基于ERA技术的对虾肝肠胞虫快速检测方法及引物与探针组合

基于era技术的对虾肝肠胞虫快速检测方法及引物与探针组合
技术领域
1.本发明涉及病原体检测技术领域，特别涉及基于era技术的对虾肝肠胞虫快速检测方法及引物与探针组合。


背景技术：

2.肝肠胞虫(enterocytozoon hpatopenaei,ehp)又称肠胞虫，隶属于真菌界(fungi)、微孢子门(microsporidia)，肠胞虫属(enterocytozoon)，是一种胞内寄生虫，主要寄生于对虾的肝胰腺上皮细胞，具有高度传染性。ehp最早于2003年在泰国斑节对虾(penaeus monodon)中发现，随后国内外对其开展大量相关研究。近年来，ehp引起对虾生长缓慢的现象在东南亚频繁报道。从2013年开始，我国多个省市的虾类养殖基地先后发现了ehp感染，并且感染率呈上涨趋势。被感染的对虾虽不影响饲养和存活率，但对虾通常表现为生长缓慢，个体大小不均，免疫力低下，易被其他病原体感染，已成为我国对虾养殖的重要病原之一。由于目前尚无治疗ehp的有效方法，只能通过即时检测和综合防控，才能避免病原体的流行与扩散。
3.ehp个体微小，被感染的对虾症状不明显，因此，很难在现场确诊。传统的组织切片方法制作时间长，流程复杂，在肝肠胞虫含量低的条件下不易发现，不适合作为判断是否感染发病的技术手段。现有免疫学检测方法，虽可以检测不同种类的微孢子虫，但是灵敏度不高，易出现假阳性，抗体筛查过程缓慢，且价格昂贵。而分子生物学方法具有快速、简便和灵敏度高等特点，已成为实验室检测ehp的常规手段。目前常用的检测方法有普通pcr、巢式pcr、qrt-pcr、原位杂交、环介导等温扩增技术(lamp)等方法。这些方法普遍存在耗时长，操作复杂，成本高昂的特点。其中lamp技术可在恒温条件进行，但引物体系复杂，易产生假阳性。这些特点限制了上述方法的现场检测使用。因此，需开发一种快速简便的检测方法，对ehp的预防具有重要意义。本发明建立了era恒温荧光检测ehp的方法，快速方便，准确可靠，满足养殖场现场检测需求。
4.酶促重组等温扩增(enzymatic recombinase amplification，era)是一种恒温扩增技术，反应体系中的重组酶与引物结合形成蛋白-dna复合物,与核酸模板上的同源序列结合，同时在单链dna结合蛋白(ssb)协助下,dna聚合酶引导产生解链和dna合成,最终形成新的dna双链,从而实现高效扩增。与其他恒温扩增技术相比，era可在25～45℃条件下进行扩增反应，不需要热变性，对硬件设备要求低，并且核酸扩增速度较快，可在20min内获得目的扩增产物，能够在现场检测快速出具报告，极大缩短了检测时间。


技术实现要素：

5.本发明为解决现有技术中出现的问题，提供了一种对虾肝肠胞虫era恒温荧光检测方法及引物与探针组合，可以明显缩短对虾肝肠胞虫的检测时间；同时操作简单，灵敏度高、特异性强，满足快速检测的需求，为对虾养殖中肝肠胞虫的监测提供了一种有效手段。
6.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
7.本发明目的之一是，提供基于era技术的对虾肝肠胞虫的引物与探针组合，包括一对era特异性引物和一条特异性荧光探针：
8.正向引物：5'ttgcagagtgttgttaagggtttaagta3'(seq id no.1)
9.反向引物：5'cttctttaagctgtttgtctccaactgtatt 3'(seq id no.2)
10.探针：5'agagacgatatttacacagacacagcattt 3'(seq id no.3)(thf)5'taggatatgagctttc 3'(seq id no.4)(c3-spacer)
11.优选地，核苷酸序列如seq id no.3所示的所述探针的3'端标记荧光报告基团，核苷酸序列如seq id no.4所示的所述探针的5'端标记荧光淬灭基团；在所述荧光报告基团和荧光淬灭基团之间插入一个四氢呋喃。
12.优选地，所述荧光报告基团为fam，荧光淬灭基团为bhq1；在era体系中引入带荧光标记的探针，配合相应扩增引物，可以有效提高era检测的特异性。
13.优选地，核苷酸序列如seq id no.3所示的所述探针，自5'端起第30位碱基t标记荧光报告基团(6fam-dt)，核苷酸序列如seq id no.4所示的所述探针，自5'端起第1位碱基t标记荧光淬灭基团(bhq1-dt)；核苷酸序列如seq id no.4所示的所述探针，3'端还标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团(c3-spacer)。
14.本发明目的之二是，提供上述的引物与探针组合用于era技术的对虾肝肠胞虫的快速检测方法，包括如下步骤：
15.1)提取待测样本对虾的dna；
16.2)以该dna为模板，采用上述引物对和荧光探针进行era扩增，用荧光检测装置检测扩增体系中荧光信号的变化，判断待测样本对虾是否感染肝肠胞虫。
17.优选地，所述样本为成虾，则提取肝胰腺组织，所述样本为虾苗，则提取甲壳下组织。
18.优选地，所述era扩增的温度为36～42℃；推荐温度为42℃。
19.优选地，所述era扩增的反应时间为20min，共40个循环。
20.优选地，所述era扩增的反应体系包括所述引物对、所述探针、溶解剂、dna模板和激活剂；所述引物的加量为2.0～3.0μl，探针加量为0.6-1.0μl。
21.优选地，era扩增结果判定方法如下：
22.era荧光扩增曲线呈“s”型且ct值≤35，判断为对虾肝肠胞虫阳性结果；
23.era荧光扩增曲线不呈“s”型或ct值＞35，判断为对虾肝肠胞虫阴性结果。
24.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
25.(1)操作简便。本发明涉及的检测方法可摆脱对大型仪器及专业检测实验室的依赖，在36～42℃下完成检测，无需专业操作人员，可在户外进行，有实际的使用需求。
26.(2)高效快速。本发明涉及的检测方法整个过程可在半小时内完成，提高对虾肝肠胞虫检测的效率。
27.(3)高特异及灵敏性。本发明涉及的检测方法对对虾常见病原基因组dna，包括急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreatic necrosis disease,ahpnd)病原菌、传染性表皮与造血组织坏死症病毒(infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,ihhnv)、白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,wssv)，均不发生非特异性
扩增；检测灵敏性为101copies/μl。
28.(4)成本低。本发明所使用的设备结构简单，检测成本低，适合水产类对成本敏感的客户，适合推广使用。
附图说明
29.图1为最佳era引物对的筛选结果。其中，第一组引物对为ehp-f1/r1，第二组引物对为ehp-f2/r2。
30.图2为era扩增条件温度优化结果。其中，温度梯度为：30℃、33℃、36℃、39℃、42℃、45℃。
31.图3为era反应体系引物浓度优化结果。其中，反应体系中引物加量分别为1.5μl，2.0μl，2.5μl，3.0μl。
32.图4为era反应体系探针浓度优化结果。其中，反应体系中探针加量分别为0.6μl，0.8μl，1.0μl。
33.图5为本发明的灵敏性检测结果。其中，模板浓度分别为105copies/μl、104copies/μl、103copies/μl、102copies/μl、101copies/μl、100copies/μl；ntc为阴性对照。
34.图6为本发明的特异性检测结果。其中，包含对虾白斑综合症病毒(wssv)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(ihhnv)、急性肝胰腺坏死病(ahpnd)病原菌和健康对虾的dna；ntc为阴性对照。
具体实施方式
35.下面结合具体附图及实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明的进一步说明。
36.下述实施例中所使用的实验方法无特殊说明，均为常规方法。
37.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
38.下述实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
39.下述实施例中的era荧光型核酸扩增试剂盒是苏州先达基因科技有限公司的产品，产品货号：ks103。
40.实施例1-引物探针设计及筛选结果
41.本发明以对虾肝肠胞虫胞壁蛋白swp基因为检测靶基因，genebank数据库中登录号为kx258197。首先在ncbi上找到swp基因的保守区，使用primer premier 5.0软件设计了2组引物和探针，并在ncbi数据库中进行blast比对，引物和探针的序列如表1所示。上述引物和探针均由生工生物工程(上海)股份公司合成。
42.表1引物和探针序列
[0043][0044]
使用era荧光型核酸扩增试剂盒，对表1中设计合成的引物进行筛选。
[0045]
反应体系为50μl，包含各2.1μl(10μm)的正、反向引物，0.6μl(10μm)的探针，20μl的溶解剂，2μl的阳性标准品，加无菌水至48μl。混匀后，将48μl预混液转移至每管冻干粉中，振荡混匀并短暂离心，使冻干粉充分溶解。对于每份样本，在反应管盖上加上2μl激活剂，通过短暂离心使激活剂进入预混液中，短暂振荡混匀并再次快速离心。将反应管迅速放入实时荧光定量pcr仪中，在40℃下反应20min，每30秒采集一次fam通道荧光值。
[0046]
该体系中所涉及的阳性标准品为包含ehp检测靶基因的重组质粒，将质粒进行10倍梯度稀释，选择浓度为105copies/μl作为反应模板。
[0047]
引物的筛选结果如图1所示，根据比较ct值大小及荧光强度高低，选定ehp-f1/r1为最佳引物对并进行后续实验。
[0048]
实施例2-era扩增条件温度优化
[0049]
为确定era扩增反应的最适温度，使用ehp-f1/r1引物对进行反应试验，操作如实施例1，分别在30℃、33℃、36℃、39℃、42℃、45℃条件下进行扩增。
[0050]
温度优化结果如图2所示。结果表明，era反应体系在36～42℃能进行较好扩增，推荐温度为42℃。
[0051]
实施例3-era反应体系中引物探针浓度优化
[0052]
为确定era扩增反应中引物探针最适浓度，我们测试了不同引物浓度(1.5μl，2.0μl，2.5μl，3.0μl)和探针浓度(0.6μl，0.8μl，1.0μl)，操作如实施例1，反应在42℃下进行。
[0053]
引物探针浓度优化结果分别如图3，4。结果表明，era反应体系中引物最适浓度为
400nm，探针最适浓度为120nm。
[0054]
实施例4-era检测灵敏性试验
[0055]
为确定对虾肝肠胞虫era扩增反应的灵敏性，以阳性标准品为模板，并将其10倍梯度稀释(1
×
105～1
×
100copies/μl)，以这6个浓度梯度进行扩增试验。
[0056]
检测结果如5所示。结果表明：本发明的对虾肝肠胞虫era检测方法的灵敏性为101copies/μl。
[0057]
实施例5-era检测特异性试验
[0058]
为确定对虾肝肠胞虫era扩增反应的特异性，分别以对虾白斑综合症病毒(wssv)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(ihhnv)、急性肝胰腺坏死病(ahpnd)病原菌和健康对虾的dna进行检测。
[0059]
检测结果如6所示。结果表明：本发明的对虾肝肠胞虫era检测方法仅对ehp样品出现正常扩增，wssv、ihhnv、ahpnd、健康对虾样品及阴性对照(无菌水)均未出现扩增。上述结果说明，本发明的设计的引物与探针不与其他病原发生交叉反应，不会出现假阴性，特异性强。
[0060]
实施例6-肝肠胞虫的era恒温荧光检测方法
[0061]
步骤如下：
[0062]
1)提取待测样本对虾的dna；
[0063]
1.1样本选择：若为成虾则取肝胰腺，若为虾苗则取甲壳下组织。
[0064]
1.2样本dna提取：采用核酸快提试剂盒、海洋动物组织dna提取试剂盒或者传统方法提取。
[0065]
2)以该dna为模板，采用上述引物对和荧光探针进行era扩增，用荧光检测装置检测扩增体系中荧光信号的变化；
[0066]
2.1按照下表2所述制备每份样本的预混液：
[0067]
era反应体系组分每管加样量/μl溶解剂20正向引物(10μm)2反向引物(10μm)2探针(10μm)0.6模板dna2无菌水21.4体积48
[0068]
将预混液充分振荡混匀并短暂离心。
[0069]
2.2对于每份样本，将48μl预混液转移至每管冻干粉中。振荡混匀并短暂离心。
[0070]
2.3对于每份样本，在反应管盖上加上2μl激活剂，小心盖紧管盖，通过短暂离心使激活剂进入预混液中。短暂振荡混匀并再次快速离心
[0071]
2.4将反应管放入荧光检测装置，在42℃下反应20min，每30秒采集一次fam通道荧光值。(检测设备：任何能激发和检测所选荧光团，并能将温度稳定于36-42℃的荧光检测仪都适用，如gs8荧光恒温扩增仪，abi 7500，lightcycler480，cfx 96等荧光定量pcr仪等。)
[0072]
2.5反应结束后，保存数据并弃置样本管。
[0073]
3)结果判定。根据比较ct值大小及荧光强度高低对对虾中肝肠胞虫进行定性检测。
[0074]
其结果判定根据最终荧光扩增曲线分析待测样本，荧光曲线呈“s”型且ct值≤35，判断为对虾肝肠胞虫阳性结果；当待测样本曲线不呈“s”型或ct值＞35，判断为对虾肝肠胞虫阴性结果。
[0075]
本发明选取肝肠胞虫的swp基因作为检测的靶基因，针对靶基因序列设计了era检测专用引物和探针，并建立肝肠胞虫的era检测方法。通过实验证明：本发明的肝肠胞虫era检测方法可在36～42℃下30min内完成检测，灵敏性为101copies/μl，与我国水产行业标准推荐的nest pcr、qpcr的检测水平相当，并与wssv、ihhnv、ahpnd、健康对虾样品及阴性对照(无菌水)均未出现非特异性扩增，快速方便，准确可靠，可满足养殖场现场检测需求。
[0076]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。