一种用于高通量表征生物分子种类和数量的方法及其应用

寡核苷酸偶联物的检测技术，本方法具有探针结构简单、设计容易、合成成本低等技术优点，适用于推广应用。
6.第一方面，本发明提供一种基于核酸适体的高通量表征的探针，
7.所述探针具有如下通式序列结构：
[0008]5’‑
定位/识别靶标的核酸适体序列-(n)
x-被测序系统识别的捕获序列-3’；
[0009]
其中，每个n独立地选自a、t、c、g四种脱氧核糖核苷酸中的任意一种，x表示n的数量，x选自0-20任一自然数。
[0010]
在一些技术方案中，x独立地选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20；
[0011]
优选地，x选自0时，所述探针具有如下序列结构：
[0012]5’‑
定位/识别靶标的核酸适体序列-被测序系统识别的捕获序列-3’。
[0013]
在一些技术方案中，定位/识别靶标的核酸适体序列为定位/识别生物分子的核酸适体序列，优选为定位/识别膜蛋白的核酸适体序列，更优选为序列seq idno.70-138任一所示的核酸适体序列。
[0014]
在一些技术方案中，被测序系统识别的捕获序列独立地选自以下捕获序列1-3中的任意一种：
[0015]
捕获序列1：5
’‑
aaaaaaaaaaaaaaa(a)
y-3’，
[0016]
捕获序列2：5
’‑
gctcacctattagcggctaagg-3’，
[0017]
捕获序列3：5
’‑
gctttaaggccggtcctagcaa-3’，
[0018]
其中，y代表a的数量，y选自0-16任一自然数。
[0019]
在一些技术方案中，y独立地选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16。
[0020]
在一些技术方案中，被测序系统识别的捕获序列选自捕获序列1：
[0021]
捕获序列1：5
’‑
aaaaaaaaaaaaaaa(a)
y-3’，
[0022]
其中，y代表a的数量，y选自0-16任一自然数。
[0023]
在一些技术方案中，y独立地选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16。
[0024]
在一些技术方案中，所述探针的序列选自seq no.1-no.69所示的任一序列。
[0025]
在一些技术方案中，所述探针用于生物样本中生物分子的高通量表征。
[0026]
在一些技术方案中，所述生物分子包括膜蛋白、脂质、糖基化分子、细胞分泌物和代谢物；优选地，所述生物分子是膜蛋白；
[0027]
和/或，所述生物样本选自细胞系样本、新鲜组织样本；优选地，所述生物样本是人三阴型乳腺癌sum149细胞或人三阴型乳腺癌组织样本。
[0028]
第二方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒中包括上述基于核酸适体的高通量表征的探针。
[0029]
第三方面，本发明提供上述基于核酸适体的高通量表征探针或上述试剂盒进行高通量表征的方法，包括以下步骤：
[0030]
(1)探针预处理：将溶解在超纯水或磷酸缓冲液pbs中的不同种探针储存液按照等摩尔比混合，然后在pcr仪中进行变复性；
[0031]
(2)样本预处理：将生物样本解离成单细胞悬液，用pbs清洗2-3次后，重悬于结合缓冲液中；
[0032]
(3)样本孵育：向上述单细胞悬液中加入预处理后的探针溶液，使体系中每种探针的终浓度为50-500nmol/l，然后置于4摄氏度摇床上孵育15-60分钟；
[0033]
(4)样本清洗：将上述经过探针孵育后的细胞进行离心，弃掉上清液，用pbs清洗细胞3-5次，并重悬于pbs中；
[0034]
(5)样本上机：检测样本中细胞的存活率及结团率，达到存活率大于80％结团率小于30％的要求后，采用商业化单细胞捕获平台及测序平台进行分析。
[0035]
在一些技术方案中，步骤(1)中，不同种探针储存液的浓度为10μmol/l-100μmol/l；
[0036]
和/或，步骤(1)中，变复性的参数为：95℃处理10分钟，4℃处理5分钟，25℃处理3分钟；
[0037]
和/或，步骤(2)中，生物样本选自细胞系样本、新鲜组织样本；优选地，生物样本是人三阴型乳腺癌sum149细胞或人三阴型乳腺癌组织样本；
[0038]
和/或，步骤(2)中，结合缓冲液是含有0.1mg/ml牛血清白蛋白、0.1mg/ml鲱鱼精dna和5mmol/l氯化镁的pbs溶液。
[0039]
第四方面，本发明提供上述基于核酸适体的高通量表征探针或上述试剂盒在体外高通量表征中的应用。
[0040]
在一些技术方案中，所述探针或试剂盒用于生物样本中生物分子的高通量表征。
[0041]
在一些技术方案中，所述生物分子包括膜蛋白、脂质、糖基化分子、细胞分泌物和代谢物；优选地，所述生物分子是膜蛋白；
[0042]
和/或，所述生物样本选自细胞系样本、新鲜组织样本；优选地，所述生物样本是人三阴型乳腺癌sum149细胞或人三阴型乳腺癌组织样本。
[0043]
第五方面，本发明提供上述基于核酸适体的高通量表征探针或上述试剂盒在制备乳腺癌分子分型、预后检测或者指导用药产品中的应用。
[0044]
在一些技术方案中，乳腺癌为三阴型乳腺癌。
[0045]
膜蛋白，生物膜所含的蛋白，是生物膜功能的主要承担者。根据蛋白分离的难易及在膜中分布的位置，膜蛋白基本可分为三大类：外在膜蛋白或称外周膜蛋白、内在膜蛋白或称整合膜蛋白和脂锚定蛋白。膜蛋白包括糖蛋白，载体蛋白和酶等。通常在膜蛋白外会连接着一些糖类，这些糖相当于会通过糖本身分子结构变化将信号传到细胞内。
[0046]
乳腺癌分子分型，将乳腺癌患者具体分类到具体的乳腺癌亚型中。乳腺癌亚型包括：管腔a型、管腔b型、her2富集型及三阴性乳腺癌。
[0047]
本发明的有益效果：
[0048]
相比目前广泛应用的基于抗体-寡核苷酸偶联物类探针，本发明所构建的基于核酸适体的生物分子探针具有结构简单、可设计性强和易于合成的优点，避免了抗体分子纯化、修饰和寡核苷酸偶联中所面临的诸多技术难题，并且可通过dna合成仪进行精准、大批量制备，合成成本远低于抗体。与抗体筛选不同，核酸适体的筛选无需在体内进行，可以直接利用活细胞进行筛选(cell-selex)，从而最大程度保证膜蛋白的天然状态。此外，核酸适体的分子量相对较小，且通常只含有一个抗原结合位点，有望避免抗体类探针存在的空间位阻大和易造成膜蛋白交联等问题。更重要的是，核酸适体具有比抗体更为广泛的靶标多样性，可以同时表征包括膜蛋白在内的多种生物分子，例如脂质、糖基化分子、细胞分泌物
和代谢物等，从而全面揭示细胞膜相关的分子图谱。
附图说明
[0049]
图1高通量测序表征的探针seq no.1-4在sum149细胞上的结合水平
[0050]
图2.流式表征的探针seq no.1-4在sum149细胞上的结合水平。
[0051]
图3.seq no.1在sum149细胞上的结合水平与其对应靶标mrna表达水平的相关性。
[0052]
图4.seq no.2在sum149细胞上的结合水平与其对应靶标mrna表达水平的相关性。
[0053]
图5.seq no.3在sum149细胞上的结合水平与其对应靶标mrna表达水平的相关性。
[0054]
图6.根据单细胞转录组对三阴型乳腺癌组织样本进行降维细胞聚类的结果图。
[0055]
图7.探针seq no.38结合水平及其对应靶标mrna表达水平在不同细胞亚群中的分布图。
[0056]
图8.探针seq no.38结合水平及其对应靶标mrna表达水平在不同细胞亚群中的相关性统计结果。
具体实施方式
[0057]
下文将结合具体实施例对本发明的通式化合物及其制备方法和应用做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
[0058]
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
[0059]
实施例1
[0060]
首先，设计并合成具有如下序列的膜蛋白分子探针，利用单细胞测序技术实现对sum149细胞表面4种膜蛋白的定量检测：
[0061][0062][0063]
(1)探针预处理：将上述4种探针分别溶解在磷酸缓冲液(pbs)中，使其终浓度为10μmol/l。每种探针溶液取10μl进行混合，然后在pcr仪中按照如下参数进行变复性(95℃处理10分钟，4℃处理5分钟，25℃处理3分钟)；
[0064]
(2)样本预处理：将人三阴型乳腺癌sum149细胞解离成单细胞悬液，用pbs清洗2-3次后，重悬于460μl的结合缓冲液(binding buffer)中(即含有0.1mg/ml牛血清白蛋白，
0.1mg/ml鲱鱼精dna和5mmol/l氯化镁的pbs溶液)；
[0065]
(3)样本孵育：向上述单细胞悬液中加入40μl经过变复性的探针溶液，使体系中每种探针的终浓度为200nmol/l，然后置于4摄氏度摇床上孵育30分钟；
[0066]
(4)样本清洗：将上述经过探针孵育后的细胞进行离心(300g，5分钟)，弃掉上清液，用pbs清洗细胞3次，并重悬于pbs中；
[0067]
(5)样本上机：检测样本中细胞的存活率及结团率，达到存活率大于80％、结团率小于30％的要求后，采用商业化单细胞捕获平台及测序平台进行分析。
[0068]
其次，使用5’端修饰fam荧光基团的seq no.1-4，采用流式细胞术对sum149细胞表面相关膜蛋白进行定量表征，验证本发明方法的可靠性。具体实验流程如下：
[0069]
(6)探针预处理：将4种fam修饰的荧光探针分别溶解在磷酸缓冲液(pbs)中，使其终浓度为10μmol/l，然后在pcr仪中按照如下参数进行变复性(95℃处理10分钟，4℃处理5分钟，25℃处理3分钟)；
[0070]
(7)样本预处理：将人三阴型乳腺癌sum149细胞解离成单细胞悬液，用pbs清洗2-3次后，重悬于结合缓冲液(binding buffer)中(即含有0.1mg/ml牛血清白蛋白，0.1mg/ml鲱鱼精dna和5mmol/l氯化镁的pbs溶液)；
[0071]
(8)样本孵育：将上述单细胞悬液等分为5份(每份240μl)，分别加入10μl经过变复性的4种荧光探针溶液和1种阴性对照探针，使体系中每种探针的终浓度为200nmol/l，然后置于4摄氏度摇床上孵育30分钟；
[0072]
(9)样本清洗与分析：将上述经过探针孵育后的细胞进行离心(300g，5分钟)，弃掉上清液，用pbs清洗细胞3次，并重悬于pbs中，用于流式细胞仪上机分析。
[0073]
结论：由图1可看出，4种探针在sum149细胞表面的结合量能够通过高通量测序技术被检测到，且呈现出seq no.1》seq no.2》seq no.3》seq no.4的趋势，该结果与流式细胞术分析所得出的结果完全一致(图2)，证明本发明所设计的核酸适体探针能够被现有商业化测序平台准确检测。从图3-5可以看出，在单细胞层面每种探针被检测到的数量与对应靶标蛋白的mrna表达水平呈正相关，证明探针的数量能够准确反映膜蛋白的表达水平。
[0074]
实施例2
[0075]
设计并合成具有如下序列的69种膜蛋白分子探针，利用单细胞测序技术实现对人三阴型乳腺癌组织样本中不同种类细胞膜蛋白的定量检测，具体实验步骤如下：
[0076]
[0077]
[0078]
[0079]
[0080]
[0081]
[0082][0083]
(1)探针预处理：将上述69种探针分别溶解在磷酸缓冲液(pbs)中，使其终浓度为100μmol/l。每种探针溶液取1μl进行混合，然后在pcr仪中按照如下参数进行变复性(95℃处理10分钟，4℃处理5分钟，25℃处理3分钟)；
[0084]
(2)样本预处理：将人三阴型乳腺癌组织样本解离成单细胞悬液，用pbs清洗2-3次后，重悬于431μl的结合缓冲液(binding buffer)中(即含有0.1mg/ml牛血清白蛋白，0.1mg/ml鲱鱼精dna和5mmol/l氯化镁的pbs溶液)；
[0085]
(3)样本孵育：向上述单细胞悬液中加入69μl经过变复性的探针溶液，使体系中每种探针的终浓度为200nmol/l，然后置于4摄氏度摇床上孵育30分钟；
[0086]
(4)样本清洗：将上述经过探针孵育后的细胞进行离心(300g，5分钟)，弃掉上清液，用pbs清洗细胞5次，并重悬于pbs中。
[0087]
(5)样本上机：检测样本中细胞的存活率及结团率，达到存活率大于80％、结团率小于30％的要求后，采用商业化单细胞捕获平台及测序平台进行分析。
[0088]
结论：根据单细胞转录组降维聚类的结果(图6)，该组织样本中包含肿瘤细胞、t细胞、b细胞、髓样细胞等多种细胞类型。以seq no.38为例，该探针在组织样本中特异性富集在t细胞亚群上，这一分布模式与其对应的mrna表达分布模式高度一致(图7)，证明本发明方法能够在复杂组织样本中特异性检测特定靶标蛋白。此外，该探针在不同细胞亚群中的结合水平与其对应的mrna表达水平呈显著的正相关(图8)，证明该方法能够实现特定靶标蛋白表达水平的定量检测。
[0089]
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。