用于增加蛋白质分泌的信号肽的制作方法

本发明涉及一种编码融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白包含分泌信号和目的蛋白，所述分泌信号包含(i)源自kre1蛋白的信号肽序列或源自swp1蛋白的信号肽序列；和任选地(ii)α-交配因子(mfα)前导序列。本发明进一步涉及一种如本文所定义的分泌信号、包含所述核酸分子的表达盒以及包含所述核酸分子或表达盒的重组真核宿主细胞。本发明进一步涵盖一种在真核宿主细胞中制备目的蛋白的方法和一种增加目的蛋白自真核宿主细胞中的分泌的方法。本发明还提供了所述分泌信号用于增加重组目的蛋白自真核宿主细胞中的分泌的用途和重组宿主细胞用于制备重组目的蛋白的用途。发明背景酵母，特别是巴斯德毕赤酵母(p.pastoris，同物异名：komagataella phaffii)是用于分泌重组蛋白的常用表达系统。分泌中的最初和关键步骤是重组蛋白向内质网(er)中的易位。该过程由融合到重组蛋白的n-端分泌信号指导。信号序列指定了在常规分泌通路上到达er的共翻译或翻译后靶向途径(ng等，1996)。巴斯德毕赤酵母中最常用的分泌信号是酿酒酵母α-交配前原前导序列(mfα)(lin-cereghino等，2013)。该信号介导酿酒酵母中的翻译后易位，很可能在巴斯德毕赤酵母中也是如此(fitzgerald和glick,2014；ng等，1996)。其它分泌信号不断地被加入到所有库中，并用不同的重组蛋白进行测试。由于许多哺乳动物蛋白的生物发生可能需要共翻译易位，mfα信号序列实际上可能是次优的，并且优选使用共翻译信号序列(ng等，1996)。如今，哺乳动物抗体已经成为生物制药市场中的主要产品类别(ecker等，2015)。已知抗体在其天然环境中共翻译易位(feige等，2010)。发展更小抗原结合片段(如fab、scfv和vhh)的趋势也是明显的(nelson和reichert，2009；walsh，2014)。特别地，fab片段有时分泌效率低，因此仅达到低生产滴度(titer)(looser等，2015；pfeffer等，2011)。这可能是由于已经被报道为引起易位瓶颈的翻译后信号序列mfα(fitzgerald和glick，2014；zahrl等，2018)。wo2018165589a2和wo2018165594公开了一种重组分泌信号，其包含源自酿酒酵母的mfα前导序列和与源自酿酒酵母的mfα前导序列不同的信号肽。fitzgerald等(microb cell fact13,125(2014))公开了一种杂合分泌信号，其由后面是mfα前导序列的ost1信号序列组成。因此，仍然需要增加各种蛋白(比如抗体)分泌的分泌信号。因此，技术问题是要满足这种需要。

背景技术：

技术实现思路

1、上述技术问题通过权利要求中限定的主题来解决。本发明人惊奇地发现，包含源自kre1蛋白(内部命名为sp14)或swp1蛋白(内部命名为sp4)的信号肽序列、信号肽或前原序列(所有术语可互换使用)，任选与α-交配因子(mfα)前导序列组合的融合蛋白的分泌显著增加。换言之，包含本发明的分泌信号的蛋白将以较高速率分泌，同时分泌信号将被切除(参见实施例6-8)。

2、因此，本发明涉及一种编码融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白从n-端到c-端包含

3、(a)分泌信号，所述分泌信号包含

4、(i)(i)源自kre1蛋白的信号肽序列或源自swp1蛋白的信号肽序列；以及

5、(ii)α-交配因子(mfα)前导序列；

6、或

7、(ii)源自kre1蛋白的信号肽序列或源自swp1蛋白的信号肽序列；以及

8、(b)目的蛋白。

9、本发明涉及一种编码融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白从n-端到c-端包含

10、(a)分泌信号，所述分泌信号包含

11、(i)源自kre1蛋白的信号肽序列或源自swp1蛋白的信号肽序列；以及

12、(ii)α-交配因子(mfα)前导序列；以及

13、(b)目的蛋白。

14、特别地，本发明提供编码融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白从n-端到c-端包含

15、(a)分泌信号，所述分泌信号包含

16、(i)源自kre1蛋白的信号肽序列；以及

17、(ii)α-交配因子(mfα)前导序列；以及

18、(b)目的蛋白。

19、本发明还涉及一种编码融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白从n-端到c-端包含

20、(a)分泌信号，所述分泌信号包含

21、(i)源自swp1蛋白的信号肽序列；以及

22、(ii)α-交配因子(mfα)前导序列；以及

23、(b)目的蛋白。

24、本发明进一步涉及一种编码融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白从n-端到c-端包含

25、(a)分泌信号，所述分泌信号包含

26、(i)源自kre1蛋白的信号肽序列或源自swp1蛋白的信号肽序列；以及

27、(b)目的蛋白。

28、特别地，本发明进一步涉及一种编码融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白从n-端到c-端包含

29、(a)分泌信号，所述分泌信号包含

30、(i)源自kre1蛋白的信号肽序列；以及

31、(b)目的蛋白。

32、本发明进一步涉及一种编码融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白从n-端到c-端包含

33、(a)分泌信号，所述分泌信号包含

34、(i)源自swp1蛋白的信号肽序列；以及

35、(b)目的蛋白。

36、本发明进一步涉及一种编码融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白从n-端到c-端包含

37、(a)分泌信号，所述分泌信号由

38、(i)源自kre1蛋白的信号肽序列或源自swp1蛋白的信号肽序列组成；以及

39、(b)目的蛋白。

40、特别地，本发明进一步涉及一种编码融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白从n-端到c-端包含

41、(a)分泌信号，所述分泌信号由

42、(i)源自kre1蛋白的信号肽序列组成；以及

43、(b)目的蛋白。

44、本发明进一步涉及一种编码融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白从n-端到c-端包含

45、(a)分泌信号，所述分泌信号由

46、(i)源自swp1蛋白的信号肽序列组成；以及

47、(b)目的蛋白。

48、设想与表达本文定义的核酸分子、但该核酸分子包含野生型酿酒酵母α-交配因子分泌信号(比如seq id no：4)而非本文定义的分泌信号，的真核宿主细胞相比，所述分泌信号增加目的蛋白自真核宿主细胞中的分泌。

49、源自kre1蛋白的信号肽序列可以包括seq id no：1或其功能同系物。源自kre1蛋白的信号肽序列可由seq id no：1或其功能同系物组成。具体而言，seq id no：1的功能同系物与seq id no：1包含至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少94％、或至少95％的序列同一性。具体而言，与seq id no：1相比，功能同系物包含一个、两个或三个点突变。具体而言，在例如真菌或酵母宿主细胞(比如komagataella宿主细胞)的真核宿主细胞中功能同系物具有信号肽的功能。

50、源自swp1蛋白的信号肽序列可包括seq id no：2或52，或其功能同系物。源自swp1蛋白的信号肽序列可由seq id no：2或52或其功能同系物组成。具体而言，seq id no：2或seq id no：52的功能同系物与相应的seq id no：2或seq id no：52包含至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少94％、或至少95％的序列同一性，具体而言，与相应的seq id no：2或seq id no：52相比，功能同系物包含一个、两个或三个点突变。具体地，在例如真菌或酵母宿主细胞(比如komagataella宿主细胞)的真核宿主细胞中功能同系物具有信号肽的功能。

51、mfα前导序列可以包含seq id no：3或53或74-80中的任何一个，或其功能同系物。mfα前导序列可以由seq id no：3或53或74-80中的任何一个或其功能同系物组成，优选由seq id no：3或53或其功能同系物组成。具体地，seq id no：3、53或74-80中任一个的功能同系物与相应的seq id no：3、53或74-80具有至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少98％的序列同一性，具体地，与相应的seq id no：3、53或74-80相比，功能同系物包含一个、两个或三个点突变。具体地，在例如真菌或酵母宿主细胞(比如komagataella或saccharomyces宿主细胞)的真核宿主细胞中功能同系物具有前导序列的功能。mfα前导序列优选在对应于seq id no：53的位置23的位置上包含ser和/或在对应于seq id no：53的位置64的位置上包含glu。

52、目的蛋白选自抗体，比如嵌合抗体、人源化抗体或人抗体，或双特异性抗体，或诸如fab或f(ab)2的抗原结合抗体片段，诸如scfv的单链抗体，诸如骆驼的vhh片段的单结构域抗体或重链抗体或结构域抗体(dabs)，人工抗原结合分子，比如darpin、ibody、affibody、humabody或基于脂质运载蛋白家族多肽的突变蛋白，酶，比如加工酶，细胞因子，生长因子，激素，蛋白抗生素，诸如毒素融合蛋白的融合蛋白，结构蛋白，调节蛋白和疫苗抗原，优选其中所述目的蛋白为治疗性蛋白、食品添加剂或饲料添加剂。

53、在另一方面，本发明涉及一种如本文所定义的分泌信号。特别地，本发明涉及一种分泌信号，其包含(i)源自kre1蛋白的信号肽序列或源自swp1蛋白的信号肽序列；和(ii)α-交配因子(mfα)前导序列。更特别地，本发明涉及一种分泌信号，其包含(i)源自kre1蛋白的信号肽序列和(ii)α-交配因子(mfα)前导序列。更特别地，本发明涉及一种分泌信号，其包含(i)源自swp1蛋白的信号肽序列；和(ii)α-交配因子(mfα)前导序列。本发明还特别涉及一种包含源自kre1蛋白的信号肽序列的分泌信号。进一步特别地，本发明涉及一种包含源自swp1蛋白的信号肽序列的分泌信号。本发明还特别涉及一种由源自kre1蛋白的信号肽序列组成的分泌信号。进一步特别地，本发明涉及一种由源自swp1蛋白的信号肽序列组成的分泌信号。

54、在另一方面，本发明还涉及一种包含本发明核酸分子和与其可操作连接的启动子的表达盒。该表达盒可以包含在载体(优选表达载体)中，或整合在染色体(特别是人工染色体)中。

55、在另一方面，本发明还提供了一种包含本发明的核酸分子、本发明的载体或本发明的表达盒的重组真核宿主细胞。在本文中理解，用此类核酸分子或表达盒工程化的重组真核宿主细胞被遗传工程化以引入相应的核酸分子、载体或表达盒。可以将重组真核宿主细胞遗传工程化为在宿主细胞基因组内包含此类核酸分子、载体或表达盒。

56、重组真核宿主细胞可以是真菌或酵母宿主细胞，优选为酵母宿主细胞，所述酵母宿主细胞选自komagataella phaffii(巴斯德毕赤酵母)、多形汉森酵母、酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母、解脂耶氏酵母、甲醇毕赤酵母、博伊丁假丝酵母、komagataella spp.和粟酒裂殖酵母，或所述真菌宿主细胞选自里氏木霉或黑曲霉。

57、宿主细胞可被工程化以过表达信号识别颗粒(srp)的一种或多种组分。

58、本发明还涉及一种通过在表达本发明的核酸分子和在切割分泌信号后分泌目的蛋白的条件下培养本发明的宿主细胞，并自宿主细胞培养物中分离目的蛋白，并任选地纯化和任选地修饰和任选地配制所述目的蛋白来生产目的蛋白的方法。

59、在另一方面，本发明还涉及一种在真核宿主细胞中制备目的蛋白的方法，所述方法包括

60、(i)用本发明的核酸分子或用本发明的表达盒或载体遗传工程化所述真核宿主细胞，并任选地遗传工程化所述真核宿主细胞以过表达信号识别颗粒(srp)的一种或多种组分；

61、(ii)在表达所述核酸分子和任选地所述srp的一种或多种组分，和在切割分泌信号后分泌目的蛋白的条件下培养遗传工程化的宿主细胞，

62、(iii)任选地从细胞培养物中分离目的蛋白，

63、(iv)任选地纯化所述目的蛋白，

64、(v)任选地修饰所述目的蛋白，和

65、(vi)任选地配制所述目的蛋白。

66、在另一方面，本发明还涉及一种增加目的蛋白自真核宿主细胞中的分泌的方法，所述方法包括在所述真核宿主细胞中表达本发明的核酸分子，和任选地工程化所述真核宿主细胞以过表达信号识别颗粒(srp)的一种或多种组分，从而与表达本发明的核酸分子、但该核酸分子包含野生型酿酒酵母α-交配因子分泌信号(比如seq id no：4)而非本文所述的分泌信号，的宿主细胞相比增加所述目的蛋白的分泌。

67、所述增加目的蛋白自真核宿主细胞中的分泌的方法可另外包括

68、(i)工程化所述宿主细胞以引入表达本发明的核酸分子的表达构建体，和任选地遗传工程化所述宿主细胞以过表达信号识别颗粒(srp)的一种或多种组分，

69、(ii)在表达所述核酸分子和任选地过表达所述srp的一种或多种组分和在切割分泌信号后分泌目的蛋白的条件下培养所述宿主细胞，

70、(iii)任选地从细胞培养物中分离目的蛋白，

71、(iv)任选地纯化所述目的蛋白，

72、(v)任选地修饰所述目的蛋白，和

73、(vi)任选地配制所述目的蛋白。

74、可以将本发明的核酸分子整合到所述宿主细胞的染色体中，或者包含在未整合到所述宿主细胞的染色体中的表达盒、载体或质粒中。

75、在另一方面，本发明还涉及本文所述的分泌信号(如，作为本发明核酸分子的一部分或在本发明核酸分子内)用于增加目的蛋白自真核宿主细胞中的分泌的用途。与表达包含野生型酿酒酵母α-交配因子分泌信号(比如seq id no：4)而非本发明所定义的分泌信号的本文所述的融合蛋白的所述真核宿主细胞相比，所述分泌信号进一步增加所述目的蛋白自真核宿主细胞中的分泌。

76、在另一方面，本发明涉及本发明的重组宿主细胞用于制备目的蛋白的用途。