一种血细胞病原微生物去宿主核酸提取试剂盒和方法与流程

本发明涉及生物，特别涉及微生物分子生物学分子检测领域，具体涉及一种血细胞病原微生物去宿主核酸提取试剂盒和方法。

背景技术：

1、血流感染(blood stream infection，bsi)是各种病原微生物(包括细菌、真菌等)入侵血液所引起的感染，包括菌血症与败血症。其中菌血症是指细菌短暂入血，而临床表现上无明显的毒血症症状；败血症则是由于病原微生物及毒素共同入血所引起的全身炎症反应综合征。尽管医学科学取得了极大进展，但是血流感染仍是全球公共卫生领域越来越严重的问题。脓毒症或脓毒症休克患者中，有40％是由血流感染引起的。icu感染患者中，有20％是血流感染。当这类患者的感染源控制延迟、抗生素给药不及时的时候，治疗效果通常很差。

2、现阶段，血培养是血流感染诊断的金标准，但血培养依赖临床预判、培养周期长且检测阳性率较低。宏基因组二代测序(mngs)技术凭借周期短、灵敏度高、检测范围全面等优势受到感染领域的极大关注，在血流感染的检测方面也已得到广泛的应用。目前，业类都是采集患者血浆中的游离核酸(cfdna)进行血流感染的mngs检测，提高了感染的阳性检出率。但是，病原既以cf-dna的形式存在于血浆之中，也以颗粒的形式混迹于血细胞之中，仅检测血浆会造成漏检。所以，有必要检测血细胞中的病原靶标。

3、大多数的临床样本，比如肺泡灌洗液、痰液、血细胞等，含有大量人源细胞，且人细胞基因组为病原体微生物的10-10000倍，导致宏基组测序得到的测序数据90％以上的测序序列为人源序列，从而大大影响宏基因组病原微生物检出灵敏度。在高人源dna的背景下，检出低丰度病原菌序列非常困难，更不必说检出一些难破壁的病原微生物，比如革兰氏阳性菌、隐球菌、结核分枝杆菌等。

4、目前，有一些针对肺泡灌洗液、痰液和呼吸道样本的去除宿主的专利报道，但是没有针对血细胞去宿主的研究报道。已公开的消除宿主dna的方法主要有以下几种，但都存在一些不足：1)采用表面活性剂和dnase联合的温柔型消化法，将宿主基因组释放于溶液中，获得保留完整细胞壁结构的微生物，实现去宿主化微生物核酸提取。此种办法pbs清洗dnase时间较长，操作复杂，且难免残留dnase和损失病原微生物；2)有报道为了增加去除人源的效率，表面活性剂用了好几种，而且其浓度很高。结果，造成革兰氏阴性菌、病毒、支原体和衣原体等一些细胞较脆弱的病原微生物的丢失；3)针对前面一种方法需要离心的情况，有报道称改变了清除dnase残留的方法，利用edta终止作用来代替pbs的清洗，终止后全部用于后续提取，但是残留的edta会对后续的提取用的酶造成很大的影响，而且此种方法去除效率低；4)基于渗透裂解及叠氮碘化丙锭处理的化学方法去除宿主污染，此方法同样需要较长时间，而且需要特定的光源，目前并未被广泛应用；5)针对人基因组上广泛存在的重复序列，提前设计好捕获探针，然后用于人源基因组的去除。此种方法效率很低，而且捕获探针需要提前制备，工艺复杂。

5、因此急需提供一种针对血细胞的，各种微生物提取兼容性好的，简单、高效提取难破壁微生物的去宿主化提取试剂盒和方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现在的迫切需求，提供一种血细胞病原微生物去宿主核酸提取试剂盒和方法。

2、为实现上述目的，本发明的一个方面是提供一种血细胞病原微生物去宿主核酸提取试剂盒，所述试剂盒包括细胞裂解液、dna酶、dna酶缓冲液、蛋白酶k、溶菌酶、溶壁酶、玻璃珠和提取裂解液；

3、所述细胞裂解液为皂苷和β辛基硫代葡萄糖苷混合溶液；

4、所述dna酶为ultra nuclease；

5、所述dna酶缓冲液包括mgcl2、tris-hcl、bsa；

6、所述提取裂解液包括tris-hcl、氯化钠、盐酸胍和sds。

7、进一步的，细胞裂解液中皂苷的质量百分比浓度为1.6％，β辛基硫代葡萄糖苷的质量百分比浓度为0.4％。

8、进一步的，dna酶缓冲液的ph值为6-9，提取裂解液的ph值为6-7。

9、目前发表的皂苷去除宿主细胞的方法，其中皂苷的工作浓度都很高，达到2.5％及以上，这样高的工作浓度下对微生物细胞的破坏作用很大，尤其是对革兰氏阴性菌、衣原体、支原体和病毒的破坏作用很大。因为这几种病原体的细胞结构较脆弱，容易在宿主细胞裂解的同时被破坏掉，从而影响了检出。本发明创造性地在宿主裂解的过程中使用了低浓度的皂苷和低浓度的β辛基硫代葡萄糖苷，并经过大量优化测试工作，调整了两者的比例，既保证了宿主细胞的去除，又不至于浓度太高破坏结构脆弱的病原体。

10、本发明的另一个方面是提供一种血细胞病原微生物去宿主核酸提取方法，所述方法包括如下步骤：

11、s1.宿主裂解：在样本管中加入细胞裂解液，室温颠倒混匀，离心后去除上清液；

12、s2.宿主核酸去除：往样本管中加入dna酶缓冲液和dna酶，混匀孵育；加入蛋白酶k，充分混匀后孵育，反应结束后离心弃掉上清，无需pbs清洗；

13、s3.微生物菌体破壁：加入溶菌酶和溶壁酶重悬沉淀后将重悬液转移到装有玻璃珠的离心管中，孵育，涡旋混匀处理；

14、s4.微生物核酸提取：离心管离心后加入提取裂解液和蛋白酶k，涡旋混匀后孵育；高速离心后，转移全部上清至一新的离心管中，加入无水乙醇，上下颠倒混匀后，溶液全部转移至已装入收集管的吸附柱中，离心，除去收集管中的液体，将吸附柱重新放回至该收集管中，向吸附柱中加入清洗液buffer ws1，离心，除去收集管中的液体，将吸附柱重新放回至该收集管中，向吸附柱中加入清洗液buffer ws2，离心，除去收集管中的液体，将吸附柱重新放回至该收集管中，离心，除去收集管中的液体，将吸附柱置于室温条件下彻底晾干后放入新的离心管中，向吸附柱中加入无核酸酶水，室温放置，离心，收集dna溶液于-20℃条件下保存。

15、进一步的，所述样本类型为血细胞。

16、进一步的，所述细胞裂解液为皂苷和β辛基硫代葡萄糖苷溶液；所述dna酶为ultranuclease；所述dna酶缓冲液包括mgcl2、tris-hcl、bsa；所述提取裂解液包括tris-hcl、氯化钠、盐酸胍和sds。

17、进一步的，所述皂苷的终浓度为0.8％，β辛基硫代葡萄糖苷的终浓度为0.2％。

18、进一步的，所述ultra nuclease的终浓度为2-5u/μl，dna酶缓冲液中各成分的终浓度分别为mgcl2 1-10mm，tris-hcl 10-50mm，bsa0.1-0.5mg/ml。

19、进一步的，所述溶菌酶的终浓度为5-20mg/ml，溶壁酶的终浓度为0.1-0.5u/μl。

20、进一步的，所述提取裂解液中各成分的终浓度分别为tris-hcl 40-100mm、氯化钠100-500mm、盐酸胍2-4m和sds 0.5％-2％质量百分比。

21、本发明去宿主过程中，使用了ultra nuclease，其是一种全能核酸酶，不仅可以降解dna，还可以降解rna，在应用这一方法进行rna病原体检测的时候也能提升rna病原体的检出率。

22、革兰氏阳性菌的细胞壁含有较高比例的肽聚糖，真菌细胞壁含有较高比例的几丁质，溶菌酶、溶壁酶可以特异性的作用于肽聚糖、几丁质，本发明微生物菌体破壁中，联合应用溶菌酶和溶壁酶，对病原体细胞裂解更充分。

23、更进一步地，本发明联合使用化学法(溶菌酶和溶壁酶)和物理法(玻璃珠机械研磨)对微生物细胞进行破壁，双重破壁效果更充分，病原体检出率更高。

24、本发明的技术效果和优点：

25、1、本发明特异针对血细胞样本类型而研发，弥补了目前只检测血浆样本cfdna造成病原微生物漏检的空白；

26、2、本发明创造性地在宿主裂解的过程中使用了低浓度的皂苷和低浓度的β辛基硫代葡萄糖苷，并经过大量优化测试工作，调整了两者的比例，既保证了宿主细胞的去除，又不至于浓度太高破坏结构脆弱的病原体。

27、3、本发明去宿主过程中，使用了ultra nuclease，其是一种全能核酸酶，不仅可以降解dna，还可以降解rna，在应用这一方法进行rna病原体检测的时候也能提升rna病原体的检出率。

28、4、本发明联合使用化学法(溶菌酶和溶壁酶)和物理法(玻璃珠机械研磨)对微生物细胞进行破壁，双重破壁效果更充分，病原体检出率更高。