一种嵌合受体及其应用的制作方法

本发明涉及生物，具体涉及一种嵌合受体及其应用。

背景技术：

1、未经过hla配型同种异体细胞进行异源移植时，移植宿主的免疫细胞会对异源细胞产生免疫排斥(host anti-graft，hvg，宿主抗移植物反应)，nk和t细胞对其攻击，导致移植细胞死亡，无法长时间发挥细胞功能。现异体器官移植主要依靠hla配型来降低免疫排斥，同时服用免疫抑制剂对急性、慢性排斥进行抑制。

2、在通用化car-t使用中，无法使用免疫抑制剂的方式来解决hvg问题。现有的方案如敲除t细胞hla相关基因，并未能消除hvg反应：敲除b2m基因后car-t细胞能躲避宿主t细胞攻击，但无法躲避nk细胞攻击。

3、在未解决hvg问题的情况下，现有的通用型car-t细胞在fca(氟达拉滨+环磷酰胺+阿伦单抗)深度清淋的患者中体内存续时间也只有1个月左右，无法达到个性化car-t长达一年的体内存续时间，导致通用型car-t细胞整体治疗效果不理想，患者治疗后复发率较高。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种抑制宿主抗外源免疫细胞hvg反应的嵌合受体，其特异识别4-1-bb靶标，并且不包括激活信号转导结构域，从而避免了与car共表达时胞内信号转导过强的问题，可有效提高对4-1-bb阳性nk/t细胞的杀伤持续性。

2、为此，本发明的第一方面提供一种嵌合受体(chimeric receptor，cr)，所述嵌合受体包括：

3、(i)第一胞外结构域，所述第一胞外结构域包括特异性靶向4-1bb的结构域；以及

4、(ii)第一跨膜结构域；和

5、(iii)第一胞内结构域，所述第一胞内结构域包括第一共刺激结构域，并且不包括刺激信号转导结构域；

6、所述第一胞外结构域还包括第一铰链区，所述第一铰链区与所述第一跨膜结构域相连接。

7、在一些实施方式中，所述嵌合受体包括：第一胞外结构域，所述第一胞外结构域包括特异性靶向4-1bb的结构域；以及第一跨膜结构域；所述嵌合受体不包括胞内结构域。

8、在一些实施方式中，所述嵌合受体包括：第一胞外结构域，所述第一胞外结构域包括特异性靶向4-1bb的结构域；以及第一跨膜结构域；第一胞内结构域，所述第一胞内结构域包括第一共刺激结构域，并且不包括刺激信号转导结构域。

9、进一步，所述特异性靶向4-1bb的结构域包括抗4-1bb抗体或其抗原结合片段、或4-1bbl胞外结构域或其变体。

10、进一步，所述抗4-1bb抗体或其抗原结合片段选自下组：fab'片段、f(ab')2片段、双特异性fab二聚体(fab2)、三特异性fab三聚体(fab3)、fv、单链fv蛋白(scfv)、双抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定的fv蛋白(dsfv)和单结构域抗体(sdab、骆驼科动物vhh、纳米抗体)。

11、进一步，所述抗4-1bb抗体是人源化抗体或其抗原结合片段。

12、进一步，所述4-1bbl为人4-1bbl。

13、在一些实施方式中，所述4-1bbl胞外结构域包括如seq id no：1所示的氨基酸序列。

14、在一些实施方式中，所述第一铰链区包括选自下组蛋白质的铰链区的一种或两种以上的组合：igg、cd8、cd28。

15、在一些实施方式中，所述第一铰链区包括cd8铰链区，其包括如seq idno：2所示的氨基酸序列。

16、在一些实施方式中，所述第一铰链区包括igg的ch3结构域，其包括如seq id no：3所示的氨基酸序列。

17、在一些实施方式中，所述第一铰链区包括igg的ch3结构域和cd8铰链区。

18、在一些实施方式中，所述第一铰链区包括igg的ch3结构域和cd8铰链区。

19、在一些实施方式中，所述第一跨膜结构域选自下组蛋白质的跨膜结构域：cd4、cd8、cd28、cd3ζ、cd34。

20、在一些实施方式中，所述第一跨膜结构域包括cd8跨膜结构域，其包括seq id no：4所示的氨基酸序列。

21、进一步，所述第一共刺激结构域选自下组蛋白质的共刺激结构域中一个或多个：cd28、icos、4-1bb、ox20、ox40、cd27、cd30、hvem。

22、在一些实施方式中，所述第一共刺激结构域包括4-1bb共刺激结构域，其包括如seq id no：5所示的氨基酸序列。

23、进一步，所述第一胞内结构域不包括来自cd3ζ的胞内结构域。

24、进一步，所述嵌合受体还包括第一信号肽或第一前导序列。

25、在一些实施方式中，所述第一信号肽或第一前导序列包括如seq id no：6所示的氨基酸序列。

26、更进一步，所述嵌合受体分子还包括连接子，氨基酸序列如seq id no：21或seqid no：23所示。

27、在一些实施方式中，所述嵌合受体包括：4-1bbl胞外结构域或其变体，igg的ch3结构域，cd8铰链区，cd8跨膜结构域，4-1bb共刺激结构域。

28、在一些实施方式中，所述嵌合受体包括：4-1bbl胞外结构域或其变体，igg的ch3结构域，cd8铰链区，cd8跨膜结构域。

29、在一些实施方式中，所述嵌合受体包括：4-1bbl胞外结构域或其变体，cd8铰链区，cd8跨膜结构域。

30、在一些实施方式中，所述嵌合受体包括：4-1bbl胞外结构域或其变体，cd8铰链区，cd8跨膜结构域，4-1bb共刺激结构域。

31、在一些优选的实施方式中，所述嵌合受体包括：

32、(i)第一胞外结构域，所述第一胞外结构域包括特异性靶向4-1bb的结构域；以及

33、(ii)第一跨膜结构域；和

34、(iii)第一胞内结构域，所述第一胞内结构域包括第一共刺激结构域，并且不包括激活信号转导结构域。

35、第二方面，本发明提供一种分子组合，所述分子组合包括本发明第一方面所述的嵌合受体，和嵌合抗原受体(car)；所述嵌合抗原受体包括：

36、(iv)第二胞外结构域，所述第二胞外结构域包括抗原结合结构域；

37、(v)第二跨膜结构域；以及

38、(vi)第二胞内结构域，所述第二胞内结构域包括第二共刺激结构域，以及刺激信号转导结构域。

39、异体cart细胞进行移植时，会激活受者的免疫系统，导致受者出现针对异源移植物(cart)的免疫排斥反应，主要表现为部分受者t细胞攻击异源cart细胞。申请人在研究过程中发现，表达cr的car-t细胞，能有效攻击和清除被异体抗原激活的异源t细胞，从而使得car-t细胞异体移植后，能有效避免受者t细胞介导的免疫排斥，提高异体car-t的体内存续能力和细胞功能，进而增强肿瘤治疗效果。

40、进一步，所述抗原结合结构域为抗体或其抗原结合片段。

41、进一步，所述抗原结合结构域包含选自下组的抗体或其抗原结合片段：fab'片段、f(ab')2片段、双特异性fab二聚体(fab)2、三特异性fab三聚体(fab)3、fv、单链fv蛋白(scfv)、双抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定的fv蛋白(dsfv)和单结构域抗体(sdab、骆驼科动物vhh、纳米抗体)。

42、进一步，所述抗原结合结构域为人源化抗体或其抗原结合片段。

43、进一步，所述抗原结合结构域结合选自下组的抗原：肿瘤相关抗原(taa)、肿瘤特异性抗原(tsa)。

44、进一步，所述抗原结合结构域结合选自下组的抗原：b细胞成熟抗原(bcma)、cd4、cd7、cd16、cd19、cd20、cd22、cd30、cd33、cd37、cd38、cd44、cd44v6、cd44v7/8、cd70、cd79a、cd79b、cd123、cd133、cd138、cd171、癌胚抗原(cea)。

45、在一些实施方式中，所述抗原结合结构域结合cd19、cd20、cd22、bcma。

46、在一些实施方式中，所述抗原结合结构域包括如seq id no：7所示的氨基酸序列。

47、进一步，所述第二胞外结构域还包括第二铰链区，所述第二铰链区与所述第二跨膜结构域相连接。

48、在一些实施方式中，所述第二铰链区包括选自下组蛋白质的铰链区的一种或两种以上的组合：igg、cd8、cd28。

49、在一些实施方式中，所述第二铰链区包括cd8铰链区，其包括如seq idno：2所示的氨基酸序列。

50、在一些实施方式中，所述第二跨膜结构域选自下组蛋白质的跨膜结构域：cd4、cd8、cd28、cd3ζ。

51、在一些实施方式中，所述第二跨膜结构域包括cd8跨膜结构域，其包括如seq idno：4所示的氨基酸序列。

52、进一步，所述第二共刺激结构域选自下组蛋白质的共刺激结构域：cd28、icos、4-1bb、ox20、ox40、cd27、cd30、hvem。

53、在一些实施方式中，所述第二共刺激结构域包括cd28共刺激结构域，其包括如seqid no：8所示的氨基酸序列。

54、进一步，所述刺激信号转导结构域包含免疫受体酪氨酸活化基序(itam)。

55、进一步，所述刺激信号转导结构域分离自选自下组的蛋白质或多肽：fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、cd22、cd79a、cd79b和cd66d。

56、在一些实施方式中，所述刺激信号转导结构域分离自cd3ζ。

57、在一些实施方式中，所述刺激信号转导结构域包括如seq id no：9所示的氨基酸序列。

58、进一步，所述嵌合抗原受体还包括第二信号肽或第二前导序列。

59、在一些实施方式中，所述第二信号肽或第二前导序列包括以下氨基酸序列：seqid no：10。

60、在一些实施方式中，所述嵌合抗原受体包括：cd8铰链区，cd8跨膜结构域。

61、在一些实施方式中，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、cd8铰链区、cd8跨膜结构域以及第二胞内结构域；优选地，所述抗原结合结构域结合选自下组的抗原：肿瘤相关抗原、肿瘤特异性抗原；优选地，所述抗原结合结构域结合选自下组的抗原：bcma、cd4、cd7、cd16、cd19、cd20、cd22、cd30、cd33、cd37、cd38、cd44、cd44v6、cd44v7/8、cd70、cd79a、cd79b、cd123、cd133、cd138、cd171、癌胚抗原；优选地，所述第二胞内结构域包括第二共刺激结构域，以及激活信号转导结构域；优选地，所述第二共刺激结构域选自下组蛋白质的共刺激结构域中的一个或多个：cd28、icos、4-1bb、ox20、ox40、cd27、cd30、hvem；优选地，所述激活信号转导结构域分离自选自下组的蛋白质或多肽：fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、cd22、cd79a、cd79b和cd66d。

62、在一些优选地实施方式中，所述嵌合抗原受体包括：结合肿瘤抗原结合结构域，cd8铰链区，cd8跨膜结构域，cd28共刺激结构域，cd3ζ信号转导结构域。

63、在一些更优选地实施方式中，所述嵌合抗原受体包括：结合cd19的抗原结合结构域，cd8铰链区，cd8跨膜结构域，cd28共刺激结构域，cd3ζ信号转导结构域。

64、需要特别说明的是，本发明所述的cr分子，可以与任意结构的car分子在t细胞中共表达，不限于前面所述的car分子，只要其能够达到本发明所述的任一技术效果，比如增强的肿瘤杀伤能力、更优的car-t体内存续性、降低的hvg反应或降低的肿瘤复发率，均在本发明的保护范围内。

65、本发明的第三方面，提供一种核酸分子，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的嵌合受体和/或本发明第二方面所述的分子组合。

66、本发明的第四方面，提供一种载体，所述载体包含本发明第一方面所述的嵌合受体和/或本发明第二方面所述的分子组合。

67、进一步，所述载体是病毒载体或非病毒载体。

68、进一步，所述病毒载体选自下组：腺病毒载体、逆转录病毒载体、牛痘病毒载体、痘病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体、仙台病毒载体、麻疹病毒载体、猿猴病毒载体。

69、本发明的第五方面，提供一种细胞，所述细胞包括本发明第一方面所述的嵌合受体、本发明第二方面所述的分子组合、本发明第三方面所述的核酸分子、或本发明第四方面所述的载体。

70、进一步，所述细胞为真核细胞或原核细胞。

71、进一步，所述细胞为免疫细胞。

72、进一步，所述细胞选自下组：t细胞、b细胞、nk细胞、中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞。

73、在一些实施方式中，所述免疫细胞为t细胞。

74、在一些实施方式中，所述免疫细胞为嵌合抗原受体(car)转导的t细胞(car-t)。

75、在一些实施方式中，所述免疫细胞为t细胞受体转导的t细胞(tcr-t)。进一步，所述免疫细胞缺少trac、trbc、4-1bb和/或cd3蛋白的内源性表达；优选地，所述细胞缺少trac和/或4-1bb蛋白的内源性表达。申请人在研究过程中发现，cr-car t细胞存在一定程度的自杀伤能力，导致其增殖和扩增能力有所下降，而cr-car t细胞在进一步敲除4-1bb基因后，增殖能力可出现回升。

76、根据本发明的技术方案，当所述嵌合受体和嵌合抗原受体表达在trac、trbc或者cd3基因敲除的t细胞时，能获得真正意义上通用的car-t细胞。此类型细胞不表达tcr分子，无gvhd(移植物抗宿主反应)，并能够避免hvg反应。

77、需要特别说明的是，本发明的所述的嵌合分子(cr)，在某些情况下可以扩展到于t细胞受体嵌合型t细胞(tcr-t)中表达。

78、本发明的第六方面，提供一种药物组合物，其包括本发明第五方面所述的细胞和药学上可接受的载体。

79、本发明的第七方面，提供本发明第一方面所述的嵌合受体、第二方面所述的分子组合、第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的载体、第五方面所述的细胞或第六方面所述的药物组合物在制备抑制免疫排斥反应的药物中的应用。

80、本发明的第八方面，提供本发明第一方面所述的嵌合受体、第二方面所述的分子组合、第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的载体、第五方面所述的细胞或第六方面所述的药物组合物在制备治疗癌症的药物中的应用。

81、进一步，所述癌症包括肝癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、膀胱癌、脑癌、头颈癌、骨癌、甲状腺癌、肾癌、皮肤癌、白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤等。

82、与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下进步：

83、本发明提出了新型嵌合分子——嵌合受体cr分子，其特异识别4-1bb靶标，并且不包括激活信号转导结构域，在与car分子在免疫细胞如t细胞共表达时，体内存续性较强，增强了car阳性免疫细胞对4-1-bb阳性nk/t细胞和car靶标抗原阳性细胞的杀伤持续性。

84、本发明还提供了包含嵌合受体和嵌合抗原受体的分子组合，及相应的载体、细胞等。当细胞(例如t细胞)共表达cr分子和car后，其能够特异识别4-1-bb阳性t/nk细胞并进行杀伤，并且具有良好的持续性，从而解决异体移植时产生的hvg问题。另一方面，共表达cr分子和car分子的细胞显示出增强的肿瘤杀伤能力，包括能够识别低抗原丰度的肿瘤细胞、更优的car-t代谢和分化表型、更优的car-t体内存续性，从而提高通用型car-t细胞体内存续时间，降低肿瘤复发率。