一种S-尼古丁的制备方法与流程

本发明涉及生物合成，尤其涉及一种s-尼古丁的制备方法。

背景技术：

1、尼古丁是烟草中的重要成分，同时也是电子烟配方、某些烟碱类药物合成的核心原料。

2、传统的烟叶栽培、提取、纯化的方法占地面积大、耗费周期长，且由于提取中不可避免的会含有其它剧毒成本而导致人体危害大。因此利用化学或生物工艺直接合成成为s-尼古丁制备的重要途径。

3、几种常见的s-尼古丁制备方法：

4、

5、路线i:化学法制备外消旋尼古丁。通过吡啶乙醛做原料，通过三步化学反应制备尼古丁消旋体，然后利用化学试剂或酶进行手性拆分得s-尼古丁。以上几步化学反应需要用到剧毒(nacn等),易爆(raneyni氢化)等复杂危险生产工艺。(参考文献：国际专利wo2017/119003ai；“aprocess forthe preparation of nicotine”)。

6、路线ii:化学法直接制备s-尼古丁。利用吡啶乙胺作为起始原料，三步化学转化得到s-尼古丁。前两步反应催化剂昂贵，反应条件苛刻；最终收率也偏低(<50％)。(参考文献:josha t.ayers,aaps 2005,“a general procedure for the enantioselectivesynthesis of the minor tobacco alkaloids nornicotine,anabasine,andanatabine”).

7、路线iii:利用尼古丁前体麦司明(myosmine)作原料，然后利用酶手性还原、化学试剂甲基化制备s-尼古丁。虽然该路线比较短，收率高，但由于使用昂贵的麦司明作为起始原料，故生产成本高。

8、以上三种经典的s-尼古丁制备工艺可以得出，路线i、路线ii两种化学制备方法虽然也采用比较便宜的原料，整体路线也不长(三步或四步反应),但是反应所涉及到的化学催化剂昂贵(bf3,lda,nabh4)、操作危险(lda,nacn)等因素导致其规模化生产中的环境成本与安全成本都很高。路线iii以麦司明作为原料，利用亚胺还原酶手性还原得s-去甲烟碱(nornicotine),然后采用化学法进行甲基化；该路线的缺陷是需要利用昂贵的麦司明作为原料，从而使整体生产成本大大增加。同时，随着科学技术的发展，国家对化学工业的绿色生产指数要求越来越高。因此，提供一种操作步骤简单、成本低、安全环保的s-尼古丁的生产工艺具有重要的意义。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种s-尼古丁的制备方法，该方法以1-甲基吡咯烷与烟酸为原料，一次性转化成s-尼古丁，工艺简单，反应收率高，成本低，对环境友好。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了胺氧化酶突变体，其氨基酸序列为：

4、如seq id no:1或seq id no:2所示的氨基酸序列；或

5、seq id no:1或seq id no:2经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的功能与seq id no:2相同或相似的氨基酸序列；或

6、与seq id no:1或seq id no:2所示氨基酸序列至少有90％同源性且功能与seqid no:1或seq id no:2所示氨基酸序列相同或相似的氨基酸序列。

7、本发明中，胺氧化酶突变体1(ao1)与胺氧化酶突变体2(ao2)均来源于黑曲霉(aspergillusniger)体内的一个单胺基氧化酶，该野生型酶的氨基酸序列号为：uniprotid:p46882,ec1.4.3.4。

8、其中，所述胺氧化酶突变体包含5个位点突变：m242r、w230i、t354s、y365v、w430r，命名为胺氧化酶突变体1(简称ao1)其，氨基酸序列如seq id no:1所示。

9、一些实施方案中，所述胺氧化酶突变体包含10个位点突变：f210m,l213c,m242v,i246t,r259k,r260k，n336s,t384n,d385s,w430g，命名为胺氧化酶突变体2(简称ao2)，其氨基酸序列如seq id no:2所示。

10、本发明还提供了编码所述胺氧化酶突变体的核酸。

11、一些实施方案中，编码所述的氧化酶突变体的核苷酸序列如seq id no:3或seqid no:4所示。其中，编码胺氧化酶突变体1(ao1)的核苷酸序列如seq id no:3所示，编码胺氧化酶突变体2(ao2)的核苷酸序列如seq id no:4所示。

12、本发明提供了尼古丁合成酶突变体，其氨基酸序列为：

13、如seq id no:3所示的氨基酸序列；或

14、seq id no:5经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的功能与seq id no:5相同或相似的氨基酸序列；或

15、与seq id no:5所示氨基酸序列至少有90％同源性且功能与seq idno:5相同或相似的氨基酸序列。

16、本发明中，尼古丁合成酶突变体来源于茄科植物三分三(anisodus acutangulus)的一种氧化还原型缩合酶，野生型尼古丁合成酶的氨基酸序列号为6j1m。

17、一些实施方案中，所述尼古丁合成酶突变体包含14个位点突变：m17h,r112t,q113f,l162a,q180e,f183a,s212k,a229p,p248l,v254r,a261h,k341v,r346t,g394t，其氨基酸序列如seq id no:5所示。

18、本发明还提供了编码所述的尼古丁合成酶突变体的核酸。

19、一些实施方案中，编码所述的尼古丁合成酶突变体的核苷酸序列如seq id no:6所示。

20、本发明提供了其氨基酸序列为：

21、如seq id no:7所示的氨基酸序列；或

22、seq id no:7经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的功能与seq id no:7相同或相似的氨基酸序列；或

23、与seq id no:7所示氨基酸序列至少有90％同源性且功能与seq idno:7相同或相似的氨基酸序列。

24、本发明中，亚磷酸脱氢酶(ptdh)突变体由施氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)体内一个亚磷酸脱氢酶改造而来，野生型氨基酸序列为uniprotid:o69054,ec1.20.1.1。

25、一些实施方案中，所述亚磷酸脱氢酶突变体包含13个位点突变：v71i,q132r,e130k,q137r,i150f,a176r,q215l,r275q,l276q,i313l,v315a,a319e,a325v，其氨基酸序列如seq id no:7所示。

26、本发明还提供了编码所述亚磷酸脱氢酶突变体的核酸。

27、一些实施方案中，编码所述亚磷酸脱氢酶突变体的核苷酸序列如seq idno:8所示。

28、本发明提供一种复合酶，包括如下至少如(a)～(b)所示的两种：

29、(a)胺氧化酶或其突变体；

30、(b)尼古丁合成酶或其突变体；

31、(c)亚磷酸脱氢酶或其突变体；

32、(d)过氧化氢酶或其突变体。

33、本发明中，一些实施方案中，所述复合酶包括(a)～(b)所示的两种，即胺氧化酶突变体和亚磷酸脱氢酶突变体两种酶。

34、一些实施方案中，本发明所述复合酶包括(a)～(b)所示的酶：

35、(a)胺氧化酶或其突变体；和

36、(b)尼古丁合成酶或其突变体；和

37、(c)亚磷酸脱氢酶或其突变体；和

38、(d)过氧化氢酶或其突变体。

39、一些具体实施例中，本发明提供的复合酶包括胺氧化酶突变体、亚磷酸脱氢酶突变体、尼古丁合成酶突变体和过氧化氢酶。

40、一些实施方案中，本发明提供的上述复合酶中，所述胺氧化酶突变体的氨基酸序列如seq id no:1或seq id no:2所示；

41、所述尼古丁合成酶突变体的氨基酸序列如seq id no:5所示；

42、所述亚磷酸脱氢酶突变体的氨基酸序列如seq id no:7所示；

43、所述过氧化氢酶(catalase)购买获得，本发明具体实施例中，过氧化氢酶购于诺维信酶制剂公司(terminoxultra)。

44、本发明还提供了所述复合酶在制备s-尼古丁中的应用。

45、本发明还提供一种s-尼古丁的制备方法，包括：

46、在溶剂、氧气和nadph存在的条件下，将1-甲基吡咯烷、烟酸与所述复合酶混合，反应，生成s-尼古丁。

47、本发明提供的制备方法中，利用复合酶中的胺氧化酶或其突变体将1-甲基吡咯烷氧化成对应的亚胺，然后再尼古丁合成酶或其突变体催化下将所述亚胺与烟酸缩合脱羧，得到s-尼古丁，合成路线图见图1。

48、其中，第一步的氧化反应中需要用到氧气，反应同时会产生过氧化氢副产物，因此，在一些实施方案中，本发明通过添加少量的过氧化氢酶(catalase)可以有效除去体系内的过氧化氢，同时还能循环利用o2。

49、第二步的缩合脱羧反应需要辅酶nadph的参与，由于该辅酶比较昂贵，通过在同一体系内添加nadph再生系统(亚磷酸氧化酶ptdh)，可有效再生该辅酶，从而得以大大减少其用量，降低生产成本。

50、一些实施方案中，所述nadph由nadph再生系统生成，所述nadph再生系统包括β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸单钠盐、五水亚磷酸钠和亚磷酸脱氢酶突变体。

51、一些实施方案中，所述溶剂为三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液或含助溶剂的三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液。助溶剂可促进各底物在溶剂中的溶解，有利于反应的进行。本发明认为常用的可行的助溶剂种类均可，包括但不仅限于异丙醇、丙酮、dmso，其中，本发明具体实施例中，以异丙醇为底物助溶剂，效果更优。

52、具体地，本发明s-尼古丁的制备方法，包括：

53、在三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液中依次加入1-甲基吡咯烷烟酸、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸单钠盐、五水亚磷酸钠和异丙醇，调节ph至6.5～9.0加入复合酶，获得反应体系；

54、将所述反应体系于1.0～2.0大气压的氧气压力下25～35℃缓慢搅拌反应4～8小时，反应结束后调节ph至9.0～11.0经乙酸乙酯萃取、合并有机相，干燥、过滤、浓缩后，获得s-尼古丁。

55、一些具体实施例中，s-尼古丁的制备方法，包括：

56、在三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液中依次加入1-甲基吡咯烷烟酸、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸单钠盐、五水亚磷酸钠和异丙醇，调节ph至8.0后加入复合酶，获得反应体系；

57、将所述反应体系于1.5大气压的氧气压力下30℃缓慢搅拌反应6小时，反应结束后调节ph至10.0，依次经乙酸乙酯萃取、合并有机相、干燥、过滤、浓缩后，获得s-尼古丁。

58、一些实施方案中，本发明所述复合酶包括胺氧化酶突变体、亚磷酸脱氢酶突变体、尼古丁合成酶突变体和过氧化氢酶。其中，所述胺氧化酶突变体、尼古丁合成酶突变体、亚磷酸脱氢酶突变体和过氧化氢酶的酶活力之比优选为(1.5～2.5)：(2.5-5)：(4～8)：1。一些具体实施例中，胺氧化酶突变体、尼古丁合成酶突变体、亚磷酸脱氢酶突变体和过氧化氢酶的酶活力之比为2：4：6：1。

59、一些实施方案中，所述反应体系中：

60、所述1-甲基吡咯烷的浓度为150～250mm，具体可为150mm、200mm或250mm；

61、所述克烟酸的浓度为150～250mm，具体可为150mm、200mm或250mm；

62、所述β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸单钠盐的浓度为0.2～0.6mm，具体可为0.2mm、0.4mm或0.6mm；

63、所述五水亚磷酸钠的浓度为200～300mm，具体可为200mm、240mm或300mm；

64、所述异丙醇的体积分数为1～5％，具体可为1％或5％。

65、本发明开创性地利用胺氧化酶将1-甲基吡咯烷氧化成对应的亚胺，然后在尼古丁合成酶催化下将该亚胺与烟酸缩合脱羧得到最终产品s-尼古丁。该方法在一个反应体系中通过两步反应，即可获得手性专一的s-尼古丁，合成路线短、收率高、反应条件温和易规模化生产；同时，原料来源广泛、价格低廉，生产成本较低，对环境友好，在显著降低尼古丁生产成本的同时也使得其更符合当今绿色工业生产的需求。