施例应用pe标记的vα7.2抗体对实施例1收集细胞进行磁珠分选，mait细胞纯度可达90％以上(即cd161-fitc高表达和vα7.2-pe阳性细胞群)(如图2)。
[0054]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。