本发明涉及生物医学领域,具体涉及用于预测急性移植物抗宿主病发生风险的标志物及其应用,特别涉及一系列基因作为评估指标或标志物在临床预测异基因造血细胞移植后患者发生急性移植物抗宿主病的风险中的应用。
背景技术:
1、异基因造血细胞移植目前仍是恶性血液病有效乃至唯一的治愈手段。急性移植物抗宿主病(agvhd)是一种移植后常见并发症,能够累积一个或多个器官,主要包括皮肤、肠道以及肝脏。手掌背部皮肤斑丘疹往往为agvhd的先发征象,胃肠道累积通常于皮肤发病后数周内出现,也可在无皮肤及肝脏受累的情况下单独出现,起病常表现为恶心、呕吐和绿色水样便,严重者伴有剧烈腹痛、鲜血便。
2、agvhd是移植相关死亡的主要原因之一,其发生率高达40%至60%,死亡率接近15%。研究供者和受者遗传学改变对患者移植后发生agvhd的影响,有助于进一步揭示急性移植物抗宿主病的分子机制、增加预警指标和潜在干预靶点,对于提高造血细胞移植受者预后及生存质量具有至关重要的意义。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供与急性移植物抗宿主病发生相关的变异基因及其在预测造血细胞移植后患者发生急性移植物抗宿主病的风险及筛选造血细胞移植前供者中的应用。
2、为了实现上述目的,本发明首先提供了检测供者基因和/或受者基因是否发生突变的物质的新用途。
3、本发明提供了检测供者基因和/或受者基因是否发生突变的物质在制备预测或辅助预测造血细胞移植后患者发生急性移植物抗宿主病的风险的产品中的应用。
4、本发明又提供了检测供者基因和/或受者基因是否发生突变的物质在预测或辅助预测造血细胞移植后患者发生急性移植物抗宿主病的风险中的应用。
5、本发明还提供了检测供者基因和/或受者基因是否发生突变的物质在制备诊断或辅助诊断造血细胞移植后患者是否发生急性移植物抗宿主病的产品中的应用。
6、本发明还提供了检测供者基因和/或受者基因是否发生突变的物质在诊断或辅助诊断造血细胞移植后患者是否发生急性移植物抗宿主病中的应用。
7、本发明还提供了检测供者基因和/或受者基因是否发生突变的物质在制备筛选或辅助筛选造血细胞移植前供者的产品中的应用。
8、本发明还提供了检测供者基因和/或受者基因是否发生突变的物质在筛选或辅助筛选造血细胞移植前供者中的应用。
9、本发明还提供了检测供者基因和/或受者基因是否发生突变的物质在制备造血细胞移植前供者和受者之间的配对(对造血细胞移植前供者和受者进行匹配)的产品中的应用。
10、本发明还提供了检测供者基因和/或受者基因是否发生突变的物质在造血细胞移植前供者和受者之间的配对(对造血细胞移植前供者和受者进行匹配)中的应用。
11、为了实现上述目的,本发明又提供了一种具有如下a1)-a4)任一种功能的试剂盒:
12、a1)预测或辅助预测造血细胞移植后患者发生急性移植物抗宿主病的风险;
13、a2)诊断或辅助诊断造血细胞移植后患者是否发生急性移植物抗宿主病;
14、a3)筛选或辅助筛选造血细胞移植前供者;
15、a4)造血细胞移植前供者和受者之间的配对(对造血细胞移植前供者和受者进行匹配);
16、所述试剂盒包括检测供者基因和/或受者基因是否发生突变的物质。
17、以上任一所述应用或试剂盒中,所述供者基因为供者中的eif3c基因和/或efcab5基因和/或card8基因和/或krt24基因;所述受者基因为受者中的magec1基因和/或spata31c1基因。
18、进一步的,所述供者基因为供者外周血中的eif3c基因和/或efcab5基因和/或card8基因和/或krt24基因;所述受者基因为受者外周血中的magec1基因和/或spata31c1基因。
19、以上任一所述应用或试剂盒中,所述检测供者基因和/或受者基因是否发生突变的物质可为检测供者基因和/或受者基因是否发生突变的试剂和/或仪器。
20、进一步的,所述试剂和/或仪器包括但不限于提取人体外周血细胞基因组dna的试剂,采用现有技术中的各种常规方法(如dna测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、等位基因特异性的寡核苷酸杂交等等)检测外周血中eif3c基因、efcab5基因、card8基因、krt24基因、magec1基因和/或spata31c1基因是否发生突变所需的试剂和/或仪器。
21、更进一步的,利用dna测序(如高通量测序或一代测序等等)检测外周血中eif3c基因、efcab5基因、card8基因、krt24基因、magec1基因和/或spata31c1基因是否发生突变所需的试剂和/或仪器包括测序中所用的各种引物、探针和测序仪。
22、在本发明的一个具体实施例中,所述dna测序的方法具体可包括如下步骤:
23、1、抽取造血细胞移植前供者、受者静脉血,并抽提基因组dna;
24、2、使用酶切方法将200ng基因组dna随机片段化为150-200bp平均长度,经末端修复补平并在3’末端加a碱基形成粘性末端,然后与含有特异性barcode序列的接头连接,再用磁珠筛选去除连接不完整的产物以及接头自连产物,最后利用与接头序列互补的通用引物进行pcr扩增,形成测序文库;
25、3、使用discovery pool探针在杂交缓冲液中进行杂交,然后使用磁珠捕获杂交的目的片段并分离纯化,再pcr扩增捕获的dna片段并进行捕获文库的质检(包括qubit浓度测定和2100bioanalyzer片段长度测定),最后在novaseq6000测序仪上,按照illumina的标准流程进行pe150高通量测序;
26、4、使用测序图谱进行基因型分析。
27、以上任一所述试剂盒还包括数据处理装置,所述数据处理装置内设模块,所述模块具有如下功能:根据供者外周血中eif3c基因、efcab5基因、card8基因和/或krt24基因是否发生突变和/或受者外周血中magec1基因和/或spata31c1基因是否发生突变预测造血细胞移植后患者发生急性移植物抗宿主病的风险或诊断造血细胞移植后患者是否发生急性移植物抗宿主病或筛选造血细胞移植前供者。
28、具体的,
29、根据供者外周血中eif3c基因是否发生突变预测造血细胞移植后患者发生急性移植物抗宿主病的风险的方法为供者外周血中eif3c基因发生突变的造血细胞移植后患者发生急性移植物抗宿主病的风险高于供者外周血中eif3c基因未发生突变的造血细胞移植后患者。
30、根据供者外周血中eif3c基因是否发生突变诊断造血细胞移植后患者是否发生急性移植物抗宿主病的方法为若供者外周血中eif3c基因发生突变,则造血细胞移植后患者发生或候选发生急性移植物抗宿主病;若供者外周血中eif3c基因未发生突变,则造血细胞移植后患者不发生或候选不发生急性移植物抗宿主病。
31、根据供者外周血中efcab5基因是否发生突变预测造血细胞移植后患者发生急性移植物抗宿主病的风险的方法为供者外周血中efcab5基因发生突变的造血细胞移植后患者发生急性移植物抗宿主病的风险低于供者外周血中efcab5基因未发生突变的造血细胞移植后患者。
32、根据供者外周血中efcab5基因是否发生突变诊断造血细胞移植后患者是否发生急性移植物抗宿主病的方法为若供者外周血中efcab5基因发生突变,则造血细胞移植后患者不发生或候选不发生急性移植物抗宿主病;若供者外周血中efcab5基因未发生突变,则造血细胞移植后患者发生或候选发生急性移植物抗宿主病。
33、根据供者外周血中card8基因是否发生突变预测造血细胞移植后患者发生急性移植物抗宿主病的风险的方法为供者外周血中card8基因发生突变的造血细胞移植后患者发生急性移植物抗宿主病的风险低于供者外周血中card8基因未发生突变的造血细胞移植后患者。
34、根据供者外周血中card8基因是否发生突变诊断造血细胞移植后患者是否发生急性移植物抗宿主病的方法为若供者外周血中card8基因发生突变,则造血细胞移植后患者不发生或候选不发生急性移植物抗宿主病;若供者外周血中card8基因未发生突变,则造血细胞移植后患者发生或候选发生急性移植物抗宿主病。
35、根据供者外周血中krt24基因是否发生突变预测造血细胞移植后患者发生急性移植物抗宿主病的风险的方法为供者外周血中krt24基因发生突变的造血细胞移植后患者发生急性移植物抗宿主病的风险高于供者外周血中krt24基因未发生突变的造血细胞移植后患者。
36、根据供者外周血中krt24基因是否发生突变诊断造血细胞移植后患者是否发生急性移植物抗宿主病的方法为若供者外周血中krt24基因发生突变,则造血细胞移植后患者发生或候选发生急性移植物抗宿主病;若供者外周血中krt24基因未发生突变,则造血细胞移植后患者不发生或候选不发生急性移植物抗宿主病。
37、根据受者外周血中magec1基因是否发生突变预测造血细胞移植后患者发生急性移植物抗宿主病的风险的方法为受者外周血中magec1基因发生突变的造血细胞移植后患者发生急性移植物抗宿主病的风险低于受者外周血中magec1基因未发生突变的造血细胞移植后患者。
38、根据受者外周血中magec1基因是否发生突变诊断造血细胞移植后患者是否发生急性移植物抗宿主病的方法为若受者外周血中magec1基因发生突变,则造血细胞移植后患者不发生或候选不发生急性移植物抗宿主病;若受者外周血中magec1基因未发生突变,则造血细胞移植后患者发生或候选发生急性移植物抗宿主病。
39、根据受者外周血中spata31c1基因是否发生突变预测造血细胞移植后患者发生急性移植物抗宿主病的风险的方法为受者外周血中spata31c1基因发生突变的造血细胞移植后患者发生急性移植物抗宿主病的风险低于受者外周血中spata31c1基因未发生突变的造血细胞移植后患者。
40、根据受者外周血中spata31c1基因是否发生突变诊断造血细胞移植后患者是否发生急性移植物抗宿主病的方法为若受者外周血中spata31c1基因发生突变,则造血细胞移植后患者不发生或候选不发生急性移植物抗宿主病;若受者外周血中spata31c1基因未发生突变,则造血细胞移植后患者发生或候选发生急性移植物抗宿主病。
41、在实际应用中,可以选择六个基因中的任意一个或任意两个或任意三个或任意四个或任意五个基因进行预测或诊断,也可选择全部六个基因共同进行预测或诊断。当采用多个基因共同进行预测或诊断时,需要满足每个基因均符合各自的判定标准进行预测或诊断,否则该预测或诊断方法无效。如采用eif3c基因和efcab5基因共同进行预测或诊断时,若供者外周血中的eif3c基因发生突变且efcab5基因未发生突变,则造血细胞移植后患者发生或候选发生急性移植物抗宿主病,若供者外周血中的eif3c基因发生突变且efcab5基因发生突变,则该预测方法无效。
42、采用全部六个基因共同进行预测或诊断时,除了可通过检测供者和受者中六个基因突变情况进行预测或诊断外,还可以按照如下方法进行预测或诊断:
43、先根据供者外周血中eif3c基因、efcab5基因、card8基因和krt24基因突变情况和受者外周血中magec1基因和spata31c1基因突变情况,得到基因突变合计数,然后根据基因突变合计数和阈值预测造血细胞移植后患者发生急性移植物抗宿主病的风险或诊断造血细胞移植后患者是否发生急性移植物抗宿主病。
44、所述基因突变合计数的获得方法如下:若供者外周血中eif3c基因、efcab5基因、card8基因或krt24基因发生突变或受者外周血中magec1基因或spata31c1基因发生突变记为1,累计六个基因发生突变分数,即得到基因突变合计数。
45、所述根据基因突变合计数和阈值预测造血细胞移植后患者发生急性移植物抗宿主病的风险的方法如下:基因突变合计数大于或等于阈值的造血细胞移植后患者发生急性移植物抗宿主病的风险高于基因突变合计数小于阈值的造血细胞移植后患者。
46、所述根据基因突变合计数和阈值诊断造血细胞移植后患者是否发生急性移植物抗宿主病的方法如下:若基因突变合计数大于或等于阈值,则造血细胞移植后患者发生或候选发生急性移植物抗宿主病;若基因突变合计数小于阈值,则造血细胞移植后患者不发生或候选不发生急性移植物抗宿主病。
47、所述阈值具体可为1.5。
48、在实际应用中,可先根据上述方法预测造血细胞移植后发生急性移植物抗宿主病的风险,然后再根据急性移植物抗宿主病发生风险的高低筛选造血细胞移植前供者,或结合其它临床指标辅助筛选造血细胞移植前供者,以优化造血细胞移植前供者的选择,提高造血细胞移植前患者的生存率及生存质量。
49、以上任一所述基因发生突变包括任何可改变该基因所编码蛋白氨基酸序列的碱基突变,所述碱基突变的形式包括碱基插入、碱基缺失、碱基替换等,所述碱基突变的个数包括1个或2个或多个碱基突变。
50、具体的,
51、所述eif3c基因突变包括如下突变中的至少一种:chr16-28727173位点突变导致的基因片段缺失;chr16-28388130位点突变导致的基因片段缺失;chr16-28723250位点突变导致的基因错义突变;chr16-28392031位点突变导致的基因移码插入;chr16-28392043位点突变导致的基因移码插入;chr16-28391825位点突变导致的基因片段缺失;chr16-28392046位点突变导致的基因错义突变;chr16-28392056位点突变导致的基因错义突变;chr16-28392020位点突变导致的基因错义突变;chr16-28723313位点突变导致的基因错义突变;chr16-28392043位点突变导致的基因移码插入;chr16-28392025位点突变导致的基因移码缺失。
52、所述efcab5发生基因突变包括如下突变中的至少一种:chr17-29993230位点突变导致的基因错义突变;chr17-29969309位点突变导致的基因错义突变;chr17-29993284位点突变导致的基因片段缺失;chr17-29969251位点突变导致的基因片段缺失;chr17-29993230位点突变导致的基因错义突变;chr17-29969309位点突变导致的基因错义突变;chr17-30078487位点突变导致的基因错义突变;chr17-30051184位点突变导致的基因错义突变;chr17-30051119位点突变导致的基因错义突变;chr17-30057709位点突变导致的基因错义突变;chr17-30090638位点突变导致的基因错义突变;chr17-30092059位点位点突变导致的基因错义突变;chr17-30090516位点突变导致的基因错义突变;chr17-30078356位点突变导致的基因错义突变。
53、所述card8基因突变包括如下突变中的至少一种:chr19-48234449位点突变导致的基因片段缺失;chr19-48230957位点突变导致的基因错义突变;chr19-48234507位点突变导致的基因错义突变;chr19-48231760位点突变导致的基因移码缺失。
54、所述krt24基因突变包括如下突变中的至少一种:chr17-40699466位点突变导致的基因错义突变;chr17-40699520位点突变导致的基因错义突变;chr17-40701194位点突变导致的基因错义突变;chr17-40703444位点突变导致的基因错义突变;chr17-40701882位点突变导致的基因移码缺失。
55、所述magec1基因突变包括如下突变中的至少一种:chrx-141906385位点突变导致的基因错义突变;chrx-141906494位点位点突变导致的基因错义突变;chrx-141905856位点突变导致的基因错义突变;chrx-141905478位点突变导致的基因错义突变;chrx-141907529位点突变导致的基因错义突变;chrx-141906126位点位点突变导致的基因错义突变;chrx-141906066位点突变导致的基因错义突变;chrx-141905959位点突变导致的基因错义突变;chrx-141905478位点突变导致的基因错义突变;chrx-141906056位点突变导致的基因移码插入。
56、所述spata31c1基因突变包括如下突变中的至少一种:chr9-87923373位点突变导致的基因片段缺失;chr9-87919291位点突变导致的基因错义突变;chr9-87919297位点突变导致的基因错义突变;chr9-87922513位点突变导致的基因错义突变;chr9-87922941位点突变导致的基因错义突变;chr9-87922977位点突变导致的基因错义突变;chr9-87919289位点突变导致的基因移码插入;chr9-87919291位点突变导致的基因移码插入;chr9-87919275位点突变导致的基因移码缺失;chr9-87919290位点突变导致的基因移码缺失。
57、以上任一所述基因未发生突变包括没有发生碱基突变(与该基因的野生型序列完全相同)或任何没有改变该基因所编码蛋白氨基酸序列的碱基突变。
58、以上任一所述应用或试剂盒中,所述供者为进行造血细胞移植前提供造血细胞的健康个体,所述受者为进行造血细胞移植前患者。
59、以上任一所述应用或试剂盒中,所述造血细胞移植为异基因造血细胞移植。
60、所述异基因造血细胞移植为hla单倍型相合异基因造血细胞移植。
61、所述造血细胞移植前患者可为急性髓系白血病患者、急性淋系白血病患者、慢性髓系白血病患者、慢性淋系白血病患者、多发性骨髓瘤患者、骨髓增生异常综合征患者或原发性系统性淀粉样变性患者。
62、eif3c基因和/或efcab5基因和/或card8基因和/或krt24基因和/或magec1基因和/或spata31c1基因作为靶点在制备预防和/或治疗急性移植物抗宿主病的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
63、以上任一所述eif3c基因在ncbi中的id为8663。
64、以上任一所述efcab5基因在ncbi中的id为37476。
65、以上任一所述card8基因在ncbi中的id为22900。
66、以上任一所述krt24基因在ncbi中的id为192666。
67、以上任一所述magec1基因在ncbi中的id为9947。
68、以上任一所述spata31c1基因在ncbi中的id为441452。
69、本发明通过全基因组测序筛选出了与移植后agvhd发生相关的致病突变基因eif3c、efcab5、card8、krt24、magec1、spata31c1,一方面,可根据供者或受者外周血中致病突变基因是否发生突变预测移植后患者发生急性移植物抗宿主病的风险,为潜在的agvhd诊断提供依据。另一方面,本发明为agvhd的发病提供新的可能机制,为寻找治疗agvhd提供可能的药物靶点。