靶向BCMA嵌合抗原受体及其应用的制作方法

本发明涉及肿瘤的细胞免疫治疗领域，具体涉及靶向bcma嵌合抗原受体。

背景技术：

1、多发性骨髓瘤(multiple myeloma，mm)是一种终末分化的浆细胞异常增殖的恶性肿瘤，是第二大最常见的血液系统恶性肿瘤。近年来，随着新的治疗药物如蛋白酶体抑制剂和免疫调节剂的发展，患者的预后有了明显改善。但是mm仍然是一种不治之症，几乎所有患者最终都会面临复发和耐药的风险。因此，新的治疗方案对这些患者至关重要。以嵌合抗原受体t(chimeric antigen receptor modified t cell，car-t)细胞为代表的免疫疗法在血液系统肿瘤中显示出良好的疗效，有望成为mm的新型有效治疗方法。

2、与传统t细胞活化途径不同，car-t细胞的活化不依赖于mhc的呈递。car-t细胞可通过胞外的单链可变区(single-chain variable fragment，scfv)识别并结合肿瘤靶细胞表面抗原。在最初的设计中，胞外的抗原结合域与胞内的信号传导结构域通过跨膜结构域相连(第一代car)，在识别并结合抗原后可直接诱导t细胞的活化。抗原结合域与细胞表面的配体结合提供第一信号，一旦与配体结合，胞内共刺激分子随即被激活提供第二信号，第一信号与第二信号传输到胞内的激活域中将car-t激活，发挥抗肿瘤活性。研究发现第一代car结构几乎没有肿瘤清除作用，并且无增殖活性，因此研究者们构建了包含cd28或4-1bb等共刺激域的第二代car，第二代car具有更强的抗肿瘤活性。整合一个以上胞内共刺激域(如cd28、ox40、4-1bb、cd27等)的car成为第三代car。第四代car是能够分泌细胞因子如il-12和表达细胞表面标记如共刺激配体的car。目前，二代car结构显示出更好的安全性和临床有效性，因此临床应用更为广泛。

3、典型的car-t细胞制造需要从患者体内抽取外周血，分离出外周血单个核细胞(pbmc)，再进行t细胞的刺激和活化，之后通过基因工程的方法，使其细胞表面表达将能够特异性识别肿瘤靶抗原的car，制备成功的car-t细胞通过大量扩增后回输至患者体内，发挥抗肿瘤功能。car-t细胞的生产一般需要10-14天。自2017年以来，先后已有5款car-t产品获得fda批准上市，用于治疗血液系统恶性肿瘤，其中靶向bcma的abecma在今年获批上市，是首款用于治疗mm的car-t细胞产品。

4、识别肿瘤特异性抗原是car-t细胞治疗成功的关键。首先，抗原必须在肿瘤细胞表面表达。其次，抗原必须在肿瘤细胞上均匀表达，理想情况下应该是肿瘤存活所必需的。最重要的是，靶抗原不能在相关的健康组织表达，以避免发生潜在的靶上肿瘤外毒性。

5、bcma，也称为cd269或tnfrsf17，是一种由成熟的b淋巴细胞、浆细胞和大多数多发性骨髓瘤患者表达的大小为27kda的iii型跨膜糖蛋白。bcma可与多种配体结合，包括baff(b细胞激活因子)和april(a增殖诱导配体)，通过下游的nf-κb和mapk/jnk信号通路介导细胞存活bcma是肿瘤坏死因子的一员，在支持浆细胞分化和存活方面起着至关重要的作用。它在正常浆细胞和mm细胞上选择性表达，在其他组织的细胞中没有检测到bcma的表达。bcma与跨膜激活剂、钙离子调节剂和亲环素配体相互作用因子(taci)一起，也是增殖诱导配体(april)的受体。在多发性骨髓瘤中，april/bcma通路在支持生长、耐药和免疫受损的环境中起着关键作用。由于其在浆细胞上的独特表达和在多发性骨髓瘤中的重要作用，bcma已成为治疗多发性骨髓瘤的理想靶点。

6、虽然已经报道了以mm为靶点的bcma car-t细胞，但仍需要对新型car-t细胞进行临床实验，以推进mm的治疗。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供一种靶向bcma嵌合抗原受体，该受体包括人源靶向bcma的scfv结构，scfv的重链可变区scfv-vh与轻链可变区scfv-vl之间通过一个或多个g4s序列连接；重链可变区scfv-vh的氨基酸序列与以下seq id no.8具有至少90％同源性，优选地具有至少95％同源性，更有优选地具有至少98％同源性：sqvtlresgpglvrpsqtlsltctvsggsidsgghywswirqhpgkglewigs iyhsgntyynpslksrvtmsvdtsknqfslkltsvtaadtaiyycardiphyf epaywgqgtlvtvss；

2、轻链可变区scfv-vl的氨基酸序列与以下seq id no.9具有至少90％同源性，优选地具有至少95％同源性，更有优选地具有至少98％同源性：qsaltqpasasgspgqsvtisctgtssdvggynyvswyqqhpgkapklmiye vsnrpsgvsnrfsgsksgntasltisglqaedeadyycaiwhssawvfgggt kltvlg。

3、在一种实施方式中，该受体包括人源靶向bcma的scfv结构为scfv-vh-(g4s)n-scfv-vl，其中n为大于等于1的整数，优选地为3或4。

4、在一种实施方式中，该受体包括人源靶向bcma的scfv结构为scfv-vh-(g4s)3-scfv-vl，重链可变区scfv-vh的氨基酸序列为seq id no.8；轻链可变区scfv-vl的氨基酸序列为seq id no.9。

5、在一种实施方式中，该受体包括人源靶向bcma的scfv结构为scfv-vh-(g4s)n-scfv-vl-(g4s)n-scfv-vl-(g4s)n-scfv-vh，其中n为大于等于1的整数，优选地为3或4。

6、在一种实施方式中，该受体包括人源靶向bcma的scfv结构为scfv-vh-(g4s)3-scfv-vl-(g4s)4-scfv-vl-(g4s)3-scfv-vh，重链可变区scfv-vh的氨基酸序列为seq idno.8；轻链可变区scfv-vl的氨基酸序列为seq id no.9。

7、在一种实施方式中，该受体包括依次串联的上游的信号肽和用于检测的myc标签；包含重链可变区与轻链可变区的人源靶向bcma的scfv结构；cd8铰链-跨膜结构域；cd28或4-1bb协同激活结构域和cd3ζ胞内信号传导结构域。

8、在一种实施方式中，本发明提供.一种靶向靶向bcma的嵌合抗原受体t细胞，其表达有上述的嵌合抗原受体。

9、在一种实施方式中，本发明提供一种治疗肿瘤的药物，其含有上述的嵌合抗原受体t细胞。

10、在一种实施方式中，本发明提供上述的嵌合抗原受体在制备嵌合抗原受体t细胞及其在肿瘤治疗中的应用。

11、在一种实施方式中，所述肿瘤是表面bcma阳性的肿瘤。

12、在一种实施方式中，所述肿瘤是多发性骨髓瘤。

13、在一种实施方式中，本发明提供上述嵌合抗原受体的应用，将编码所述嵌合抗原受体的基因片段插入病毒表达载体，包装成病毒载体颗粒，感染人t细胞，制备得到嵌合抗原受体t细胞，用于表面bcma阳性的肿瘤治疗。

14、在本发明中，我们成功构建的pmfg-bcma car15、pmfg-bcma car16、pmfg-bcmacar17、pmfg-bcma car18、pmfg-bcma car19和pmfg-bcma car20质粒瞬时转染phoenix-eco细胞，转染效率均高于50％，利用瞬时转染的逆转录病毒载体颗粒转导pg13细胞系，转导效率均高于95％，ppcr检测显示逆转录病毒载体颗粒具有较高病毒滴度，最高滴度均高于1×107拷贝/ml，表明成功制备稳定表达生产bcma car逆转录病毒载体的pg13细胞系。用制备成功的双嗜性逆转录病毒载体bcma car15、bcma car16、bcma car17、bcma car18、bcmacar19和bcma car20转导人原代t细胞并检测car的表达，表明我们已成功制备bcma car-t细胞。

15、在体外肿瘤杀伤实验中，本发明利用流式细胞术检测靶细胞的凋亡，萤光素酶生物发光法检测靶细胞的存活，其中bcma car16-t表现出相对更好的抗肿瘤能力。但是由于杀伤效果不如阳性对照组，表明我们筛选出的bcma car16可进一步优化，以提高对靶抗原的结合能力。

16、由于bcma是三聚体结构，且蛋白分子量较小，为32.3kda，我们将bcma car16进行scfv结构的串联，设计出bcma car31、bcma car32和bcma car33，以增加胞外抗原结合域scfv区的灵活性，更好的捕捉抗原，提高对肿瘤的杀伤能力。

17、将bcma car31、bcma car32和bcma car33制备双嗜性逆转录病毒载体，并转导人原代t细胞，转导效率均超过50％，并且qpcr检测显示成功整合入t细胞基因组。

18、在体外杀伤肿瘤实验中，incucyte实时动态活细胞成像筛选出杀伤效果最好的bcma car31-t细胞，与bcma car16-t细胞做进一步对比。cd69是t细胞活化的标志，我们发现在无肿瘤细胞刺激时bcma car31-t与bcma car16-t细胞均无明显的自激活现象，肿瘤细胞刺激下bcma car-t细胞能够被有效活化，可以发挥抗肿瘤作用。

19、为了确定bcma car31-t细胞在体外的抗肿瘤能力，我们选择表达人bcma阳性肿瘤细胞rpmi-gfp-luc。萤光素酶生物发光法检测靶细胞的存活结果显示，与bcma car16-t组相比，不同的效靶比下，bcma car31-t细胞对两种不同的bcma阳性的肿瘤细胞均有更强的杀伤力，表明结构优化后的bcma car31-t对肿瘤细胞的杀伤能力有所提升。

20、为了验证bcma car31-t细胞抗肿瘤作用的抗原特异性，将bcma car31-t细胞与不同种类的肿瘤细胞系k562-hbcma-gfp、pmi-gfp-luc、k562-cbcma和k562共孵育，结果显示与bcma car16-t组相比，不同的效靶比下，bcma car31-t细胞对两种不同的bcma阳性的肿瘤细胞均有更强的杀伤力。但对非人bcma表达的k562-cbcma以及bcma阴性的k562细胞，bcma car31-t呈现出与pan-t无差别的杀伤能力，此结果表明，bcma car31-t细胞对肿瘤细胞的杀伤具有bcma抗原特异性。

21、当car-t细胞与肿瘤抗原结合后，car-t细胞会募集其他免疫细胞，释放出大量的细胞因子，产生抗肿瘤免疫反应。在细胞因子分泌实验中，与bcma car16-t相比，bcmacar31-t细胞在肿瘤细胞的刺激下分泌更多的促炎性细胞因子tnf-α、ifn-γ、il-6、il-17a和afasl，从而促进肿瘤细胞的凋亡。

22、产生强大而持久的抗肿瘤免疫反应，不仅需要引发细胞毒性和细胞因子的产生，还需要刺激car-t细胞的增殖。我们通过cfse法检测发现与bcma car16-t相比，bcmacar31-t细胞的增殖速度更快。

23、此外，本发明建立了npg小鼠异种移植肿瘤模型来确bcma car31-t细胞在体内的抗肿瘤能力。在第二次尾静脉注射bcma car31-t两天后，ifn-γ细胞因子的分泌比bcmacar16-t明显增强，表明bcma car31-t细胞更好的被激活；小鼠一般状况良好，未出现发烧、恶心、呕吐等细胞因子释放综合征所表现出的症状。在连续观察小鼠肿瘤变化期间，bcmacar31-t组肿瘤信号比bcma car16-t显著减弱，显示出了更有效的抗肿瘤能力；流式细胞术连续检测小鼠外周血中t细胞含量，结果显示直至肿瘤接种后第37天，bcma car31-t细胞比bcma car16-t细胞含量更高，表明bcma car31-t细胞在小鼠体内持续存活时间更长，具有更持久的抗肿瘤能力。

24、因此，在本发明中通过逆转录病毒载体转导成功构建了新型的第二代靶向bcma的car-t细胞。体外实验表明，bcma阳性肿瘤细胞刺激后可有效激活bcma car31-t细胞，分泌ifn-γ、tnf-α等细胞因子，促进肿瘤细胞凋亡。bcma car31-t细胞能够有效并特异的杀伤bcma阳性肿瘤细胞。bcma car31-t细胞在体外具有良好的增殖能力。进一步的体内抗肿瘤实验表明，bcma car31-t细胞可被快速激活分泌ifn-γ，具有一定肿瘤作用。因此，新型的靶向bcma第二代car-t细胞具有高效和特异的抗肿瘤活性，可能成为临床治疗mm的新疗法。