一种烟草气孔开度调控因子及其应用的制作方法

本发明属于遗传工程，具体涉及一种气孔开度调控因子ntmyb184及其表达载体、转化体、试剂盒与方法。

背景技术：

1、气孔(stomata)是植物表皮中由一对保卫细胞形成的孔，是植物蒸腾作用排出水分、光合作用吸收co2的通道，也是植物免疫中限制病原入侵的物理屏障。保卫细胞中活性氧(ros)水平是气孔运动的关键调节靶点，多种外源刺激和植物激素通过调节ros水平调控气孔运动。ros作为关键的次级信号分子提高胞内ca2+水平，激活保卫细胞质膜阴离子通道释放阴离子，关闭气孔。

2、研究表明黄酮醇均具有抗氧化剂功能，能够调节保卫细胞中ros水平进而影响气孔运动。植物黄酮醇合成受到myb类转录因子调控，目前已在拟南芥、葡萄、柑橘、淫羊霍、海棠中克隆获得，但模式植物烟草中尚无相关研究发表，也未出现myb通过调控黄酮醇合成影响保卫细胞ros水平进而调节气孔开度的报告。本领域亟需开发一种通过转录因子调控烟草气孔开度的产品和方法。

技术实现思路

1、本发明正是为了解决上述问题缺陷，提供一种气孔开度调控因子ntmyb184及其表达载体、转化体、试剂盒与方法。

2、本发明采用如下技术方案实现。

3、一种气孔开度调控因子ntmyb184，其氨基酸序列中包含：r2重复序列、r3重复序列、sg7结构域[k/r][r/x][r/k]xgrt[s/x][r/g]xx[m/x]k。

4、所述的气孔开度调控因子ntmyb184的氨基酸序列从氨基端到羧基端依次包括r2重复序列、r3重复序列、sg7结构域[k/r][r/x][r/k]xgrt[s/x][r/g]xx[m/x]k；

5、优选地，所述气孔开度调控因子ntmyb184的氨基酸序列第12-62位氨基酸为r2重复序列；

6、优选地，所述气孔开度调控因子ntmyb184的氨基酸序列第64-115位氨基酸为r3重复序列；

7、优选地，所述气孔开度调控因子ntmyb184的氨基酸序列第144-156位氨基酸为sg7结构域[k/r][r/x][r/k]xgrt[s/x][r/g]xx[m/x]k；

8、所述的气孔开度调控因子ntmyb184的氨基酸序列如seq id no：1所示。

9、所述的气孔开度调控因子ntmyb184的基因序列如seq id no：2所示；

10、优选地，所述气孔开度调控因子ntmyb184为烟草(nicotiana tabacum l.)气孔开度调控因子ntmyb184。

11、一种可调控气孔开度的表达载体，连接有所述的气孔开度调控因子ntmyb184的基因序列。

12、优选地，所述可调控气孔开度的表达载体指，在表达载体上连接了所述气孔开度调控因子ntmyb184的基因序列；

13、优选地，所述表达载体选自：pk2gw7载体；

14、优选地，所述调控为正调控；

15、优选地，所述野生型烟草气孔开度为0.3992，过表达植株(oe)气孔开度为0.4673，oe植株与野生型相比气孔开度增加17％左右。

16、一种可调控气孔开度的转化体，转化有所述的一种可调控气孔开度的表达载体。

17、优选地，所述可调控气孔开度的转化体指，宿主细胞中转化有所述可调控气孔开度的表达载体；

18、优选地，所述宿主细胞选自：植物细胞或微生物细胞；

19、优选地，所述植物为烟草；

20、优选地，所述微生物选自：大肠杆菌、农杆菌。

21、一种可调控气孔开度的试剂盒，包括：所述的气孔开度调控因子ntmyb184、和/或，所述的一种可调控气孔开度的表达载体、和/或，所述的一种可调控气孔开度的转化体。

22、所述的一种可调控气孔开度的试剂盒还包括：气孔开度调控因子ntmyb184的基因序列的扩增引物、pcr常用试剂、连接转化常用试剂、转基因常用试剂；

23、优选地，所述气孔开度调控因子ntmyb184的基因序列的扩增引物包括：

24、正向引物ntmyb184-xmni:5’-gaaccaattcatgggaagagcaccttgttg-3’，

25、反向引物ntmyb184-xhoi：5’-ctcgagctaagacaaaagccaagcgac-3’；

26、优选地，所述pcr常用试剂包括：dna聚合酶、dntp、pcr缓冲液、双蒸水；

27、所述dna聚合酶优选high-fidelity dna polymerase，所述pcr缓冲液优选5×phusion hf反应缓冲液；

28、优选地，所述连接转化常用试剂包括：限制性内切酶、连接缓冲液、表达载体、蛋白酶、感受态细胞、培养基；

29、优选地，所述限制性内切酶优选xmni、xho i；所述限制性内切酶优选cloneasetmⅱenzyme mix；所述连接缓冲液优选te buffer；所述蛋白酶优选proteinase k；

30、优选地，所述表达载体选自：pk2gw7载体；

31、优选地，所述感受态细胞选自：大肠杆菌感受态细胞、农杆菌感受态细胞；

32、优选地，所述培养基选自lb培养基。

33、一种可调控气孔开度的方法，在植物体内过表达所述的气孔开度调控因子ntmyb184、和/或，在植物体内转化所述的一种可调控气孔开度的表达载体、和/或，用所述的一种可调控气孔开度的转化体侵染植物。

34、所述的一种可调控气孔开度的方法包括：pcr扩增所述气孔开度调控因子ntmyb184的基因序列得到pcr扩增产物；

35、优选地，所述pcr扩增体系包括：4ng/μl植物的cdna，5×phusion hf反应缓冲液0.2μl/μl，0.2mm dntp，0.04u/μl的high-fidelity dna polymerase，0.2μm的正反向引物，其余为水；

36、优选地，所述正反向引物包括：

37、正向引物ntmyb184-xmni:5’-gaaccaattcatgggaagagcaccttgttg-3’，

38、反向引物ntmyb184-xhoi：5’-ctcgagctaagacaaaagccaagcgac-3’。

39、优选地，所述pcr扩增程序包括：98℃，30秒；以98℃，7秒；62℃，30秒；72℃，45秒为1个循环，共35个循环；72℃延伸7分钟；

40、优选地，所述方法还包括：将所述pcr扩增产物与表达载体连接得到所述可调控气孔开度的表达载体；

41、优选地，所述连接指将连接有气孔开度调控因子ntmyb184的基因序列的表达载体pentrtmntmyb184通过lr反应进一步连接得到可调控气孔开度的表达载体pk2gw7-ntmyb184；

42、优选地，所述lr反应的体系包括：6.25ng/μl-18.75ng/μl的pentrtmntmyb184，0.0625μl/μl的连接载体，其余为te buffer；

43、优选地，所述lr反应的步骤包括：连接反应体系混匀，冰浴2min，混匀；加入0.2μl/μl lr cloneasetmⅱenzyme mix，混匀，离心，25℃水浴1h；然后加入0.9μl/μl proteinasek，混匀，37℃水浴10min；所述混匀方式优选轻弹；

44、优选地，所述方法还包括：将可调控气孔开度的表达载体pk2gw7-ntmyb184转化至感受态细胞得到可调控气孔开度的转化体；

45、优选地，所述方法还包括：将可调控气孔开度的转化体侵染植物细胞；

46、优选地，所述感受态细胞为农杆菌感受态细胞；所述可调控气孔开度的转化体指含有可调控气孔开度的表达载体pk2gw7-ntmyb184的农杆菌克隆；

47、优选地，所述植物优选烟草；

48、优选地，所述调控为正调控；

49、优选地，所述野生型烟草气孔开度为0.3992，过表达植株(oe)气孔开度为0.4673，oe植株与野生型相比气孔开度增加17％左右。

50、本发明的有益效果为，1)本发明找到了一种调控因子，调控因子可应用于调控烟草气孔开度。2)对比野生型烟草气孔开度和oe植株的气孔开度，oe植株与野生型相比气孔开度增加17％左右。

51、下面结合附图和具体实施方式本发明做进一步解释。