一种分泌PD-1单域抗体靶向CD105的CAR-T细胞及其制备方法和应用

本发明属于肿瘤生物制品领域，涉及过继免疫治疗中的一种分泌pd-1单域抗体靶向cd105的car-t细胞(cd105-pd-1/nb car-t)及其制备方法和应用。

背景技术：

1、t细胞可以通过表达嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,car)靶向肿瘤细胞。通过将特异性识别肿瘤抗原的单链抗体与可活化t细胞的受体胞内结构域“免疫受体酪氨酸活化基序”用人工方法融合成重组基因，生成重组质粒，再在体外通过转染技术转染到患者的t细胞，使患者t细胞表达肿瘤抗原受体，这样的疗法称为car-t细胞疗法。car-t细胞疗法是当下肿瘤免疫治疗的最热门最有研究价值的治疗方法。目前car-t治疗在血液肿瘤中取得了很好的进展，但是由于实体肿瘤微环境复杂，car-t对实体瘤的杀伤效果有限，因此需要探索新的方法来提高car-t治疗实体肿瘤的活性。

2、car的基础设计中包括肿瘤相关抗原结合区、胞内信号区、跨膜区、胞外铰链区等。car-t目前已经发展到第四代，目前在血液肿瘤中取得了较好的进展，而对于实体瘤治疗，car-t细胞疗效一直不佳，其中重要原因是肿瘤特异性t细胞难以突破肿瘤微环境的免疫抑制作用。除此之外目前大多数car识别抗原的部分是由单链抗体组成的，由于不同的单链抗体的vl和vh之间会出现错配，使得表达出来单链抗体亲和力下降，也是造成car-t治疗效果不佳的原因。因此需要探索新的方法来提高car-t治疗实体肿瘤的活性，进一步研究构建既能特异性识别肿瘤抗原并且产生高效抗癌作用的cd105-pd-1/nb car-t细胞。

3、纳米抗体(单域抗体，nb或vhh)是目前最小的功能性抗原特异性结合天然片段，由大约120个氨基酸组成，长度4nm，直径2.5nm，相对于传统的单克隆抗体以及fab片段(55×103)或者scfv(28×103)，纳米抗体的分子量更小，因此具有更强更快的组织透过能力，能够到达实体瘤等致密组织发挥作用。除此之外纳米抗体具有稳定性好、亲和力较高、免疫原性弱、易于进行基因改造、不会出现传统抗体容易产生错误配对以及需要优化重链和轻链连接序列问题等优点，在肿瘤免疫治疗等方面展现了广阔的应用前景。

4、肿瘤微环境中内皮细胞增殖相关抗原已成为实体肿瘤免疫治疗新靶点。endoglin(cd105)在处于增殖状态的肿瘤血管组织内皮细胞上强表达，而在正常血管内皮细胞不表达或弱表达，是恶性肿瘤新生血管的标志。纳米抗体由于分子小渗透性强等特点能够提高实体瘤穿透性，更好地侵入实体瘤内部发挥作用。因此，构建以cd105单域抗体为基础的car-t疗法对改善实体肿瘤表现出良好的效果。

5、程序性死亡受体1(pd-1)作为免疫抑制的关键，一直是肿瘤免疫微环境研究的重点，旨在消除其对t细胞的负性作用，增强抗肿瘤效果。本研究构建分泌pd-1单域抗体靶向cd105的新型car-t细胞(文中命名cd105-pd-1/nb car-t)，克服cd105 nb car-t免疫微环境中pd-1信号的抑制作用，展示了基于单域抗体的car-t细胞靶向肿瘤微环境提高car-t细胞对实体肿瘤细胞的杀伤活性。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种工程化分泌pd-1单域抗体靶向cd105的car-t细胞。另一个目的是提供所述car-t细胞的制备方法以及提供所述car-t细胞在制备用于治疗肿瘤的制剂中的应用。

2、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、一种工程化分泌pd-1单域抗体靶向cd105的car-t细胞，所述car-t细胞是嵌合抗原受体cd105 nb-histag-cd8-cd137-cd3ζ-pd-1nb修饰的t细胞。

4、所述的分泌pd-1单域抗体靶向cd105的car-t细胞，其中所述嵌合抗原受体cd105nb-histag-cd8-cd137-cd3ζ-pd-1nb的核苷酸序列如序列表中seq id no.1所示。

5、一种所述car-t细胞的制备方法，该方法包括以下步骤：设计car目的序列，通过pcr法获得cd105/nb-histag-cd8-cd137(4-1bb)-cd3ζ-2a-pd-1nb-ires的car目的序列片段。将酶切后的慢病毒载体gv401与pcr法得到的car目的序列重组。将重组后的慢病毒载体转化至dh5α大肠杆菌中,并且筛选阳性克隆菌。进行阳性克隆菌测序验证是否成功构建含有cd105-pd-1/nb car-t序列的慢病毒载体。对测序成功的重组阳性克隆菌株提取质粒，转染293t细胞后通过rt-pcr鉴定cd105-pd-1/nb car-t序列细胞中表达情况。验证重组慢病毒载体能正常表达后使用三质粒系统包装慢病毒，滴度检测，利用慢病毒感染技术构建car-t细胞，使t细胞表达该嵌合抗原受体。

6、一种如上述的car-t细胞的制备方法，所述方法包括以下步骤:

7、(1)含有car目的序列重组慢病毒载体构建：pcr法获得cd105/nb-histag-cd8-cd137(4-1bb)-cd3ζ-2a-pd-1nb-ires的car目的序列片段，并将合成的片段亚克隆至bamhi/ecori双酶切后的慢病毒载体gv401中，将重组后的慢病毒载体转化至dh5α大肠杆菌中，采用慢病毒载体上的引物和目的基因上的引物对氨苄抗生素筛选后的菌落进行pcr鉴定。将鉴定成功的菌液拿去测序。测序成功使用plasmid mini kit进行质粒抽提。

8、(2)慢病毒包装：采用三质粒系统，将含有car目的序列的质粒通过两种辅助质粒helper 1.0和helper 2.0共转染293t细胞，48h后在荧光显微镜下观察细胞增强绿色荧光蛋白(egfp)的表达。成功表达荧光则收集293t细胞上清，经过浓缩纯化，采用荧光稀释法测定病毒浓度，计数egfp阳性细胞个数，按照公式：病毒浓度＝荧光细胞数/该孔病毒原液体积来计算病毒滴度。

9、(3)t细胞制备：分离外周血的单个核细胞，进行培养获得t细胞。

10、(4)cd105-pd-1/nb car-t细胞：用含有人cd3单克隆抗体、人cd28单克隆抗体和人il-2细胞因子的专用t细胞培养基培养t细胞24小时。次日，按照moi 20将慢病毒液加入以上刺激后的t细胞中，在37℃co2培养箱培养48h，将car-t细胞置于普通显微镜下，观察car-t细胞的增强绿色荧光蛋白(egfp)的表达情况。

11、如上述的制备方法，在所述步骤(4)中，待慢病毒感染后的t细胞的细胞量占培养瓶80-90％时将细胞收集换液，加入终浓度为100u/ml的il-2的完全培养液进行扩增培养，采用流式细胞仪对感染的细胞进行鉴定。

12、如上述的制备方法，其中所述car-t细胞是采用慢病毒感染技术进行制备的。

13、一种所述的分泌pd-1单域抗体靶向cd105的car-t细胞在制备用于治疗肿瘤的制剂中的应用。

14、如上述的应用，优选的，所述的肿瘤是指cd105阳性肿瘤。

15、一种药物组合物，所述药物组合物包含所述的分泌pd-1单域抗体靶向cd105的car-t细胞和药学上可接受的载体。

16、一种编码嵌合抗原受体的核苷酸序列，其中所述嵌合抗原受体为cd105/nb-histag-cd8-cd137(4-1bb)-cd3ζ-2a-pd-1nb-ires。

17、一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体为cd105/nb-histag-cd8-cd137(4-1bb)-cd3ζ-2a-pd-1nb-ires。

18、本发明的研究者发现在对cd105阳性肿瘤免疫治疗中，分泌pd-1单域抗体靶向cd105的car-t细胞的优势在于特异性的靶向，即增强免疫细胞靶向识别肿瘤抗原，此外还增强了嵌合抗原受体依赖的肿瘤杀伤活性以及输注后在肿瘤部位的浸润，降低t细胞耗竭。cd105-pd-1/nb car-t细胞所拥有的这些特性源于嵌合抗原受体的功能结构，主要包含抗原识别区域及细胞激活区域，细胞内激活区域能延长细胞在体内的存活时间。另外本发明采用慢病毒感染进行制备car-t细胞，提供一种高效制备cd105-pd-1/nb car-t细胞的方法，该方法制备的car-t能稳定表达嵌合抗原受体，具有较好的应用前景。