‘豆绿’牡丹的内参基因及其引物和应用

本发明属于生物，涉及园林、园艺、分子育种领域，具体涉及‘豆绿’牡丹的内参基因及其引物和应用。

背景技术：

1、实时荧光定量pcr(quantitative real-time pcr,qrt-pcr)技术是分子生物学中检测相关基因表达情况的最普遍的技术方法之一。qrt-pcr技术操作简便、特异性好、灵敏度高、高效快捷，目前已经成为基因功能研究必需的基础检测手段。

2、在利用qrt-pcr技术进行基因表达情况分析时，为了消除不同rna样品之间可能对实验结果造成的误差，需要利用适合的内参基因对实验结果进行校正。理想的内参基因应该表达水平较高，在不同的组织、不同的生长发育阶段、不同的处理条件下均能稳定表达。筛选合适的内参基因是获得可靠qrt-pcr分析结果的前提。

3、牡丹(paeonia suffruticosa)起源于我国，是名贵的观赏和药用植物，属于芍药科(paeoniaceae)芍药属(paeonia)牡丹组(sect.moutan dc)，以硕大的花朵以及丰富多彩的颜色著称，有“花中之王”的美誉。牡丹栽培品种在培育过程中经历反复杂交，遗传背景不清。lv等对牡丹品种‘洛神晓春’进行了基因组测序，获得了13.79gb的基因组序列。‘洛神晓春’的转录组数据和基因组数据匹配率只有73.2％。其余4个公开报道的牡丹转录组数据和‘洛神晓春’基因组的匹配率更低，仅有0.04％-68.41％，说明不同牡丹品种之间存在高度的遗传多样性(lv et al.，2020)，导致牡丹内参基因缺乏通用性。不同的牡丹品种适用的内参基因差异明显，甚至同一牡丹品种、不同组织、不同处理条件适用的内参基因都各不相同。β-actin和b-tubulin在‘鲁菏红’花芽休眠解除过程中最稳定(张玉喜等，2011)；cyc和ef2α是滇牡丹种子中最稳定的内参基因组合(潘沫晗等，2020)。ubiquitin和gapdh是‘洛阳红’不同实验条件下最稳定的内参基因组合(王彦杰等，2012)。li jian等在3个牡丹品种6个发育时期的花瓣中检测了10个候选内参基因的稳定性，研究结果表明gapdh和ubc在‘凤丹’和‘西施’中最稳定，ef-1α和ubc在‘雀好’中最稳定(li et al.，2016)。刘洪峰等研究了‘凤丹’、‘西施’、‘雀好’3个品种共33份样本，对16个候选内参基因进行了筛选分析。在‘凤丹’、‘西施’、‘雀好’3个品种不同发育阶段的花瓣中，ervtp和pp2cfp最稳定；在‘凤丹’不同花色梯度的花瓣中，rps9和arfa1c最稳定；在‘凤丹’不同组织中，ampds和puf1639最稳定；在‘凤丹’不同发育时期的种子中，rps9和puf1639最稳定(刘洪峰等，2015)。以上结果说明内参基因在不同牡丹品种中的稳定性差异极大，牡丹内参基因在不同品种、不同组织、不同处理条件下不能通用。在进行牡丹的基因表达分析时，需要对适合的内参基因组合进行筛选。

4、全世界牡丹品种超过2000种，中国就拥有1000多种。鲜艳的花色是牡丹的观赏焦点。牡丹野生品种花色较为单一，经过漫长的自然选择以及人工选择，花色逐渐丰富，目前已发展出红、粉、黄、紫、绿、白、黑、蓝、复色九大色系，各色系又派生出不同的过渡色、近似色。绿色花朵是由于花瓣组织中合成了叶绿素。很多植物的花朵在发育早期含有叶绿素，花朵开放后，花瓣组织中的叶绿素含量急剧降低。在自然界，绿色花朵不显眼，无法吸引传粉者，不利于植物繁殖后代，一般无法顺利繁衍。在观赏园艺植物中，绿色花作为一种珍贵罕有的性状，被选育及发展，并形成了稳定的品种。目前，牡丹、芍药、菊花、月季、兰花、百合等少数花卉种类已培育出绿色花品种，但关于绿色花的着色机理研究还不够深入。

5、目前，牡丹中已培育出十多种绿花品种，但都不能长久持绿，花朵均随开花进程逐渐褪绿，开花中后期变为绿白相间(‘翡翠’)、白色(‘翠幕’、‘绿幕’、‘绿幕隐玉’、‘青香球’)或粉色(‘豆绿’、‘翡翠球’、‘荷花绿’、‘绿香球’、‘绽绿’)，严重影响了其观赏品质，也不符合广大赏花群众对“绿牡丹”的期望。对绿花牡丹的研究主要集中在遗传分类、常规育种和栽培技术上，对其着色机制的研究还未见报道。

6、‘豆绿’是中国最大的牡丹种群——中原牡丹中的绿色珍品，也是牡丹四大名品之一，历史悠久，享誉海外。‘豆绿’在花器官发育的早期，呈鲜翠的绿色。随着花器官发育成熟，花瓣松散，盛开时颜色变为白中带粉。开放过程绿色褪去，严重影响了‘豆绿’的观赏品质。‘豆绿’花朵为皇冠型或绣球型，雄蕊、雌蕊完全瓣化，瓣化雄蕊是其花器官的主体部分，也是研究牡丹花型形成机理的良好材料。

7、‘豆绿’是绿花牡丹中最著名，最典型的品种，对其着色机理的研究对其他绿花牡丹品种非常具有参考价值，也是研究牡丹花型形成机理的良好材料，但现有已报道的所有其他牡丹品种内参基因均不适用于‘豆绿’，无法准确可靠地检测‘豆绿’相关基因的表达情况，成为制约其理论研究和分子育种的瓶颈。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明的目的在于提供一种检测‘豆绿’牡丹不同花器官组织或不同发育时期瓣化雄蕊中基因表达的定量pcr体系，构建的体系稳定可靠，能批量、快速、简便地检测绿色牡丹‘豆绿’相关基因的相对表达情况，为后续的基因功能研究及绿色牡丹新品种培育提供重要依据。

2、为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：

3、定量pcr检测‘豆绿’牡丹不同花器官组织中基因表达的内参基因，所述内参基因为ubc和mbf1a；所述ubc基因的核苷酸序列如seq id no：27所示；所述mbf1a基因的核苷酸序列如seq id no：24所示。

4、优选地，所述‘豆绿’牡丹不同花器官组织包括萼片、花瓣、瓣化雄蕊和瓣化雌蕊。

5、用于扩增上述内参基因的特异性引物，扩增内参基因ubc的引物如seq id no:17和seq id no:18所示；扩增内参基因mbf1a的引物如seq id no:11和seq id no:12所示。

6、一种‘豆绿’牡丹不同花器官组织定量pcr检测体系，使用ubc和mbf1a作为内参基因，扩增内参基因ubc的引物如seq id no:17和seq id no:18所示；扩增内参基因mbf1a的引物如seq id no:11和seq id no:12所示。

7、上述内参基因、特异性引物或定量pcr检测体系在‘豆绿’牡丹不同花器官组织基因表达检测中的应用。

8、定量pcr检测‘豆绿’牡丹不同发育时期瓣化雄蕊中基因表达的内参基因，所述内参基因为gapdh和act；所述gapdh基因的核苷酸序列如seq id no：25所示；所述act基因的核苷酸序列如seq id no：19所示。

9、进一步地，所述‘豆绿’牡丹瓣化雄蕊的不同发育时期包括露色期(i)、绽口期(ii)、初开期(iii)、半开期(iv)、盛开期(v)和始衰期(vi)。

10、用于扩增上述内参基因的特异性引物，扩增内参基因gapdh的引物如seq id no:13和seq id no:14所示；扩增内参基因act的引物如seq id no:01和seq id no:02所示。

11、一种‘豆绿’牡丹不同发育时期瓣化雄蕊定量pcr检测体系，使用gapdh和act作为内参基因，扩增内参基因gapdh的引物如seq id no:13和seq id no:14所示；扩增内参基因act的引物如seq id no:01和seq id no:02所示。

12、上述内参基因、特异性引物或定量pcr检测体系在‘豆绿’牡丹不同发育时期瓣化雄蕊中基因表达检测中的应用。

13、有益效果：本发明只需普通常规的分子生物学仪器和试剂就能批量、快速、简便、可靠地检测绿色牡丹‘豆绿’相关基因的相对表达情况，体系简便可靠，操作性强，适合进行大批量筛选，可以为后续的园艺、化学方法调控牡丹花型提供靶位点，还可以利用洛阳丰富的牡丹资源库，批量筛选花型相关的突变基因，构建牡丹花型突变基因库；本发明为延长‘豆绿’花朵着色时间，提高其观赏品质提供依据，并为其他品种绿花牡丹的持绿研究提供参考，还可以为后续培育牡丹绿色花新品种提供支持；为后续的理论研究、牡丹品种分子育种提供基因资源和依据。