一种瑞士乳杆菌及其在制备助眠产品中的应用的制作方法

本发明属于微生物，具体涉及一种瑞士乳杆菌及其在制备助眠产品中的应用。

背景技术：

1、γ-氨基丁酸(gamma aminobutyric acid)简称gaba，又名4-氨基丁酸、氨酪酸，是一种人体中天然存在的、非蛋白组成的活性氨基酸。gaba广泛存在于哺乳动物的神经系统中，也广泛存在植物中，如番茄、马铃薯、葡萄、南瓜及茶叶等，发酵食品如泡菜、发芽糙米中也富含gaba。γ-氨基丁酸随年龄增加而下降，每10年人体gaba含量下降约5％，女性下降更快，gaba含量的下降是人的认知能力下降、大脑衰老的触发点。因此，经常补充gaba非常有必要。而且作为新资源食品原料，gaba在舒缓和助眠领域中应用十分广泛，其主要通过与相应离子通道受体结合，引起氯离子通道开启，使氯离子内流，细胞膜出现超极化,从而抑制动作电位的发生，进而抑制了神经传导，防止神经元过热，使人感觉平静，安稳。另外，据研究，gaba可以作用于胃肠道神经系统ens，ens含有gaba受体和gaba，通过肠脑轴可作用于大脑，发挥放松的作用。

2、益生菌作为一种有益于人体健康的微生物，与人类的生产、饮食等日常活动息息相关。随着科学家对于益生菌中潜在功能机理的不断挖掘和研究，让人们对于这种微小的细菌有了更为深入且全面的了解，并且在各种功能食品中都可见其身影，其中助眠的功能方向，是绝大多数失眠群体尤为关注的领域，由于大部分微生物的胃肠耐受性差，不能在胃肠道中定植，一般不能直接作为食品或食品添加剂使用。同时现有的微生物产gaba能力普遍偏低，放大生产存在一定困难，而且目前国内将高产gaba菌株直接运用于助眠益生菌压片糖果的开发几乎没有，所以从乳酸菌中得到高产gaba的菌株，并将其应用于制备功能性食品，有很好的应用前景。

3、乳杆菌属合成gaba的机制在于：乳杆菌由于代谢乳糖等碳源产生乳酸，引起外界溶液环境酸化，其体内的谷氨酸脱羧酶被充分激活，催化脱羧反应。此时，外界溶液环境中的l-谷氨酸会通过简单扩散的方式转移入胞内，由谷氨酸脱羧酶经脱羧消耗1个氢离子生成gaba和二氧化碳。

4、中国专利申请2014107305157，发明名称“一种高产氨基丁酸乳酸菌及其筛选方法”公开了一种以谷氨酸脱羧酶活性对高产gaba乳酸菌进行筛选的方法。经过鉴定为植物乳杆菌，该乳杆菌利用谷氨酸钠补料发酵，最终发酵液中gaba含量达到5.025g/l。中国专利申请2013100451393，发明名称“高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌及其应用”公开了一种自主筛选的高产gaba菌株，通过培养条件的优化，引入分批补料的方法，持续补加一定质量浓度的谷氨酸钠和灵芝发酵液，发酵液中gaba含量可达到20-25g/l。中国专利公开cn1276077c，发明名称“产γ－氨基丁酸的短乳杆菌及其用途”公开一种筛选产gaba乳酸菌的方法，通过基本的发酵培养方式，添加1％的谷氨酸钠，静置培养60小时，经高效液相分析得，含量为30g/l。中国专利申请cn101928679a，发明名称“一株高效转化l-谷氨酸为γ-氨基丁酸乳酸菌的选育”公开一种能利用l-谷氨酸生产γ-氨基丁酸的乳酸菌的方法，经紫外诱变后筛选得到一株正突变株，在100ml三角瓶中进行初步转化实验，利用氨基酸测定仪测定转化液中的γ-氨基丁酸，其浓度51.9g/l。

技术实现思路

1、针对上述技术问题，本发明从天然发酵食品中筛选分离到一株瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus)pljk-1372，所述瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus)pljk-1372具有发酵放大直至规模化生产的潜力，恒ph法厌氧分批补料发酵水平od值可达18g/l，活菌数突破1014cfu/g，高于同类型的乳酸菌，而且非常强的产γ-氨基丁酸(gaba)能力，产量高达112.65g/l；同时瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus)pljk-1372经体外胃酸和高胆汁盐模型以及细胞粘附法的验证，具有较强的胃肠液耐受性，存活率和定植力显著高于动物双歧杆菌bb12。而且能显著改善小鼠的睡眠质量，延长小鼠的睡眠时间，调节大脑中gaba的含量。

2、所述瑞士乳杆菌pljk-1372已于2023年4月27日保藏于武汉大学保藏中心，保藏单位的地址为湖北省武汉市武昌区武汉大学校内(武汉大学第一附属小学对面)，中国典型培养物保藏中心211室，保藏编号为cctcc m 2023655。

3、所述瑞士乳杆菌pljk-1372是从广西巴马的发酵酸菜中获得的。

4、本发明的另一目的在于提供一种益生菌减压助眠压片糖果，所述益生菌压片糖果包含瑞士乳杆菌pljk-1372。

5、其中所述瑞士乳杆菌pljk-1372优选为粉剂，所述瑞士乳杆菌pljk-1372高产γ-氨基丁酸。

6、本发明的另一目的在于提供一种高产γ-氨基丁酸瑞士乳杆菌pljk-1372粉剂制备的方法：先将冻存的瑞士乳杆菌pljk-1372在固体培养基上划线，挑取单菌落接入液体种子培养基中厌氧培养，再转接基础发酵培养基中，恒ph法高密度分批补料发酵培养后离心，真空冷冻干燥技术处理，获得菌粉。

7、优选地，所述种子培养基和固体培养基、基础发酵培养基均为mrs培养基。

8、优选地，在对瑞士乳杆菌pljk-1372种子液制备前，需要先经活化处理，具体过程为：将冻存于-80℃甘油保藏的瑞士乳杆菌在mrs固体培养基上进行划线，37℃恒温培养箱厌氧培养24h。

9、优选地，所述mrs固体培养基的组成为：l-谷氨酸、蛋白胨、牛肉粉、酵母粉、葡萄糖、吐温80、磷酸氢二钾、乙酸钠、柠檬酸三铵、硫酸镁、硫酸锰、琼脂粉、蒸馏水和琼脂。

10、优选地，所述mrs固体培养基的组成为：20g l-谷氨酸、10g蛋白胨、5g牛肉粉、4g酵母粉、2g葡萄糖、1ml吐温80、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三铵、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰、15g琼脂粉、1000ml蒸馏水，琼脂15g/l。

11、优选地，所述种子培养条件为：35-40℃，培养20h以上。

12、优选地，所述种子培养条件为：37℃，培养24h。

13、优选地，所述恒ph法高密度补料发酵培养条件为：将菌种以高于2％的接种量接种于mrs液体培养基中；流加1-3％氢氧化钠溶液和2-5％ l-谷氨酸，恒定ph5-7，温度35-40℃，培养20h以上。

14、优选地，所述恒ph法分批补料发酵培养条件为将菌种以高于2％的接种量接种于mrs液体培养基中，流加1％氢氧化钠溶液和25g/l l-谷氨酸，维持ph值为5，温度37℃，静置培养24h。

15、优选地，所述真空冷冻干燥技术为：菌体经24h发酵培养后，以5000rpm、25℃离心10min取得菌泥，混入20％脱脂奶粉-20℃低温冷冻干燥。

16、优选地，所述益生菌压片糖果还包括基础原料、调味剂和助流剂。

17、所述基础原料包括抗性糊精、低聚果糖、甘草粉。

18、优选地，所述益生菌压片糖果由以下重量份的原料制成：

19、瑞士乳杆菌冻干菌粉40-50份、抗性糊精100-200份、低聚果糖150-250份、甘露糖醇200-400份、调味剂8-20份和助流剂2-6份。

20、优选地，所述益生菌益生菌压片糖果由以下重量份的原料制成：

21、瑞士乳杆菌包埋菌粉45份、抗性糊精220份、低聚果糖200份、甘露糖醇300份、调味剂16份和助流剂5份。

22、优选地，所述调味剂为水果粉或香精，所述助流剂为硬脂酸镁或二氧化硅。

23、优选地，所述瑞士乳杆菌包埋菌粉中含活菌数1-9.9×109个。

24、优选地，所述益生菌压片糖果中瑞士乳杆菌pljk-1372的含量为100亿cfu/g、200亿cfu/g、300亿cfu/g、500亿cfu/g或1000亿cfu/g。

25、本发明的另一目的在于提供一种富含高产γ-氨基丁酸益生菌的减压助眠压片糖果制备方法。所述方法为：

26、检查原料粉是否结块、吸湿等异常情况，确认原料的流动性和颗粒大小，将冻干菌粉和基础原料、调味剂、助流剂配料后混和搅拌，过筛网，再将所述总混物进行成型处理，得到所述益生菌糖果。

27、优选地，各原料的粒径不大于20目。

28、优选地，所述混和搅拌的时间为10-30min。

29、优选地，所述成型处理为压片处理。

30、优选地，压片时环境湿度为60％以下。

31、本发明提供的益生菌压片糖果包含瑞士乳杆菌(lactobacillus swiss)jylp-326冻干菌粉、基础原料、调味剂和助流剂。该益生菌压片糖果具有储藏周期长、便于携带、口味良好的优点，同时能够通过改善肠道微生态，维持肠道环境平衡，有效降低肠道不适引起的抑郁、烦躁的症状，避免应激反应，舒缓情绪；该益生菌压片糖果主要通过菌株定植肠道，生长分泌gaba和短链脂肪酸，利用脑-肠轴系统，调控人体睡眠机制的应答，从而使人心情放松，保持平静的精神状态，达到改善睡眠质量的目的。