一种芒草VIGS沉默体系及其应用

本发明本发明属于基因工程，具体涉及一种芒草mspds基因vigs沉默体系及其应用。

背景技术：

1、病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing，vigs）是通过插入目的基因片段的重组病毒来抑制植物内源基因表达的遗传技术，源于植物免疫系统应对病毒感染侵袭的内在机制。vigs主要用于基因的功能分析，是植物体内普遍存在的一种遗传免疫机制，属于转录后沉默。vigs技术可在植物的当代直接产生rnai效果，可大幅度节约时间和成本，且无需构建转基因植株，因此具有周期短、操作简便、成本低等优点，尤其适合用于转化体系不成熟或受基因型限制的植物的基因沉默。vigs技术在基因功能研究中越来越受欢迎，目前已经成为功能基因组学研究领域常用的技术手段之一，被广泛应用于植物的生长发育、抗虫病和代谢调控等相关基因功能研究方面。到目前为止，trv病毒介导的vigs已在番茄、烟草、棉花、辣椒、拟南芥、辣椒、马铃薯、玉米、小麦、矮牵牛等植物上成功应用。

2、芒属植物是最有潜力的生物能源作物之一，属于多年生的c4植物，具有光合效率高，生物量高，对水分和养分的需求低，环境适应性好等优点，非常适合在边际土地上种植。同时，芒草含有丰富的木质纤维素，可作为下一代生物乙醇生产的理想原料。全世界约有芒草17个种，主要包括中国芒（m.sinensis）、五节芒（m.floridulus）、荻（m.sacchariflorus）、南荻（ m. lutarioriparius）等。目前，国内外学者对芒草的研究主要集中于育种方面，其分子生物学研究方面仍处于起步阶段。虽然有报道在芒草中成功转化了报告基因gus，但该过程时间较长（至少需要6个月）且繁琐，最主要的是转化效率较低。由于芒草缺乏稳定高效的遗传转化体系，所以在一定程度上制约了芒草基因功能研究的进展，而vigs技术不需要建立遗传转化体系即可获得基因沉默植株，从而有望克服上述瓶颈来大大促进相关基因的功能鉴定。虽然vigs技术目前已在许多植物上成功应用，但是芒草中还没有相关报道，因此，亟待建立一套在芒草中高效诱导内源基因沉默的vigs体系。同时，vigs沉默效率受到不同的接种方法、侵染液浓度、环境温度、植株大小、共培养时间等因素的影响，如何建立一种芒草高效的沉默体系也是需要解决的一个关键问题。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的上述不足，本发明所要解决的技术问题在于提供一种高效的芒草 mspds基因的vigs沉默体系。本发明所要解决的另一技术问题在于所述的芒草 mspds基因的vigs沉默体系的构建方法。本发明还要解决的一个技术问题在于提供所述芒草 mspds基因的vigs沉默体系的应用，通过该体系可实现目的基因的沉默，能够快速、简便、低成本验证芒草基因功能。

2、为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

3、1、一种芒草 mspds基因的vigs沉默体系，所述沉默体系含有如seq id no.1所示的核苷酸序列。

4、所述的芒草 mspds基因的vigs沉默体系的构建方法，按以下步骤进行：

5、（1）以芒草幼嫩叶片为材料，提取芒草rna，反转录获得芒草cdna；

6、（2）设计用于vigs载体构建的 mspds基因沉默片段的pcr扩增引物：mspds-vigs-f和mspds-vigs-r，其核苷酸序列分别为：

7、mspds-vigs-f：ttctctagaaggcctccatggcactcaatttcataaatcctgatgagt

8、mspds-vigs-r：gagacgcgtgagctcggtaccgcttgaagatatcaactggtgttgc

9、在所述引物5'端分别添加ptrv2载体同源臂（小写字母、下划线部分）。

10、（3）以芒草cdna为模板，使用mspds-vigs-f和mspds-vigs-r引物进行扩增，获得扩增的含有seq id no.1的 mspds片段。

11、（4）通过同源重组的方法，将 mspds片段和经kpni/ncoi双酶切的ptrv2质粒进行同源重组，将重组产物转化大肠杆菌，经过抗性筛选、测序验证后，提取阳性重组质粒，将成功连接 mspds的ptrv2载体命名为ptrv2- mspds。

12、（5）将获得的基因片段在phytozome数据库中进行同源性搜索，确认该片段是需要沉默基因的特异性片段。

13、2、进一步地，所述的芒草 mspds基因的vigs沉默体系在鉴定芒草 mspds基因功能中的应用，包括如下步骤：

14、（1）将ptrv1、ptrv2- mspds质粒分别通过电击法转入农杆菌感受态细胞中；

15、（2）挑取经pcr鉴定后的阳性农杆菌菌落，接入yeb液体培养基培养；

16、（3）将分别含有ptrv1、ptrv2- mspds的yeb培养基进行等体积混合；

17、（4）在上述混合液中加入100μm乙酰丁香酮，3.3mm半胱氨酸，5mg/l吐温20。

18、（5）同时，将芒草种子播种在湿润的滤纸上，放入30℃烘箱进行催芽，芽的长度为0.5-2.0mm，优选的为0.5-1.0mm。

19、（6）将种子浸入混合液中，放入真空设备中进行真空渗透，真空度为-95kpa，时间为30-120分钟，优选的抽真空时间为90分子。

20、（7）然后将浸泡种子的混合液放至28℃，220rpm的烘箱中进行振荡共培养，共培养时间为0-25小时，优选的共培养时间为5小时。

21、（8）共培养后的种子放至湿润的滤纸上光照培养或者移栽到营养土中进行培养，培养条件：温度为25℃，光照周期为16h光照/8h黑暗、相对湿度为60-70%。

22、（9）继续培养芒草幼苗，观察叶片表型变化。

23、（10）通过检测叶绿素含量，验证该系统的有效性。

24、（11）通过荧光定量pcr检测被沉默基因的表达量。

25、相比于现有技术，本发明的有益效果为：

26、本发明首次构建了芒草基因vigs沉默体系，能够有效降低芒草目标基因的表达水平。通过对不同的接种方法、侵染液浓度、环境温度、植株大小、共培养时间等因素的实验，提供了一种提高vigs基因沉默效率的方法。芒草基因vigs沉默体系可实现实验周期短，能够快速、简便、低成本验证芒草的基因功能，该体系在能源植物芒草的功能基因研究中具有较大的应用价值。