一种耐盐对硝基苯酚矿化菌株及其构建方法和应用

本发明属于基因工程菌株构建，具体涉及一种耐盐对硝基苯酚矿化菌株及其构建方法和应用。

背景技术：

1、启动子已经成为代谢工程及合成生物学的重要工具，利用不同的启动子对代谢途径中关键基因的转录水平进行调节，优化关键酶的表达，能够提高微生物合成重要生物基化学品的能力。通过构建启动子文库的启动子工程已经成为获得和筛选启动子的重要手段。

2、越来越多微生物的全基因组及其在不同培养条件下的转录组得以完成测序。基于这些测序数据中包含有许多有价值的遗传元件和信息，比如：内源性启动子。微生物基因组可以被视为庞大的天然启动子储存文库，而转录组测序(rna-seq)数据可以作为从中进行内源启动子初步筛选的重要依据，提供一种可供选择的策略来进行不同类型的内源启动子的筛选，用于代谢途径的改造和优化。

3、但目前并没有一种基于启动子工程构建的能够高效修复pnp环境污染且对高盐极端环境胁迫有耐受能力的菌株。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种耐盐对硝基苯酚矿化菌株及其构建方法和应用。本发明所述耐盐对硝基苯酚矿化菌株不仅能够高效修复pnp环境污染，而且对高盐极端环境胁迫有很好的耐受能力。

2、本发明提供了一种耐盐对硝基苯酚矿化菌株，所述耐盐对硝基苯酚矿化菌株为基因组中upp基因缺失且插入强启动子和pnp矿化途径基因的渴望盐单胞菌(halomonascupida)j9菌株。

3、优选的是，所述强启动子包括p15或p8kt；所述p15的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述p8kt的核苷酸序列如seq id no.2所示。

4、优选的是，所述pnp矿化途径基因包括pnpa、pnpb、pnpc、pnpd、pnpe和pnpf基因。

5、优选的是，所述渴望盐单胞菌j9u菌株的基因组中还插入gfp基因。

6、本发明还提供了上述技术方案所述耐盐对硝基苯酚矿化菌株的构建方法，包括以下步骤：

7、将h.cupidaj9中完整的反向筛选标记基因upp进行敲除，获得h.cupidaj9u；

8、将h.cupidaj9中完整的反向筛选标记基因upp连接到pk18mobsacb上，得到pkju质粒载体；

9、利用所述pkju质粒载体，将强启动子与pnp矿化途径基因通过无痕基因编辑方法整合至h.cupidaj9u无痕基因编辑菌株的基因组中，获得耐盐对硝基苯酚矿化菌株。

10、优选的是，还包括利用所述pkju质粒载体，将gfp基因通过无痕基因编辑方法整合至h.cupidaj9u无痕基因编辑菌株的基因组中。

11、本发明还提供了一种耐盐对硝基苯酚矿化菌株j9u-p8ktpnp或j9u-p15pnp，所述耐盐对硝基苯酚矿化菌株j9u-p8ktpnp为基因组中upp基因缺失且插入强启动子p8kt和pnp矿化途径基因pnpa、pnpb、pnpc、pnpd、pnpe和pnpf以及插入启动子plac和gfp基因的渴望盐单胞菌j9菌株；

12、缺失的upp基因的核苷酸序列如seq id no.3所示；

13、插入强启动子p8kt和pnp矿化途径基因pnpa、pnpb、pnpc、pnpd、pnpe和pnpf以及插入启动子plac和gfp基因包括在基因组中插入p8kt-pnpab&plac-gfp、p8kt-pnpcd、p8kt-pnpe和p8kt-pnpf；所述p8kt-pnpab&plac-gfp的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述p8kt-pnpcd的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述p8kt-pnpe的核苷酸序列如seq id no.6所示，所述p8kt-pnpf的核苷酸序列如seq id no.7所示；

14、所述耐盐对硝基苯酚矿化菌株j9u-p15pnp为基因组中upp基因缺失且插入强启动子p15和pnp矿化途径基因pnpa、pnpb、pnpc、pnpd、pnpe和pnpf以及插入启动子plac和gfp基因的渴望盐单胞菌j9菌株；

15、缺失的upp基因的核苷酸序列如seq id no.3所示；

16、插入强启动子p15和pnp矿化途径基因pnpa、pnpb、pnpc、pnpd、pnpe和pnpf以及插入启动子plac和gfp基因包括在基因组中插入p15-pnpab&plac-gfp、p15-pnpcd、p15-pnpe和p15-pnpf；所述p15-pnpab&plac-gfp的核苷酸序列如seq id no.8所示，所述p15-pnpcd的核苷酸序列如seq id no.9所示，所述p15-pnpe的核苷酸序列如seq id no.10所示，所述p15-pnpf的核苷酸序列如seq id no.11所示。

17、本发明还提供了上述技术方案所述耐盐对硝基苯酚矿化菌株j9u-p8ktpnp或j9u-p15pnp的构建方法，所述耐盐对硝基苯酚矿化菌株j9u-p8ktpnp的构建方法包括以下步骤：

18、将h.cupidaj9中完整的反向筛选标记基因upp进行敲除，获得h.cupidaj9u；

19、将h.cupidaj9中完整的反向筛选标记基因upp连接到pk18mobsacb上，得到pkju质粒载体；

20、将p8kt-pnpab&plac-gfp、p8kt-pnpcd、p8kt-pnpe及p8kt-pnpf基因及各基因插入位点的上、下游同源臂分别与pkju质粒载体进行连接，获得基因插入载体，通过接合转化的方法将基因插入载体转化入h.cupidaj9u中，使用卡那霉素抗性筛选得到发生第一次单交换的重组子，重组子在含有5-fu培养基再次筛选得到经过第二次交换的目标基因插入菌株，最终获得耐盐对硝基苯酚矿化菌株，命名为j9u-p8ktpnp；

21、所述耐盐对硝基苯酚矿化菌株j9u-p15pnp的构建方法保护以下步骤：

22、将h.cupidaj9中完整的反向筛选标记基因upp进行敲除，获得h.cupidaj9u；

23、将h.cupidaj9中完整的反向筛选标记基因upp连接到pk18mobsacb上，得到pkju质粒载体；

24、将p15-pnpab&plac-gfp、p15-pnpcd、p15-pnpe及p15-pnpf基因及各基因插入位点的上、下游同源臂分别与pkju质粒载体进行连接，获得基因插入载体，通过接合转化的方法将基因插入载体转化入h.cupida j9u中，使用卡那霉素抗性筛选得到发生第一次单交换的重组子，重组子在含有5-fu培养基再次筛选得到经过第二次交换的目标基因插入菌株，最终获得耐盐对硝基苯酚矿化菌株，命名为j9u-p15pnp。

25、本发明还提供了上述技术方案所述耐盐对硝基苯酚矿化菌株或上述技术方案所述构建方法构建得到的耐盐对硝基苯酚矿化菌株或上述技术方案所述耐盐对硝基苯酚矿化菌株j9u-p8ktpnp或j9u-p15pnp或上述技术方案所述构建方法构建得到的耐盐对硝基苯酚矿化菌株j9u-p8ktpnp或j9u-p15pnp在制备高盐浓度下降解pnp的产品中的应用。

26、本发明还提供了强启动子p15或p8kt在构建耐盐对硝基苯酚矿化菌株中的应用；所述p15的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述p8kt的核苷酸序列如seq id no.2所示。

27、本发明提供了一种耐盐对硝基苯酚矿化菌株。本发明所述耐盐对硝基苯酚矿化菌株不仅能够高效修复pnp环境污染，而且对高盐极端环境胁迫有很好的耐受能力。本发明具体分别以p8kt和p15作为启动子，转入pnp矿化途径基因和gfp基因，构建得到工程菌株j9u-p8kt pnp和j9u-p15pnp，首次证明了以嗜盐菌h.cupida j9u作为底盘细菌，并结合合成生物学和启动子工程策略构建既耐盐又能高效矿化对硝基苯酚的工程菌。此外，工程菌株j9u-p8kt pnp和j9u-p15pnp中引入gfp蛋白为菌株在环境修复中的监测提供了可能。因此，gfp标记的工程菌株j9u-p8kt pnp和j9u-p15pnp释放到污染的环境中进行生物修复时，可以通过荧光对其进行追踪。