SMN1基因2+0型的检测装置、检测试剂盒及检测方法与流程

本技术涉及基因检测，尤其涉及smn1基因2+0型检测装置、检测试剂盒及检测方法。

背景技术：

1、生物的遗传多样性大多由基因突变和染色体畸变引发的，常见的基因突变有：1、碱基置换突变，也叫点突变，指dna分子中的一个碱基对被另一个不同的碱基对取代所引起的突变，可以分为转换和颠换两种形式。2、移码突变，指dna片段中某一位点插入或丢失一个或几个(非3或3的倍数)碱基对时，造成插入或丢失位点后的一系列编码顺序发生改变，从而严重影响蛋白质或酶的结构与功能。缺失突变，基因因为较长片段的dna缺失而发生的突变。插入突变，一个基因的dna中插入一段外来dna，导致结构被破坏发生突变。

2、染色体畸变是指生物细胞中染色体在数目和结构上发生的变化。多数真核生物的体细胞中都具有两个染色体组，常见染色体数目畸变包括：某一染色体的数目增减的非整倍体改变，和成套染色体组数目的增减的整倍性改变。常见染色体结构畸变，染色单体或染色单体间结构发生两种变化：1、简单的缺失，即单体断裂下来的片段丢失。2、结构重排，即发生在同一染色体臂内或臂间的单体内互换和发生在不同染色体的单体间的互换。

3、目前报道，有种特殊染色体畸变现象越来越受到关注。正常情况下，每条染色单体携带1拷贝基因元件，即每个个体的基因元件的拷贝数均为2。但是还有一种特殊类型的携带者个体，这类携带者的基因元件拷贝数虽然为2，但是却位于同一条染色单体，而另一条染色体上的基因元件丢失，即2+0型基因元件的染色体。在植物相关研究中，蔷薇科的svp基因的扩增和分化主要是通过进化过程中的沿袭特异性的方式产生的，通过序列比对、选择压力和顺式作用元件分析表明，在蔷薇科不同谱系中，svp基因的串联重复具有重大的功能创新和多样化。

4、又例如，脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy,sma)是儿童时期较为常见的神经肌肉病，呈常染色体隐性遗传。运动神经元存活基因1(survival motor neuron 1,smn1)是sma的致病基因，绝大部分的sma患儿是由于smn1基因的纯合缺失突变所致。smn2基因与smn1基因高度同源，是sma的表型修饰基因。此外，smn1基因和smn2基因均定位于5q13.2，smn1基因靠近端粒，而smn2基因靠近着丝粒，二者成镜像排列。这些特征使得smn1基因易于发生缺失、重复以及与smn2之间的基因转换，造成人群中smn1基因拷贝数变异较大。

5、图1为smn1基因拷贝数示意图，如图1所示，正常情况下，每条染色体携带1拷贝smn1基因和1拷贝smn2基因，即每个个体的smn1基因和smn2基因的拷贝数均为2。对于smn1基因纯合缺失的先证者(拷贝数为0)，其双亲smn1基因的拷贝数通常为1，也就是一条染色体上的smn1基因丢失，即经典的sma携带者。但是sma还有一种特殊类型的携带者，这类携带者的smn1基因拷贝数虽然为2，但是却位于同一条染色体(incis)，而另一条染色体上的smn1基因丢失，即2+0型携带者。有效识别2+0型携带者对于提高sma携带者检出率以及为家庭提供精准的遗传咨询至关重要。

6、作为特殊类型的携带者，2+0基因型在一般人群中的携带率约为5％～8％。以mlpa、real-time pcr为代表的基因定量检测技术虽然可以明确smn1和smn2基因的拷贝数，但是无法区分2+0基因型和正常的1+1基因型，需要辅以其他检测技术综合分析。chen等早在1999年就利用smn1基因荧光定量结合单倍型分析的方法证实了2+0基因型的存在。2000年，yan等通过将人类细胞与小鼠细胞融合后进行选择性培养，可以分离出单个人类染色体。2001年mailman等利用上述技术成功检测出了2+0基因型，但是这项技术耗时且费力。近来也有报道利用单精子测序的方法辅助明确男性个体2+0基因型,但不适于女性个体。因此，就目前而言，尚无能够实现直接检测smn1基因2+0基因型的技术方案。

技术实现思路

1、鉴于背景技术中存在的问题，本发明提供了一种smn1基因2+0型的检测装置、检测试剂盒及检测方法，以提高诊断准确率，简化操作流程，提高检测时效性，可应用于sma携带者筛查、临床确诊和遗传分析等。

2、为了达到上述目的，本技术的第一方面提供一种smn1基因2+0型的检测装置，包括基于数字pcr平台的检测模块和算法判读模块；

3、所述基于数字pcr平台的检测模块至少包括：

4、a.smn1基因拷贝数检测模块：该模块采用针对smn1基因区别于smn2基因的差异位点区域设计的引物序列和探针序列，检测smn1基因的拷贝数；

5、b.5号染色体完整性检测模块：该模块采用针对smn1基因所在的5号染色体设计的引物序列和探针序列，检测5号染色体的完整性；

6、c.基因组拷贝数或细胞完整性检测模块：该模块采用针对除5号染色体外的其他22对常染色体和1对性染色体设计的引物序列和探针序列，检测基因组拷贝数或细胞完整性；

7、所述算法判读模块从所述基于数字pcr平台的检测模块中获取检测数据、根据容斥原理和泊松分布统计完整染色体的数量，并进一步计算smn1的拷贝数，判断样本是否为smn1基因2+0型。

8、优选地，所述针对smn1基因区别于smn2基因的差异位点区域设计的引物序列和探针序列、所述针对smn1基因所在的5号染色体设计的引物序列和探针序列、所述针对除5号染色体外的其他22对常染色体和1对性染色体设计的引物序列和探针序列为taqman探针、mgb探针或arms探针中的任意一种。

9、优选地，本发明提供的smn1基因2+0型的检测装置，包括如下引物探针组合：

10、(1)用于检测smn1或smn2第7外显子c.840位点的上游引物，其核苷酸序列如seqid no.1所示，和下游引物，其核苷酸序列如seq id no.2所示；

11、(2)用于检测smn1第7外显子探针，其核苷酸序列如seq id no.3所示；

12、(3)用于检测smn2第7外显子探针，其核苷酸序列如seq id no.4所示；

13、(4)用于检测内参基因mrps18c的上游引物，其核苷酸序列如seq id no.5所示，和下游引物，其核苷酸序列如seq id no.6所示；

14、(5)用于检测内参基因的探针，其核苷酸序列如seq id no.7所示；

15、其中，上述每条探针的两端都分别连接有一对互不相同的荧光发生基团、荧光淬灭基团。

16、优选地，所述探针5’端标记的荧光基团选自fam、fitc、cy3、vic、hex、rox、tet、ned、cy5或cy5.5中的任意一种；所述探针3’端标记的荧光基团选自mgb、bhq-1、bhq-2或bhq-3中的任意一种。

17、优选地，本发明提供地smn1基因2+0型的检测装置中，算法判读模块从基于数字pcr平台的检测模块中获取的检测数据包括：

18、n总＝有效液滴数，

19、nf＝fam通道阳性反应单元数，

20、nh＝hex通道阳性反应单元数，

21、nr＝rox通道阳性反应单元数，

22、nfh＝fam和hex通道共阳性反应单元数，

23、nfr＝fam和rox通道共阳性反应单元数，

24、nhr＝hex和rox通道共阳性反应单元数，

25、nfhr＝fam、hex和rox通道共阳性反应单元数；

26、检测样本中含有大量的cfdna，会对检测结果造成干扰，因此需要从结果中筛选出完整的染色体进行分析，以提高分析的准确性，本发明根据容斥原理和泊松分布统计完整染色体的数量，并进一步计算smn1的拷贝数包括如下步骤：

27、(1)计算fam、hex和rox三通道均为阳性的反应单元阳性率：

28、

29、(2)计算fam和hex两通道均为阳性的反应单元阳性率：

30、

31、(3)计算fam和rox两通道均为阳性的反应单元阳性率：

32、

33、(4)计算hex和rox两通道均为阳性的反应单元阳性率：

34、

35、(5)计算各荧光通道组合的拷贝数：

36、cfhr＝-ln(1-pfhr)/v

37、cfh＝-ln(1-pfh)/v-cfhr

38、cfr＝-ln(1-pfr)/v-cfhr

39、chr＝-ln(1-phr)/v-cfhr

40、cf＝-ln(1-pf)/v-cfh-cfr-cfhr

41、ch＝-ln(1-ph)/v-cfh-chr-cfhr

42、cr＝-ln(1-pr)/v-cfr-chr-cfhr

43、其中，cfhr、cfr和chr为完整细胞的拷贝数，

44、则完整细胞中的smn1拷贝数为(cfhr+cfr)/(cfhr+cfr+chr)*2，

45、游离dna片段中的smn1拷贝数为(cf+cfh)/cr*2，

46、如完整细胞中的smn1拷贝数为1，游离dna片段中的smn1拷贝数为2，二者比值f为2，则判断为smn1基因2+0型。

47、优选地，所述数字pcr平台包括但不限于油包水式数字pcr平台或芯片式数字pcr平台。

48、优选地，所述基于数字pcr平台的检测模块的检测样本为分散良好的染色体分裂相样本或单倍体细胞样本，包括用全血或组织细胞处理得到的染色体分裂相样本或精液样本。

49、优选地，本发明提供的smn1基因2+0型的检测装置还包括样本处理模块，所述样本处理模块对全血样本或细胞组织或精液样本进行如下处理：

50、(1)全血样本或细胞组织处理：经过常规细胞培养、0.02μl/ml秋水仙素终止细胞生长、分离中期细胞、0.075mol/l kcl低渗裂解细胞，获取分散良好的染色体分裂相样本；

51、(2)精液样本处理：使用a-糜蛋白酶对精液样本进行室温液化处理10～15min；将液化样本用生理盐水稀释重悬，或者用5倍体积的生理盐水两次洗涤，或者直接吸取2μl精液样本用于检测。

52、本技术的第二方面提供一种smn1基因2+0型的检测试剂盒，该试剂盒包括：

53、(1)用于检测smn1或smn2第7外显子c.840位点的上游引物，其核苷酸序列如seqid no.1所示，和下游引物，其核苷酸序列如seq id no.2所示；

54、(2)用于检测smn1第7外显子探针，其核苷酸序列如seq id no.3所示；

55、(3)用于检测smn2第7外显子探针，其核苷酸序列如seq id no.4所示；

56、(4)用于检测内参基因mrps18c的上游引物，其核苷酸序列如seq id no.5所示，和下游引物，其核苷酸序列如seq id no.6所示；

57、(5)用于检测内参基因的探针，其核苷酸序列如seq id no.7所示；

58、其中，上述每条探针的两端都分别连接有一对互不相同的荧光发生基团、荧光淬灭基团，所述探针5’端标记的荧光基团选自fam、fitc、cy3、vic、hex、rox、tet、ned、cy5或cy5.5中的任意一种；所述探针3’端标记的荧光基团选自mgb、bhq-1、bhq-2或bhq-3中的任意一种。

59、进一步地，本发明提供的smn1基因2+0型的检测试剂盒，还包括pcr扩增试剂：ph为8.3、浓度为20mmol/l的tris-hcl缓冲液、mgcl2、dntps、kcl、nh4cl、dna聚合酶和水。

60、本技术的第三方面提供一种smn1基因2+0型的检测方法，其包括如下步骤；

61、(1)数字pcr检测：

62、a.检测smn1基因拷贝数：采用针对smn1基因区别于smn2基因的差异位点区域设计的引物序列和探针序列，检测smn1基因的拷贝数；

63、b.检测5号染色体完整性：采用针对smn1基因所在的5号染色体设计的引物序列和探针序列，检测5号染色体的完整性；

64、c.检测基因组拷贝数或细胞完整性：采用针对除5号染色体外的其他22对常染色体和1对性染色体设计的引物序列和探针序列，检测基因组拷贝数或细胞完整性；

65、(2)算法判读：

66、基于步骤(1)中的检测数据、根据容斥原理和泊松分布统计完整染色体的数量，并进一步计算smn1的拷贝数，判断样本是否为smn1基因2+0型。

67、本发明提供的检测方法中，所述数字pcr检测的检测样本为分散良好的染色体分裂相样本或单倍体细胞样本，优选用全血或组织细胞处理得到的染色体分裂相样本或精液样本。

68、优选地，本发明提供的检测方法中，所述针对smn1基因区别于smn2基因的差异位点区域设计的引物序列和探针序列、所述针对smn1基因所在的5号染色体设计的引物序列和探针序列、所述针对除5号染色体外的其他22对常染色体和1对性染色体设计的引物序列和探针序列为taqman探针、mgb探针或arms探针中的任意一种。

69、优选地，本发明提供的检测方法中，具体包括如下引物探针组合：(1)用于检测smn1或smn2第7外显子c.840位点的上游引物，其核苷酸序列如seq id no.1所示，和下游引物，其核苷酸序列如seq id no.2所示；(2)用于检测smn1第7外显子探针，其核苷酸序列如seq id no.3所示；(3)用于检测smn2第7外显子探针，其核苷酸序列如seq id no.4所示；(4)用于检测内参基因mrps18c的上游引物，其核苷酸序列如seq id no.5所示，和下游引物，其核苷酸序列如seq id no.6所示；(5)用于检测内参基因的探针，其核苷酸序列如seqid no.7所示，其中，上述每条探针的两端都分别连接有一对互不相同的荧光发生基团、荧光淬灭基团。

70、优选地，本发明提供的检测方法中，所述探针5’端标记的荧光基团选自fam、fitc、cy3、vic、hex、rox、tet、ned、cy5或cy5.5中的任意一种；所述探针3’端标记的荧光基团选自mgb、bhq-1、bhq-2或bhq-3中的任意一种。

71、优选地，本发明提供的检测方法中，所述算法判读步骤中使用的检测数据包括：

72、n总＝有效液滴数，

73、nf＝fam通道阳性反应单元数，

74、nh＝hex通道阳性反应单元数，

75、nr＝rox通道阳性反应单元数，

76、nfh＝fam和hex通道共阳性反应单元数，

77、nfr＝fam和rox通道共阳性反应单元数，

78、nhr＝hex和rox通道共阳性反应单元数，

79、nfhr＝fam、hex和rox通道共阳性反应单元数；

80、所述根据容斥原理和泊松分布统计完整染色体的数量，并进一步计算smn1的拷贝数包括如下步骤：

81、(1)计算fam、hex和rox三通道均为阳性的反应单元阳性率：

82、

83、(2)计算fam和hex两通道均为阳性的反应单元阳性率：

84、

85、(3)计算fam和rox两通道均为阳性的反应单元阳性率：

86、

87、(4)计算hex和rox两通道均为阳性的反应单元阳性率：

88、

89、(5)计算各荧光通道组合的拷贝数：

90、cfhr＝-ln(1-pfhr)/v

91、cfh＝-ln(1-pfh)/v-cfhr

92、cfr＝-ln(1-pfr)/v-cfhr

93、chr＝-ln(1-phr)/v-cfhr

94、cf＝-ln(1-pf)/v-cfh-cfr-cfhr

95、ch＝-ln(1-ph)/v-cfh-chr-cfhr

96、cr＝-ln(1-pr)/v-cfr-chr-cfhr

97、其中，cfhr、cfr和chr为完整细胞的拷贝数，

98、则完整细胞中的smn1拷贝数为(cfhr+cfr)/(cfhr+cfr+chr)*2，

99、游离dna片段中的smn1拷贝数为(cf+cfh)/cr*2，

100、如完整细胞中的smn1拷贝数为1，游离dna片段中的smn1拷贝数为2，二者比值f为2，则判断为smn1基因2+0型。

101、优选地，本发明提供的检测方法中，还包括样本处理步骤，所述样本处理步骤对全血样本或细胞组织或精液样本进行如下处理：(1)全血样本或细胞组织处理：经过常规细胞培养、0.02μl/ml秋水仙素终止细胞生长、分离中期细胞、0.075mol/l kcl低渗裂解细胞，获取分散良好的染色体分裂相样本；(2)精液样本处理：使用a-糜蛋白酶对精液样本进行室温液化处理10～15min；将液化样本用生理盐水稀释重悬，或者用5倍体积的生理盐水两次洗涤，或者直接吸取2μl精液样本用于检测。