一种单克隆抗体的下游纯化工艺方法与流程

本发明涉及生物制药领域，涉及重组抗体的下游纯化工艺方法。

背景技术：

1、背景技术的陈述只是提供与本发明有关的信息，而不必然地构成现有技术。

2、抗体药物主要包括单克隆抗体药物、抗体偶联药物(adc)、双特异性抗体药物、fc融合蛋白药物等。其中单克隆抗体药物在靶点治疗和免疫疗法中应用广泛。由单一b细胞克隆产生的仅针对某一特定抗原表位表达的抗体，具有较好的特异性和安全性。根据免疫原性，单克隆抗体药物包括鼠源单抗、人鼠嵌合单抗、人源化单抗和全人源单抗。

3、据统计，2018年全球最畅销的10种药物中，有9种是生物药，其中包括7种单克隆抗体药物和2种融合蛋白药物。这9种生物药销售额为769亿美元，在10种药物中占比88.80％。随着人类医疗水平及需求的提高，预计单克隆抗体药物的全球销售额，在2023年将增至2356亿美元，在2030年将增长至3280亿美元。而国内的单克隆抗体药物还处于早期起步阶段，很多药物还需要依靠从国外引进。但可喜的是，截止2020年底，国产生物药大量迅速进入国家医保目录。据推测我国单克隆抗体药物市场到2023年将达到1565亿美元，到2030年有望达到3678亿美元。

4、如何快速高效地将抗体从细胞培养液中纯化出来，面临不同的分离层析技术，是本领域亟待解决的技术问题。本发明旨在提供一种低成本更高效的工艺研究思路。

5、细胞培养液的澄清是单抗分离纯化的首要步骤，目的是使用简单的操作快速去除细胞和细胞碎片，同时能够提高后续层析纯化的效率，并为产品过程分析提供条件。

6、亲和层析的目的是特异性地捕获细胞培养液中的蛋白质，在该过程中需要同时去除大量的杂质如hcd(宿主细胞dna)、hcp(宿主细胞蛋白)等，因此在本步骤洗脱蛋白前增加两步淋洗步骤，旨在快速大量去除工艺杂质。淋洗条件的选择尤为重要。

7、接下来通过离子层析对目标蛋白进一步纯化，包括阴离子层析和阳离子层析，均采用试验设计doe进行工艺最佳窗口的研究。阴离子层析用于去除酸性物质如细菌内毒素、hcd等，阳离子层析能去除聚集体及提高抗体的电荷纯度。两者均通过离子强度相互作用对目标物结合洗脱，因此选择合适的离子强度和ph尤为关键。

技术实现思路

1、本发明提供了一种单克隆抗体的下游纯化工艺方法，它可以安全、有效、低成本地对目的蛋白进行高效的纯化。

2、本公开提供了一种单克隆抗体下游纯化的工艺方法，其包括以下步骤：

3、a)深层过滤：使用串联的深层囊式滤器和除菌滤器对表达单克隆抗体的细胞的培养液进行深层过滤；

4、b)亲和层析：使用中性含盐的平衡缓冲液平衡亲和层析柱，将步骤a)中获得的产物上样至所述亲和层析柱，使用所述平衡缓冲液进行复平衡，再使用两种不同浓度的不含盐的淋洗缓冲液进行淋洗，最后使用不含盐的洗脱缓冲液进行洗脱；

5、c)低酸灭活病毒：将步骤b)中获得的产物调节至ph3.4±0.4，并在室温放置1-4小时；

6、d)阴离子交换层析：将步骤c)中获得的产物中和至ph7.3-7.9，并将电导率调节至2.3-2.8ms/cm，上样至阴离子交换层析柱，收集流穿峰；和

7、e)阳离子交换层析：使用低盐平衡缓冲液平衡阳离子交换层析柱，将步骤d)中获得的产物调节至ph4.6-5.2，并将电导率调节至4.0-5.0ms/cm，上样至所述阳离子交换层析柱，使用所述低盐平衡缓冲液进行复平衡，使用两种高盐洗脱缓冲液进行分步洗脱，合并洗脱产物以获得经纯化的单克隆抗体。

8、在本公开的方法中，具体而言，细胞培养液的澄清是单抗分离纯化的首要步骤，目的是使用简单的操作快速去除细胞和细胞碎片。该步骤能够减小后续纯化层析和过程分析的压力，使工艺研究和过程控制更加精确。在步骤a)中选择深层囊式滤器(0.8-0.2μm)，串联除菌滤器(0.22μm)通过膜过滤除菌。

9、其中，所述b)亲和层析步骤中，首先用平衡缓冲液50mm tris-hac，150mm nacl，ph7.2平衡层析柱后，直接进行深层过滤后料液上样。上完样后，用平衡缓冲液50mm tris-hac，150mm nacl，ph7.2再进行复平衡。接着用淋洗缓冲液1：500mm tris-hac，ph7.4进行第一次淋洗后，再用淋洗缓冲液2：50-100mm hac-naac，ph5.0-5.5进行第二次淋洗。最后用洗脱缓冲液50-100mm hac-naac或gly-hcl或柠檬酸盐，ph3.7进行洗脱。

10、优选地，使用淋洗缓冲液2：50mm hac-naac，ph5.0进行第二次淋洗，使用洗脱缓冲液50mm hac-naac，ph3.7进行洗脱。

11、其中，所述c)低酸灭活病毒步骤中，将步骤b)中获得的产物调节至ph3.4±0.4，并在室温放置1-4小时。优选地，将得到的亲和层析洗脱收集料液用对应酸根调节ph3.4±0.4，室温(18-26℃)放置1-4小时，低酸病毒灭活后，用缓冲液1m tris-hac，ph9.0将料液中和至ph6.5±0.5。

12、优选地，使用1m hac调ph3.7±0.1，室温放置1小时。

13、其中，所述d)阴离子交换层析操作执行流穿模式。优选地，以1m tris-hac，ph9.0作为ph调整液，wfi(注射用水)作为稀释液，对病毒低酸灭活中和后的料液进行ph和电导率调整，调ph7.3-7.9，调电导率2.3-2.8ms/cm，0.2μm滤器过滤后，作为阴离子交换层析上样料液。层析柱经平衡缓冲液20mm tris-hac，15.7mm nacl，ph7.7平衡后，用上述调整ph和电导率后的料液上样，上样载量≤200mg/ml gel。收集流穿峰，此时抗体蛋白在流穿收集峰中，工艺相关杂质保留在层析柱上。随后阴离子交换层析柱经20mm tris-hac，1m nacl，ph7.7再生后，室温保存于20％乙醇中。

14、优选地，使用缓冲液1m tris-hac，ph9.0调节ph7.7±0.2，使用注射用水调节电导率2.6±0.2ms/cm。

15、其中，所述e)阳离子交换层析作为精纯步骤，以除去痕量的工艺相关杂质。优选地，以1m hac作为ph调整液，1m nacl作为电导率调整液，对阴离子交换层析流穿收集料液进行ph和电导率调整，调ph4.6-5.2，调电导率4.0-5.0ms/cm，以此作为阳离子交换层析上样料液。层析柱经平衡缓冲液25mm naac-hac，28mm nacl，ph4.9平衡后，用上述调整ph和电导率的料液上样。上样后，用25mm naac-hac，28mm nacl，ph4.9进行层析柱复平衡。之后，以150-330mm naac-hac，ph5.5作为第一步的洗脱缓冲液1，进行洗脱组分1的收集。接着，以230-300mm naac-hac，ph5.5作为第二步的洗脱缓冲液2，进行洗脱组分2的收集。最后，用20mm tris-hac，1m nacl，ph7.7进行层析柱再生，并室温保存于20％乙醇中。

16、优选地，使用1m hac调节ph4.9±0.2，1m nacl调节电导率4.5±0.4ms/cm，使用洗脱缓冲液1：250-330mm naac-hac，ph5.5进行第一步洗脱，使用洗脱缓冲液2：260-300mmnaac-hac，ph5.5进行第二步洗脱。

17、更优选地，使用洗脱缓冲液1：200mm naac-hac，ph5.5进行第一步洗脱，使用洗脱缓冲液2：300mm naac-hac，ph5.5进行第二步洗脱。

18、本发明具有以下收益和效果：

19、1.首先对培养料液进行深层过滤，该步骤能快速去除大量细胞杂质，减小后续纯化层析和过程分析的压力；

20、2.在亲和层析中使用高低浓度两种缓冲液进行淋洗，该步骤能快速去除料液中大量的hcp和hcd等；

21、3.在阴离子层析中使用流穿模式，该步骤能去除大量的酸性物质，如细菌内毒素、病毒及核酸等；

22、4.在阳离子层析中，使用高盐进行线性洗脱或使用几种高盐溶液组合洗脱，从而获得更好的纯度和收率，并且能够有效降低目标产物的表面电荷异质性。